專利名稱：用于具有美容功能的細(xì)胞的遺傳修飾以提高美容外觀的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于細(xì)胞的美容的遺傳修飾的具有美容功能的組合物和方法。還提供了使用多種動物模型，用于測定是否皮膚蛋白和其他生物分子(如膠原、彈性蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、蛋白多糖、生長因子等)的表達(dá)和/或水平對皮膚有美容的回復(fù)青春作用，并用于評估具有美容功能的基本上完整細(xì)胞的美容基因修飾的組合物和方法。
背景技術(shù)：
皮膚蛋白質(zhì)的水平和/或表達(dá)，以及其他生物分子(如膠原，彈性蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，蛋白多糖，生長因子，內(nèi)源性抗氧化酶，DNA修復(fù)酶等)會隨著年齡增長顯著衰退， 造成外觀上非期望的改變。例如，纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞對生長因子的刺激應(yīng)答能力會隨著年齡下降。相反的，某些蛋白質(zhì)會增加，對皮膚和其他具有美容功效的細(xì)胞帶來不可預(yù)計的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP-I)在皮膚細(xì)胞中的含量會增加；可是當(dāng)MMP-I加速膠原酶分解后，MMP-I的增加對皮膚是有害的。與年齡相關(guān)的變化包括皮膚的松弛，稀疏，起皺。個別指定的組合物用以改善皮膚外觀，但一般說來，這種組合物需要頻繁和大量的使用(全年中每天一次或兩次)。另外，侵入式治療(如整形外科手術(shù)，激光換膚，注射治療)可能會有助于減少皮膚下垂和起皺。盡管如此，許多人并不愿意接受非治療用(即外形美觀)的外科手術(shù)。因此，有必要使化妝品的組合物和方法提供一個比普通的護膚霜更永久的解決方法，但又不需要任何外科手術(shù)或侵入式的干預(yù)。基因治療可以為促進(jìn)，治療和維護有美容功效的細(xì)胞提供有針對性的方法。例如， 某些基因與皮膚組織的維護及修繕有關(guān)。許多生長因子，如表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，胰島素樣生長因子(IGF-I)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和PDGF可能參與傷口愈合(見例如，Grazul-Bilska 等，Druags of Today, 2003, 39 :787-800 ；S. Werner 禾口 R. Grose ;Physiol. Rev.，83 835-870，200 。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，胰島素樣生長因子(IGF-I)，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細(xì)胞介素(IL_8，IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGB-β)和基質(zhì)蛋白的混合物可以被用來改善傷口愈合(綜述于 Jimenez 和 Jimenez, Am. J. Surgery, 2004,187 :56S_64S)。此外，胰島素樣生長因子(IGF-I)可能被用來增加肌肉肥大(Barton-Davis等，Acta Physiol. Scand.，1999， 167 :301-305)。因此，通過分子靶向涉及美容功效的細(xì)胞的基因組改進(jìn)特定蛋白的產(chǎn)生和功能，可以提供一種改進(jìn)這種細(xì)胞的壽命和健康的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的某些實施方案解決這些與老化和其他不想要的改變有關(guān)的問題，所述不想要的改變可發(fā)生于皮膚和其他具有美容功能的細(xì)胞中。本發(fā)明的某些實施方案提供了用于具有美容功能的細(xì)胞的美容基因修飾的方法，以及用于提供具有美容功能的細(xì)胞的美容外觀的組合物。本發(fā)明的其他實施方案提供了使用多種動物模型，用于測定是否皮膚蛋白和其他生物分子(如膠原、彈性蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、蛋白多糖、生長因子等)的表達(dá)和/或水平對皮膚有美容的回復(fù)青春作用，并用于評估具有美容功能的基本上完整細(xì)胞的美容基因修飾的組合物和方法。如此處所公開，本發(fā)明的方法和組合物的實施方案可包含編碼為核算和/或多肽的多核苷酸的構(gòu)建，所述核酸和/或多肽可發(fā)揮作用以改善和/或保持此類細(xì)胞的外觀?；蛘呋虼送?，也可使用包含孤立的多肽或其生物學(xué)活性的衍生物的組合物。因此，本發(fā)明主要致力于皮膚和具有美容功效細(xì)胞的外觀退化問題，以及對這種細(xì)胞的基因修飾提供組合物和方法。同時本發(fā)明可以以各種方式體現(xiàn)。在一個實施方案中，對于具有美容功效的完整細(xì)胞的大幅基因修飾，當(dāng)前的發(fā)明提供了一些組合物和方法。其中主要包括對至少可以編碼一種核苷酸的多聚核苷酸進(jìn)行調(diào)控，或是對美容功效細(xì)胞有維持作用的多肽在這種細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。他們所具有的提高和/或維持一個生化和/或生理過程的美容功效，對外觀具有積極作用。其中一個實施例中，某種多肽由角質(zhì)細(xì)胞生長因子或一種生物活性衍生物組成。例如，在某些實施例的多聚核苷酸中，包含了序列ID號為M的核苷酸446到1030，或者是一段至少有70%，75%， 80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，或99 %和該段核苷酸相似的序列?；蛘呤蔷哂行蛄蠭D號為23的一種編碼蛋白的多聚核苷酸，亦或是和該段序列70^,75^,80^,85%, 90%，95%，96%，97%，98%，99% 相似的序列。在另一個實施方案中，當(dāng)前的發(fā)明包含了在個體中，對具有美容功效的完整細(xì)胞大幅基因修飾的組合物。該組合物包括至少可以編碼一種核苷酸的孤立多聚核苷酸，或是可以維持細(xì)胞美容功效的多肽?；蛘?，該組合物包括了維持細(xì)胞美容功效的多肽。其中一個實施例中，某種多肽由角質(zhì)細(xì)胞生長因子或一種生物活性衍生物組成。例如，在某些實施的多聚核苷酸中，包含了序列ID號為M的核苷酸446到1030，或者是一段序列至少70%， 75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%和該段核苷酸相似。或者是具有序列 ID號為23的一種編碼蛋白的多聚核苷酸，亦或是和該段序列70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%，96%，97%，98%，99% 相似的序列。該組分可能進(jìn)一步包含某種載體，這種載體可以調(diào)控至少一種具有美容功效宿主細(xì)胞中的多聚核苷酸或多肽。在一個實施方案中，確定主體后，該組分使核酸和多肽在具有美容功效的細(xì)胞中表達(dá)，他們所具有的提高和/或維持一個生化和/或生理過程的功效，對美容外觀具有積極作用。在某些實施例中，本發(fā)明的方法和組合物可能會導(dǎo)致多個蛋白的表達(dá)。他們所具有的提高和/或維持一個生化和/或生理過程的功效，對美容外觀具有積極作用。例如，和外觀有關(guān)的初級蛋白或氨基酸的表達(dá)(例如，將可以表達(dá)角質(zhì)細(xì)胞生長因子的多聚核苷酸或其他多肽應(yīng)用于細(xì)胞)可以引發(fā)次級蛋白質(zhì)或多肽的內(nèi)源性表達(dá)(如膠原或其他多肽)。 他們所具有的提高和/或維持一個生化和/或生理過程的功效，對美容外觀具有積極作用。因此，本發(fā)明的實施例中包括對具有美容功效細(xì)胞的基因修飾的方法和組合物， 在某些實施例中，本發(fā)明還包含對具有美容功效的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染重組構(gòu)建的方法。而在另外一些實施例中，通過將這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射入皮膚或其他美容相關(guān)的細(xì)胞中，可以在CN 102471769 A說明書3/71 頁
體外進(jìn)行相同的構(gòu)建。而在其他一些實施例中，多肽也可被用于本發(fā)明中。對構(gòu)建編碼的眾多生物分子進(jìn)行重組，可用來增強美容功效細(xì)胞的蛋白質(zhì)和其他生物大分子的表達(dá)。在某一實施例中，組分可能包括一種多肽，或是構(gòu)造包括編碼多肽或其他生物分子的重組DNA分子，他們在具有美容功效的細(xì)胞中，可以修飾基因的活性。例如， 在備用實施例中，多聚核苷酸可以編碼膠原多肽，彈性蛋白多肽，TIMP-I多肽，超氧化物歧化酶多肽，和/或角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)多肽。或者，重組構(gòu)建可以編碼調(diào)節(jié)核酸分子，如反義寡核苷酸，或RNA抑制子(RNAi)， 核酶，三重螺旋形成寡核苷酸(TFOs)或肽核酸(PNA)，它們能在具有美容功效的細(xì)胞內(nèi)影響基因，例如通過下調(diào)表達(dá)膠原和彈性蛋白的降解酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶，膠原酶，明膠酶，彈性蛋白酶，質(zhì)溶解素，絲氨酸蛋白酶和/或膜型基質(zhì)金屬蛋白酶)。例如，通過抑制膠原1的表達(dá)，來對抗富含半胱氨酸61(CYR61/CCN1)；以及通過加快膠原和彈性蛋白的分解， 使基質(zhì)金屬蛋白酶抑制，它們都可用于反義技術(shù)。在交替的實施例中，多聚核苷酸構(gòu)造可以編碼一種生長因子，以提高美容的外觀。 例如，多聚核苷酸構(gòu)造可以編碼角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)。在其他實施例中，多聚核苷酸構(gòu)造可能編碼胰島素樣生長因子I(IGF-I)，血小板衍生生長因子(PDGF)，肝細(xì)胞生長因子 (HGF)，和/或轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)。本發(fā)明的方法和組合物，可能會產(chǎn)生無需侵入式外科手術(shù)就可達(dá)到的“基因臉和/或纖體效果”，這種基因修飾可能會恢復(fù)或增強有關(guān)于改善美觀的生理和/或生化過程(如促進(jìn)膠原，彈性蛋白或超氧化物岐化酶的產(chǎn)生)，或減少皮膚細(xì)胞的進(jìn)程，產(chǎn)生負(fù)的美觀效果(如通過增加抑制劑的表達(dá)，從而增加對膠原酶的抑制)。其他的實施例，以及任何和本發(fā)明相關(guān)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)將在如下的敘述和申明中提出。需要說明的是，本發(fā)明不僅僅是運用于如下所述的細(xì)節(jié)中，更可以在其他的實施例中，通過各種各樣的方式被實施和貫徹。附圖簡述

圖1A-1C描述如下原膠原DNA序列(COLlAl)(序列ID號1)(圖IA和1Β)；蛋白質(zhì)(序列ID號2)(圖.1C)；以及將原膠原cDNA亞克隆入Pcdna3. 1 zeo載體的引物 (圖.1C)；亞克隆引物的5'端(序列ID號⑶包含一個Nhe I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個Kozak序列(下劃線粗體)，亞克隆引物的3'端(序列ID號4)包含一個Hind III限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個開放的閱讀框(ORF)停止序列(下劃線粗體)，這與本發(fā)明的實施例相一致；cds即編碼序列。圖2A-2B描述如下彈性蛋白DNA序列(序列ID號5)(圖2A)；蛋白質(zhì)(序列ID 號6)(圖.2B)；以及將彈性蛋白cDNA亞克隆入PCdna3. 1 zeo載體的引物(圖.2B)；亞克隆引物的5'端(序列ID號7)包含一個Nhe I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個 Kozak序列(粗體)，亞克隆引物的3'端(序列ID號妁包含一個Bgl II限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個開放的閱讀框(ORF)停止序列(下劃線粗體)，這與本發(fā)明的實施例相一致。圖3A-3B描述如下超氧化物歧化酶3 (S0D3)DNA序列(序列ID號9)(圖3A)； 蛋白質(zhì)(序列ID號10)(圖.;3B)；以及將S0D3 cDNA亞克隆入PCdna3· 1 zeo載體的引物 (圖.3B)；亞克隆引物的5'端(序列ID號11)包含一個Nhe I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個Kozak序列(下劃線粗體)，亞克隆引物的3'端(序列ID號12)包含一個 Hind III限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個開放的閱讀框(ORF)停止序列(下劃線粗體)， 這與本發(fā)明的實施例相一致。圖4描述如下TIMP-1DNA序列(序列ID號13)；蛋白質(zhì)(序列ID號14)以及將TIMP-lcDNA亞克隆入Pcdna3. 1 zeo載體的引物；亞克隆引物的5'端(序列ID號15) 包含一個Nhe I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個Kozak序列(下劃線粗體)，亞克隆弓丨物的3'端(序列ID號16)包含一個Hind III限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個開放的閱讀框(ORF)停止序列(下劃線粗體)，這與本發(fā)明的實施例相一致。圖5A-5C描述如下C0L1A2 DNA序列(序列ID號17)(圖· A和B)；蛋白質(zhì)(序列ID號18)(圖.B)；以及將C0L1A2 cDNA亞克隆入Pcdna3. 1 zeo載體的引物(圖.C)； 亞克隆引物的5'端(序列ID號19)包含一個Nhe I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個Kozak序列(下劃線粗體)，亞克隆引物的3'端(序列ID號20)包含一個Hind III限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)和一個開放的閱讀框(ORF)停止序列(下劃線粗體)，這與本發(fā)明的實施例相一致；圖6描述了一個例子，即按照本發(fā)明的實施例，處理具有美容功效細(xì)胞的方法。圖7描述了按照本發(fā)明的實施例，重組DNA分子的例子。圖8描述了按照本發(fā)明交替的實施例，如何運用CMV啟動子驅(qū)動的真核載體 pcDNA3. 1+zeo :intA，使人體蛋白C0LA1A，C0L1A2，彈性蛋白，和TIMP-I在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的克隆策略。圖9描述了按照本發(fā)明交替的實施例，使用PCR對來自于正常人體組織C0LA1A， C0L1A2，TIMP-I，以及彈性蛋白的cDNAs進(jìn)行擴增。圖10描述了按照本發(fā)明的實施例，對ΗΕΚ493Τ/17細(xì)胞內(nèi)的人體C0L1A2進(jìn)行瞬時表達(dá)分析。分子量138. 9KDa的C0L1A2蛋白如箭頭所示。圖11描述了按照本發(fā)明的實施例，對ΗΕΚ493Τ/17細(xì)胞內(nèi)的人體TIMP-I進(jìn)行瞬時表達(dá)分析。分子量23. 2KDa的TIMP-I蛋白如箭頭所示。圖12描述了按照本發(fā)明的實施例，對ΗΕΚ493Τ/17細(xì)胞內(nèi)的人體彈性蛋白進(jìn)行瞬時表達(dá)分析。分子量66. IKDa的彈性蛋白如箭頭所示。圖13描述了按照本發(fā)明交替的實施例，如何運用CMV啟動子驅(qū)動的真核載體 pcDNA3. 1+zeo :intA，使人體蛋白KGF-I在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的克隆策略。圖14描述了按照本發(fā)明交替的實施例，使用PCR對來自于正常人體肺組織的 KGF-I的cDNAs進(jìn)行擴增。感興趣的擴增基因序列如箭頭所示，并指出了相應(yīng)的大小。KBL， 堿基梯；kbp，堿基對。圖15A-15B描述了按照本發(fā)明的實施例，在中期的PCR-T0P0載體中克隆人體 KGF-I的cDNA(0. 58kb嵌入)(圖.15A)以及隨后在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)pcDNA3. 1+zeo intA(圖· 15B)載體的克隆。KGF-1基因是由Nhel和Hind III從pCR-TOPO中切割而來，在具有相同限制性內(nèi)切酶的pcDNA3. 1+zeo :intA中被定向克隆，感興趣的擴增基因序列如箭頭所示，并指出了相應(yīng)的大小。如圖.15B所示是5個獨立的亞克隆(1-5)，其中泳道1和 2是未切割的，以及Nhel和HincKR為克隆會消化小量的DNAs，他們是克隆1 (分別是泳道 1和2)，克隆2 (泳道3和4)，克隆3 (泳道5和6)，克隆4 (泳道7和8)，克隆5 (泳道9和10)，分子大小標(biāo)記的堿基梯(泳道11)以及一個100堿基對的堿基梯(泳道12) ；ΙΛρ，堿基對。圖16Α-16Β描述了按照本發(fā)明的實施例，KGF-I的氨基酸序列(圖16. Α)和核苷酸序歹丨J (又名 FGF-7 或 KGF-1/FGF-7)(圖 16. B)。圖.17描述了對人體細(xì)胞提取物中的KGF-I (a)，COLAlA(b)和C0LlA2(c)蛋白， 以及運用pcDNA3. 1+ :intA/KGF-I轉(zhuǎn)染HEK193T/17細(xì)胞的上清液，單獨載體(pcDNA3. 1+ intA)，或非DNA調(diào)控進(jìn)行瞬時表達(dá)的分析。KGF-I蛋白如黑箭頭所示，M是標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物，KDa即道爾頓。發(fā)明詳述盡管本發(fā)明中，數(shù)值和參數(shù)設(shè)定的廣泛范圍都是近似值，但是在具體的實施例中所列的數(shù)值是盡可能準(zhǔn)確的。然而，在本質(zhì)上包含任何錯誤的數(shù)值，必然在各自的測試測量中導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)偏差。此外，此處披露的所有范圍，應(yīng)理解為包括該量程中任何的及所有的子域。例如，一個“1至10”的規(guī)定范圍，應(yīng)視為包括任何以及所有最小值是1，最大值是10的子域。即所有以最小值1開頭的子域，如1至6. 1，以及以最大值10結(jié)尾的子域，如5. 5至 10。此外，任何被稱為“納入本發(fā)明”的參考，都將被認(rèn)為是納入其整體之中。此處進(jìn)一步指出，在本發(fā)明中，單數(shù)形式的“a” “an”和“the”除非是明確和毫不含糊的指出包含復(fù)數(shù)參照物，否則都只限定是單數(shù)。術(shù)語“或” “和/或”可以交替使用，除非文意明確指出另有其他。此外，此處使用的主體是哺乳動物需要的，用以維持或改善任何具有美容功效細(xì)胞狀態(tài)的治療。這些主體可以是動物(如有某種皮膚狀況的動物)，也可以是人。主體可能是人，如絕經(jīng)的婦女，或是一個非人的哺乳動物，如需要治療皮膚，指甲，頭發(fā)或皮毛的寵物。此處使用的具有美容功效的細(xì)胞包括皮膚，脂肪，肌肉，結(jié)締組織，以及在表皮， 真皮和皮下組織層的神經(jīng)細(xì)胞；還包括指甲根部的甲床，指甲基質(zhì)和指甲板細(xì)胞；頭皮，頭發(fā)毛囊和頭發(fā)細(xì)胞；以及皮下脂肪層和舌頭下的肌肉細(xì)胞；牙齒和牙齦細(xì)胞；骨骼細(xì)胞，包括面部骨骼；眼睛中的細(xì)胞(包括虹膜和覆蓋虹膜的基質(zhì))。本發(fā)明中所使用的“表皮組織”包括外胚層的衍生組織。外胚層是后生動物胚胎的最外層，而后發(fā)展成表皮和神經(jīng)組織。這其中表皮組織包括皮膚，指甲和頭發(fā)。本發(fā)明中所使用的“皮膚”是指表皮和真皮。皮膚的最外層表皮是由具有底層基底膜的復(fù)層鱗狀上皮組成。皮膚表層不含任何的血管，通過真皮擴散獲取養(yǎng)分。組成表皮的主要細(xì)胞形式是角質(zhì)細(xì)胞。另外也有黑色素細(xì)胞和朗氏細(xì)胞。另外，表皮可以進(jìn)一步從外到內(nèi)細(xì)分為幾個層角質(zhì)層，透明層，顆粒層，棘層和基底。真皮位于表皮下部，包括血管， 神經(jīng)，毛囊，平滑肌，腺體和淋巴組織。此外，成纖維細(xì)胞通常也存在于真皮層，分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，富含膠原，彈性蛋白，透明質(zhì)酸等大分子物質(zhì)。下皮層存在于真皮層的下部，包含充滿脂肪的脂肪細(xì)胞以及較大的血管和神經(jīng)細(xì)胞。肌肉位于皮下脂肪下面。皮膚結(jié)構(gòu)是通過肌肉的結(jié)締組織附著在一起的。結(jié)締組織像錨一樣，使皮膚，脂肪和肌肉與骨組織很好的連接在一起。而在下皮層的附屬區(qū)，過多的脂肪會造成“橘皮”狀的紋狀外觀。本發(fā)明中使用的，“基本上完整的細(xì)胞”包括沒有因外傷造成的撕裂，切割和刺破的細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞可能已接受過激光治療，化學(xué)去皮，祛疤或其他增加美觀的治療。除非另有界定，否則此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有相同的含義，即該技術(shù)領(lǐng)域中公知的一種普通技能。參與者應(yīng)該詳細(xì)的根據(jù)分子生物學(xué)當(dāng)前的協(xié)定來確定技術(shù)的定義和術(shù)語。氨基酸殘基的縮寫，是標(biāo)準(zhǔn)的3個字母或1個字母的代碼，用來在技術(shù)中指代20種L-氨基酸之一。有關(guān)于多聚核苷酸“重組”這一術(shù)語，來源于多聚核苷酸的半合成，合成或是由 cDNA，基因組DNA( “gDNA”)編碼得來，他們與這些在自然中與自身完全或部分關(guān)聯(lián)的多聚核苷酸不完全相關(guān)聯(lián)。此處所使用的"多肽"這一術(shù)語，指的是一種氨基酸的聚合物，并不是指產(chǎn)品的特定長度。因此，多肽的定義中可以包含多肽、低聚肽、蛋白質(zhì)并且最短可至兩個氨基酸。 這個術(shù)語也指修飾后表達(dá)的多肽，例如，糖基化、乙?；?、磷酸化或類似反應(yīng)。例如定義范圍內(nèi)的多肽包含一個或多個類似氨基酸(例如非天然氨基酸)，有替代關(guān)聯(lián)的多肽，以及在技術(shù)領(lǐng)域中已被公知的發(fā)生自然或非自然修飾的多肽。正如在該技術(shù)領(lǐng)域中公知的，“蛋白質(zhì)”“肽類” “多肽”和“寡肽”是氨基酸鏈碳(通常為L-氨基酸)，他們的α炭通過縮合反應(yīng)形成肽鍵，使彼此的氨基酸相連接。通常情況下，組成蛋白質(zhì)的氨基酸的編號順序，起始于氨基末端，向著羧基末端的方向延長?！昂怂帷ㄊ侵付嗑酆塑账幔缑撗鹾颂呛怂?DNA)或核糖核酸(RNA)等。這一術(shù)語通常包括單鏈核酸，雙鏈核酸，以及RNA，DNA的核苷酸或核苷類似物。此處使用的術(shù)語" 多聚核苷酸"是指一個DNA分子、RNA分子或其互補鏈。一個多聚核苷酸分子可以單個或雙鏈的。DNA分子可由其核酸序列鑒別，通常是由5'到3'方向。其中5'和3'是指上一個核苷酸的5'端的磷酸基團和下一個核苷酸的3'端羥基之間的連接。一段5'到3'方向的序列，他的互補鏈的序列是按照沃森-克里克堿基配對原則形成的。因此互補鏈的序列由母鏈序列決定，如胸腺嘧啶對腺嘌呤，鳥嘌呤對胞嘧啶。此處使用的，一個小的抑制RNA是20-30個核苷酸組成的雙鏈RNA，與蛋白結(jié)合后形成一個RNA干擾誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，可以直導(dǎo)siRNA到目標(biāo)RNA序列。隨后，雙鏈 siRNA松開，通過內(nèi)切酶和核酸外切酶的作用，離開反義鏈，使mRNA序列的信號減弱。為了獲得持久的治療效果，RNAi需要長時間表達(dá)，最好是有構(gòu)建的啟動子。為了獲得一個載體的雙鏈RNA，它需要被表達(dá)成一個短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，其中有一個正義鏈，發(fā)夾環(huán)區(qū)域和反義鏈(Miyagishi 等，J 基因醫(yī)學(xué) 6 =715-723, 2004)。此處所指的術(shù)語“上游”，當(dāng)是蛋白質(zhì)分子時，是靠近第二個殘基的N端殘基；當(dāng)是核苷酸分子時，是靠近第二個殘基的5'端。而術(shù)語“下游”是指，當(dāng)是蛋白質(zhì)分子時，指靠近第二個殘基的C端殘基；當(dāng)是核苷酸分子時，指靠近第二個殘基的3'端。此外，“部分” 和“片段”交替使用，指一種多肽，核酸，或其他分子構(gòu)造的部分。“載體”一詞是指一個核酸分子可以轉(zhuǎn)運另一個核酸分子進(jìn)出細(xì)胞。在某些例子中，載體可以允許DNA序列復(fù)制進(jìn)自身。同時載體需要包含一個啟動子，這樣至少在部分宿主細(xì)胞內(nèi)，可以加強或維持核苷酸的表達(dá)。載體可以自主復(fù)制，或被整合到宿主細(xì)胞的染色體上。有例子表明，載體中包含一種表達(dá)載體，它可以按照核苷酸的部分序列復(fù)制出蛋白質(zhì)或核苷酸，再將其嵌入載體中。
在該技術(shù)領(lǐng)域中周知的是，核酸序列相互雜交的條件，是嚴(yán)密性從低到高的進(jìn)化。 通常說來，高度嚴(yán)密的雜交，是用高溫，低鹽緩沖溶液洗滌。雜交也可以利用科學(xué)的雜交方案標(biāo)準(zhǔn)過濾掉限制性的DNA，如0. 5M NaHPO4和7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，在65°C，以及用 0. 1 X SSC/0. 1% SDS洗滌后再用0. 25M NaHPO4, 3. 5% SDS洗滌，溫度范圍可以從室溫到 68°C，這由探針的長度決定。(見例如 Ausubel，F(xiàn). Μ.等，Short Protocols in Molecular Biology,第4版，第2章，John ffiley&Sons, N. Y)。例如，一個高度嚴(yán)密性的洗滌包括6x SSC/0. 05%焦磷酸鈉，在37°C下洗滌得到的14個堿基的寡核苷酸探針；或是48°C下得到的 17個堿基的寡核苷酸探針；或是55°C下得到的20個堿基的寡核苷酸探針；或是60°C下得到的25個堿基的寡核苷酸探針；或是65°C下得到的一個約250個核苷酸長度的核酸探針。 核酸探針常由放射性核酸標(biāo)記，例如在尾部由[Y-32P] ATP標(biāo)記，或是和[a-32P]dCTP通過隨機的初級結(jié)合而標(biāo)記。此外，探針通過和生物標(biāo)記素或被熒光標(biāo)記的核酸相結(jié)合，而被標(biāo)記，并使用鏈霉素親和素或抗熒光抗體來檢測探針。術(shù)語“相似性”或“相似百分比”指的是兩個氨基酸序列或核酸序列之間的同源性， 相似百分比用以校準(zhǔn)兩條核酸序列，指的是在共同的位置比較相似殘基(氨基酸或核酸) 的數(shù)量。序列的校準(zhǔn)和比較是按照目前科學(xué)的計算標(biāo)準(zhǔn)，或是公開在BLAST和FASTA上的計算版本來進(jìn)行。此外，由美國國立衛(wèi)生院，Bethesda醫(yī)師提供的ENTPvEZ，可用于序列比較。在實施例中，兩個序列的相似百分比可由重量差距為1的GCG來確定，把每個氨基酸的差距加權(quán)，就好像是兩個序列間不匹配的單個氨基酸一樣。例如，某序列和指定的序列有至少90%相似，是指范圍從90到99. 99%，并且包含之間所有的范圍。即它和指定序列的相似度可以是 91，91. 5,92,92. 5,93,93. 5. 94,94. 5,95,95. 5,96,96. 5,97,97. 5,98,98. 5,99, 99. 5%。同理，某序列和指定的序列有至少70%相似，是指范圍從70到99. 99%，并且包含之間所有的范圍。而具體的數(shù)值取決于所使用的計算方法。在此，“同源性”是指一個序列與另一個序列(蛋白質(zhì)或核酸序列)的序列相似程度。通常，兩個同源序列之間的相似程度至少在50%。在備用實施例中，同源序列的相似性不低于60 %或者75 %或者80 %，甚至有時高達(dá)90 %。在另一些實施例中，兩個序列之間的相似性至少在95 %或98 %，甚至99 %。與此類似，此處所提到的“同源物”表示與野生型氨基酸序列具有同源性的多肽。同源性比對可通過肉眼進(jìn)行，但更多情況下需要借助于序列比對程序。這些商業(yè)化的程序能夠計算出兩個甚至更多序列間的同源性百分比(例如 Wilbur, W. J.和 Lipman，D. J.，1983，Proc. Natl. Acad Sci. USA，80 :726-730)。任何有生物活性的多肽或有功能的衍生物(和/或類似物)包括對多肽的其中一個或多個氨基酸進(jìn)行修飾、插入、缺失或替換而又不顯著影響多肽的性質(zhì)。例如，具有生物活性的衍生物或類似物可以通過替換保守氨基酸而實現(xiàn)。當(dāng)然，生物活性衍生物也要包含原始肽段的片段。最好衍生物或類似物與原始肽段相比具有更高的活性或穩(wěn)定性。突變蛋白質(zhì)可以通過傳統(tǒng)的技術(shù)來獲得類似物和衍生物。在某個實例中，衍生物與原始多肽相比可能具有更高的活性。例如，在某些實例中，衍生物或類似物的活性至少提高了 2倍，有的至少提高5-10倍，甚至提高20倍?！巴蛔兊鞍住笔峭ㄟ^改變多肽一個或者更多氨基酸來得到預(yù)期的多肽，例如用非二硫鍵形式的氨基酸代替半胱氨酸殘基。突變蛋白、類似物和衍生物還可以用另外一些傳統(tǒng)技術(shù)來獲得。例如，PCR引入的突變可以被利用。雖然以下討論都是針對DNA，但該技術(shù)也可以應(yīng)用到RNA上。WO 92/22653 中描述了 PCR技術(shù)的實例。獲得類似物、突變蛋白和衍生物的另一種方法是以Wells提出的技術(shù)為基礎(chǔ)的盒式突變形成(Gene，(198 34:315)。目前，發(fā)明中所涉及的術(shù)語“類似物”或“衍生物”是指基因的斷裂、變異、等位基因造成并由此產(chǎn)生的衍生物。這些術(shù)語只在具有“成熟”多肽或功能性多肽生物活性的情況下適用。因此，人或非人來源的成熟蛋白質(zhì)或功能多肽具有至少60%、或者70%、80%甚至高達(dá)90 %的序列同源性的多肽都涵蓋在此定義中。某種蛋白的類似物還包括與其具有一處或多處肽段相似性(類肽)并具有蛋白生物活性的多肽。此定義還包括含有一個或多個類似氨基酸(如非自然界存在的氨基酸)的多肽、含有替代化學(xué)鍵的多肽以及其他自然存在或非自然存在的修飾后多肽。多肽一詞也不排除表達(dá)后進(jìn)行過化學(xué)修飾(諸如糖基化修飾、乙?；揎椇土姿峄揎椫?的多肽。因此，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)境而實現(xiàn)美容功效的多肽類似物和/或衍生物可能含有氨基酸替換、缺失或插入。氨基酸替換應(yīng)該是對保守氨基酸進(jìn)行替換或者消除非必需氨基酸殘基的替換，例如改變糖基化位點、乙?；稽c，或者通過替換或缺失一個或多個對蛋白功能不必要的半胱氨酸殘基來減少多肽的錯誤折疊。此處使用的“保守氨基酸”一詞是指擁有相同結(jié)構(gòu)和/或功能的一類蛋白質(zhì)群體中完全相同的氨基酸。大多數(shù)保守的氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是非常重要的。因此，鑒定出蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中存在的連續(xù)保守氨基酸區(qū)域?qū)υ摰鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能非常重要。為了找到保守的氨基酸殘基或三維結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域，要對不同物種、或同一物種的不同個體間相同或相似的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對。對保守氨基酸的替換通常要能夠維持多肽整體的電荷量、疏水性或親水性或空間體積，例如，有如下氨基酸取代的即為保守氨基酸取代甘氨酸/丙氨酸，纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸，天冬氨酸/谷氨酸，賴氨酸/精氨酸，天冬酰胺/谷氨酰胺，絲氨酸/半胱氨酸/蘇氨酸和苯丙氨酸/色氨酸/酪氨酸?！氨磉_(dá)載體”是一種多聚核苷酸，可以在目的宿主細(xì)胞內(nèi)起作用，同時可以引起宿主細(xì)胞生成有益的基因?！罢{(diào)控序列”指的是一段多聚核苷酸序列，負(fù)責(zé)調(diào)控與它自身相連接的編碼基因的表達(dá)。這種調(diào)控序列的本質(zhì)隨宿主的不同而不同。通常包括啟動子，轉(zhuǎn)錄終止序列等?！罢{(diào)控序列”還包括一些其他的有益存在，例如，分泌多肽的分泌前導(dǎo)序列。“可行性連接”指的是，在允許組件按各自方式發(fā)揮功能的基礎(chǔ)上，給他們并置某些有關(guān)聯(lián)的組分。在不影響編碼序列表達(dá)的基礎(chǔ)上，編碼序列和控制序列和諧的連接，這就是可行性連接。在這兩個組分之外，可行性連接可能會有自己額外的核苷酸(或肽類的氨基酸)。此處使用的“終止子”是一種控制序列，如多聚腺苷酸和轉(zhuǎn)錄終止序列，位于3'端或終止密碼子編碼序列的下游調(diào)控序列。本文所用的“重組宿主細(xì)胞” “宿主細(xì)胞” “細(xì)胞” “細(xì)胞培養(yǎng)”和其他類似的術(shù)語， 表示微生物，昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞，可以或已被用來作為引進(jìn)重組載體或以其他方式轉(zhuǎn)移DNA的接受者，包括已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代。本文使用的“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”是指進(jìn)入宿主細(xì)胞的外源性核苷酸的轉(zhuǎn)移，可以使用多種轉(zhuǎn)移方法，例如，感染，直接吸收，傳導(dǎo)，F(xiàn)-交配，注射，顯微注射或電擊。外源性核苷
11酸可以作為非集成載體被維持，例如在某些情況下，質(zhì)?？赡軙徽系剿拗骰蚪M中?！凹兓摹焙汀胺蛛x的”是指一種多肽或核苷酸序列，表示該序列的分子在其它相同品種或類型的生物大分子中實質(zhì)性的缺乏。在其他的方案中，術(shù)語“精煉的”是指重量至少占相同類型生物大分子質(zhì)量的75 %，85 %，95 %或98 %?！八帉W(xué)可接受的載體”是指任何可以服用進(jìn)入人體，而不會產(chǎn)生任何不良副作用的載體。如抗體產(chǎn)生的發(fā)熱癥狀等?！疤幚怼被颉爸委煛笔侵父纳苹蚍乐箰夯癄顟B(tài)(如皮膚皺紋)，或改進(jìn)主體的狀況。 在某些實施例中，“治療”一詞是指對美容外觀狀態(tài)的廣泛的治療，包括減輕某種癥狀或是這種狀態(tài)引起的其他癥狀?！坝行Я俊笔侵改軌虍a(chǎn)生理想結(jié)局的有效量。這個數(shù)值會變化，取決于接收治療的人不同的健康或生理狀態(tài)，個體對合成抗生素的免疫力，需要保護的程度，藥物的制劑，主治醫(yī)生對醫(yī)療狀況的評估，以及其他的相關(guān)因素。本文使用的，“體內(nèi)轉(zhuǎn)染”或“體內(nèi)合并”是指，有益的生物分子被引入活體細(xì)胞的過程。這個術(shù)語包含了對單獨多聚核苷酸的轉(zhuǎn)染，或者是包含一個額外基團或進(jìn)入細(xì)胞的載體的多聚核苷酸。體內(nèi)轉(zhuǎn)染的具體方法將在細(xì)節(jié)中介紹。“體外轉(zhuǎn)染”或“體外合并”是指，有益的生物分子被引入活體外細(xì)胞的過程。這個術(shù)語包含了對單獨多聚核苷酸的轉(zhuǎn)染，或者是包含一個額外基團或進(jìn)入細(xì)胞的載體的多聚核苷酸。體外轉(zhuǎn)染的具體方法將在細(xì)節(jié)中介紹。本文使用的，維護具有美容功效細(xì)胞的多肽，可以是如前所述的任何形式的多肽。 它們可以促進(jìn)生成，增強這類細(xì)胞健康和壽命的生物分子。正如領(lǐng)域中眾所周知的，這種蛋白的肽類和基因的序列已經(jīng)可以從公共數(shù)據(jù)庫中獲得。本文使用的，“血小板衍生生長因子”或“PDGF”包括PDGF A鏈多肽，PDGF B鏈多肽，以及AA，BB, AB型的二聚體，生物活性片段，類似物，衍生物。這些都在如下文獻(xiàn)中有介紹美國專利，專利號 5，187，263，Waterfield 等·，Nature 304 :35-39 (1983) ；Wang 等， J. Biol. Chem. 259 :10645-48(1984)，Antoniades 等，Biochem. Pharm. 33 :2833-38(1984)； 和 Westermark 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :7197-7200 (1986)；美國專利，專利號 5，219，759。一種“具有生物活性的PDGF”多肽是指，一種具有相同或更好的，能優(yōu)先刺激皮膚真皮層細(xì)胞生長或增殖能力的多肽。這種多肽可以是一個全長PDGF，PDGF片段，或是PDGF的類似物。他可以承擔(dān)PDGF氨基酸的替換，刪除，增加或衍生。這些在如下的文獻(xiàn)中有介紹美國專利，專利號5，149,792，EP 458959B1 ；以及美國專利Nos. 4，769，328 ； 4，801，542 ；4，766，073 ；4，849，407 ；4，845，075 ；4，889，919 ；5，045，633 ；和 5，128，321。本文使用的，“角質(zhì)細(xì)胞生長因子”或“KGF”指的是一群結(jié)構(gòu)不同的蛋白族中的一種，這個蛋白族稱作FGFs，它們顯示不同程度的序列同源性。這表明他們是由相同的基因家族編碼的。FGFs在細(xì)胞表面具有相同的結(jié)合位點。例如，KGF能夠和FGFR-3結(jié)合。同時 “角質(zhì)細(xì)胞生長因子”或“KGF”指的是任何一個如前所述的成熟的多肽或生物活性片段，類似物或衍生物，例如WO 90/08771和WO 95/01434。一種“具有生物活性的KGF”多肽是指，一種具有相同或更好的，能優(yōu)先刺激皮膚表皮層細(xì)胞生長能力的多肽。這種多肽可以是一個全長KGF，KGF片段，或是KGF的類似物。 他可以承擔(dān)KGF氨基酸的替換，刪除，增加或衍生。這些在WO 90/08771和WO 95/01434中有介紹。此處使用的術(shù)語“胰島素樣生長因子”是指，在大幅純化的，天然的，重組生產(chǎn)的以及化學(xué)合成的各種形式中，包含的IGF-I和IGF-II。除此之外還包括生物活性片段，類似物，突變蛋白，C端缺失的突變蛋白以及衍生物。他們可以保持胰島素樣生長因子的活性，或連接胰島素受體的能力。例如以下文獻(xiàn)描述的EP 135 094，WO 85/00831，美國專利，專利號 4，738，921，WO 92/04363，美國專利，專利號 5，158，875，EP 123 2 和 EP 128 733。同時相同的內(nèi)容在如下文獻(xiàn)中也有描述EP 135 094，WO 85/00831，美國專利，專利號 4，738，921，WO 92/04363，美國專利，專利號 5，158，875，EP 123 2 和 EP 128 733。一種“具有生物活性的IGF”多肽是指，一種具有相同或更好的胰島素樣作用的生長因子。例如，在與其連接的受體的胞質(zhì)區(qū)，對特定的酪氨酸殘基進(jìn)行磷酸化的刺激，如WO 93/98826 所述。或是在另一些例子中，對某種細(xì)胞有絲分裂的影響，如EP 0128733所述。這種多肽可以是一個全長IGF，IGF片段，或是IGF的類似物。他可以承擔(dān)IGF氨基酸的替換，刪除， 增加或衍生。本發(fā)明中所使用的“胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ”，是指一個綁定了 IGF 結(jié)合蛋白的結(jié)合蛋白。在如下文獻(xiàn)中被鑒別和描述Keifer et al, J. Biol. Chem. 266 9043-9(1991)，Camacho-Hubner 等，J. Biol. Chem. 267 11949-56 (1992)，McCusker 禾口 Clemens, THE INSULIN LIKE GROWTH FACTORS STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS, Oxford Univ. Press, N. Y. pp. 110-150 (1992)。一種“具有生物活性的 IGFBP”多肽是指，具有相同或更好的胰島素樣生長因子綁定蛋白的活性的多肽，通過向那些胰島素樣生長因子可以發(fā)揮活性的組織和細(xì)胞內(nèi)綁定及輸送胰島素樣生長因子而發(fā)揮作用。正如現(xiàn)在至少有 6種已知的IGFBP，他們中有些與其他的IGFBP很不同。一個給定的IGFBP的生物活性相關(guān)的特質(zhì)不必包括整個胰島素樣生長因子整體。一個獨立的IGFBP的生物活性或許和其他的 IGFBP有相似之處，但也有不同。此處使用的“全長PDGF”或“成熟PDGF”和“全長KGF”或“成熟KGF”和“全長IGF” 或“成熟IGF”和“全長IGFBP”或“成熟IGFBP”指的是在人或其他哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的， 各自的母體多肽。此處使用的“膠原”是指一個含有至少觀個結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(膠原I-XXVIII)的大族群中的一員，它們顯示不同程度的序列同源性。這表明他們是由相同的基因家族編碼的。 膠原是組成細(xì)胞外間質(zhì)的主要纖維多肽，同時也是皮膚結(jié)構(gòu)的支撐。它包括真皮，表皮-真皮交界以及其他身體組織。這類蛋白質(zhì)組成了多種，結(jié)構(gòu)和功能重要的超分子組件(例如參見，Pihlajamaa T. ,New tools for the study of an old collagen characterization of the human C0L9A1, C0L9A2 and C0L9A3 genes and production of human type IX collagen as a recombinant protein. Collagen Research Unit, Biocenter OuIu and Department of Medical Biochemistry, University of OuIu, FIN_902200uIu, Finland, 2000，OuIu, Finland)。膠原的特點是由三重螺旋其中的三個相同或不同的多肽鏈組成的， 稱為α鏈。而單個膠原則是以結(jié)構(gòu)劃分成兩個主要群體為其特征，如纖維狀和非纖維狀。 纖維狀的群體和原纖維中，膠原包括I，II，III，V和XI型。1,11和III型的膠原作為主要的纖維狀膠原，意味著含有大量的組織。大部分的 I型膠原在結(jié)締組織中表達(dá)，同時也是最豐富的膠原，是皮膚，骨骼，肌腱和韌帶的主要結(jié)構(gòu)成分。I型膠原通常以異三聚體的形式存在，包括兩個α I(I)鏈和一個α 2(1)鏈，分別由 COLlAl和C0L1A2基因編碼。II型膠原則是軟骨，玻璃體和椎間盤的主要成分，也是在其發(fā)展過程中，在內(nèi)耳和許多其他組織中瞬時檢測到的。它是一個由C0L2A1基因編碼的同三聚體，由三個α 1 (II)鏈組成。III型膠原也是同三聚體，由α 1 (III)鏈組成。它在大部分含有 I型膠原的組織中表達(dá)，除了骨骼和肌腱。在彈性蛋白組織中廣泛存在，包括皮膚，血管，內(nèi)臟和肺，可與I型膠原組裝成異型纖維。除了形成原纖維，非纖維狀膠原還可以提供許多其他功能。他們的三重螺旋特質(zhì)會因為非膠原的干擾而分裂為若干片段。而非纖維狀的膠原， 根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)和功能不同分為六個亞群。重要的網(wǎng)狀膠原包括IV型，VI型和VII型。IV 型膠原網(wǎng)絡(luò)存在于身體大部分位點的所有基底膜中。在大部分位點中，這種支持和控制的網(wǎng)絡(luò)包括α I(IV)和α 2 (IV)鏈，但是某些基底膜，如腎小球膜，也包括a3(IV)，a4(IV)， α 5 (IV)和α 6 (IV)鏈。這些α鏈的膠原區(qū)，長度大約是1400個氨基酸，并含有許多短暫的中斷。編碼這些多肽的基因，在一般隨機定位的膠原基因之間，形成了一個有趣的例外， 那就是在三種染色體頭對頭連接的趨勢中，它們被成對的定位。VI型膠原是由al(VI)， α 2 (VI)和α 3 (VI)鏈組成的異三聚體，它由一個側(cè)面具有大型球狀N和C端的簡短三重螺旋組成。它是唯一聚合成串珠狀微絲的膠原，存在于細(xì)胞表面，眾多結(jié)締組織周圍的膠原纖維中，并可能作為細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子框架與細(xì)胞相連的錨定位點。VII型膠原通過二聚以及和同三聚體α I(VII)三個分子側(cè)面的結(jié)合而形成錨固纖維。這些纖維連接上皮基底膜到皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)底部，角膜以及一些其他的上皮組織。高度中斷的VII型三重螺旋，在所有膠原中是最長的，并且編碼它的C0L7A1基因具有已知基因中最多數(shù)量的外顯子，如108個。因此在替代方案中，運用在本發(fā)明方法和組合物中的膠原肽，以及表達(dá)會使這些使用增加的膠原肽可以是完整長度的膠原，膠原片段或其功能類似物。這種膠原可能包括I型(C0L1A1和C0L1A2基因，體內(nèi)最豐富的膠原)，II型(C0L2A1基因，透明軟骨)，III 型(C0L3A1 基因，肉芽組織中發(fā)現(xiàn))，IV 型(C0L4A1，C0L4A2，C0L4A3，C0L4A4，C0L4A5，C0L4A6 基因，基膜和眼球晶狀體中發(fā)現(xiàn))，V型(C0L5A1，C0L5A2, C0L5A3基因，間質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn))， VI型(C0L6A1，C0L6A2，C0L6A3基因，間質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn))，VII型(C0L7A1基因，真皮與表皮的交界處發(fā)現(xiàn)),VIII (C0L8A1和C0L8A2基因，內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)),EK(C0L9A1,C0L9A2,C0L9A3 基因，與II型和XI原纖維結(jié)合的FACIT膠原)，X(C0L10A1基因，礦化的軟骨)，XI (C0L11A1 和C0L11A2基因，軟骨中發(fā)現(xiàn))，XII(C0L12A1基因，與I型原纖維結(jié)合的FACIT膠原)， XIII(C0L13A1基因，一種與某種整合蛋白和纖連蛋白相作用的跨膜蛋白)，XIV(C0L14A1基因，一種 FACIT 膠原)，XV(C0L15A1 基因)，XVI (C0L16A1 基因)，XVII (C0L17A1 基因，一種跨膜膠原)，XVIII (C0L18A1 基因)，XIV(C0L19A1 基因，一種 FACIT 膠原)，XX(C0L20A1 基因)，XXI (C0L21A1 基因，一種 FACIT 膠原)，XXII (C0L22A1 基因)，XXIII (C0L23A1 基因)， XX IV(C0L24A1 基因)，XXV (C0L25A1 基因)，XXVI (C0L26A1 基因)，XXVII (C0L27A1 基因)， 以及XVIII (C0L28A1基因)。在本發(fā)明的方法和組合物中，許多類型的膠原對具有美容功效的細(xì)胞的功能至關(guān)重要。 此處使用的“彈力蛋白”是指原彈性蛋白或成熟的彈性蛋白多肽。它是一種關(guān)鍵的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，對脊椎動物組織的彈力和恢復(fù)力至關(guān)重要，這些組織包括皮膚大動脈， 肺，韌帶，肌腱，皮膚以及彈性軟骨(見Mithieux和Weiss，2005，Elastin，Advances in Protein Chemistry, Vol70,p437)。人基因編碼的原彈性蛋白是一種定位于7qll. 2區(qū)域的單拷貝。初級轉(zhuǎn)錄大約是401Λ的長度，同時包括散落在大量內(nèi)顯子周圍的少量外顯子，這就導(dǎo)致了外顯子/內(nèi)顯子比率異常偏低。這段約3. 5kb的mRNA序列碼，包含一個約2. 2kb 的編碼區(qū)以及一個相對大的，1.31Λ 30的非轉(zhuǎn)譯區(qū)。人原彈性蛋白包含34個外顯子。原彈性蛋白以外顯子周期為特征，具有獨特功能的疏水性和交聯(lián)域在獨立的外顯子替換中被編碼。所有以三核酸倍數(shù)存在的外顯子以及內(nèi)顯子-外顯子的交界都是以相同的方式分裂的。在30交叉點發(fā)現(xiàn)密碼子的第一個核苷酸，而第二個和第三個核苷酸存在于50外顯子的邊界。原彈性蛋白的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物需要經(jīng)歷廣泛的選擇性剪切，因為位于外顯子-內(nèi)顯子邊界的密碼子剪切始終貫徹在整個分子中，有選擇性的剪切與編碼序列的維護一起，常以卡帶式發(fā)生。這就在轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生了大量不規(guī)則的原彈性蛋白的亞型。至少已知的7種人外顯子被選擇性切割，它們分別是22,23,24, 26A, 30，32，和33。可以使用個體外顯子的選擇性剪切，來修飾不同組織中的結(jié)構(gòu)性功能蛋白。從所有被調(diào)查的物種中觀察到，它顯現(xiàn)發(fā)育調(diào)控和組織特異性，同時隨著年齡以相同比率變化。人最常見的同型原彈性蛋白缺乏外顯子^A，據(jù)報道僅在某些疾病蛋白中表達(dá)。有三種人疾病與原彈性蛋白基因的突變或缺失有關(guān)，它們是皮膚松弛癥，上主動脈瓣狹窄以及 Williams-Beuren 綜合征?！癟IMP”指的是一群至少有4種結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白族(基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子_1，2，3，4(即TIMP-I，TIMP-2, TIMP-3和TIMP-4))中的一種，它們顯示不同程度的序列同源性。這表明他們是由相同的基因家族編碼的。通過抑制膠原酶，明膠酶或其類似物(基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs))，Tnffs對限制細(xì)胞外基質(zhì)分解起至關(guān)重要的作用。所有的TIMPs 具有一個主要的特征，即他們有12個保守半胱氨酸殘基以及保守的相互間距，和一個23到 29的氨基酸前導(dǎo)序列，和生產(chǎn)成熟蛋白有關(guān)。TIMPs和MMP-TIMP的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)已被報道，如TIMP-I和MMP-3，TIMP-2，MTl-MMP的復(fù)合物。TIMPs的形狀是一個細(xì)長連續(xù)的楔形， 包括二分之一 N端和C端與彼此相反的多肽鏈的(Gomis-Ruth等1997)。在MMPs復(fù)合物中，TIMPs通過和它們裂隙邊緣的活性位點結(jié)合而進(jìn)入全線MMPs。TIMP-I蛋白是一個分子量^.5kDa的184個氨基酸的糖蛋白。它包含了兩種可能的N-糖基化位點。TIMP-I啟動子除了一個先導(dǎo)結(jié)合蛋白I(LBPl)轉(zhuǎn)錄因子的假定結(jié)合位點外，還包括10個Spl，6個AP-I，6個PEA3，12個AP-2位點以及5個CCAAT框。上游 TIMP-I元素-1 (UTE-I)對TIMP-I的轉(zhuǎn)錄也是必不可少的。啟動子含有兩種新型的抑制成分，和一個身份不明的ETS相關(guān)因子來抑制轉(zhuǎn)錄(Dean等2000)。TIMP-I蛋白已在人牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。此外，人成骨細(xì)胞可以分泌TIMP-1。TIMP-2蛋白是一個分子量21 kDa的194個氨基酸的非糖蛋白。它有一個帶負(fù)電荷的延伸的C端。TIMP-2啟動子由若干調(diào)控元件組成，包括5個Spl，2個AP-2，1個AP-I 以及3個PEA-3結(jié)合位點。TIMP-2被轉(zhuǎn)錄成兩種mRNAs，分子量分別是1. 2和3. 81Λ。并由人成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌。TIMP-3的多肽序列與TIMP-I和TIMP-2的序列分別有37%和42%的相似度。 TIMP-3蛋白有188個氨基酸。在C端有一個保守的糖基化位點。重組人TEVDP-3的特征表明，它有一個27kDa的糖基化成分和一個MkDa的非糖基化成分。TIMP-3可以以它的糖基化和非糖基化形式定位于ECM。TIMP-3基因有4個SpI位點，但是在它的啟動子中沒有 TATA框。三種TIMP-3的mRNA組分，分子量分別是2. 4，2. 8和5. 5kb,由該基因轉(zhuǎn)錄得來，并由人軟骨細(xì)胞表達(dá)。TIMP-4蛋白的分子量是22kDa，是由195個氨基酸組成的多肽。TIMP-4多肽與 TIMP-I具有37%的相似度，與TIMP-2和-3具有51%的相似度。在生理條件下(pH 7.4)， TIMP-4是最中性的TIMP蛋白，等電點為7. 34。相比之下，人體TEMP-I，TIMP-2和TEMP-3 蛋白的等電點分別為8. 00，6. 45和9. 04。TIMP-4基因轉(zhuǎn)錄成分子量1. 4kb的mRNA。作為鈣化組織，TIMP-4在人軟骨中被檢測到。每個TIMP蛋白都與一個目標(biāo)MMP蛋白以不同速率的相互作用和親和力相結(jié)合，通常是按1 1或2 2的化學(xué)計量。TIMP-I對ΜΜΡ-1，ΜΜΡ-3和MMP-9的抑制比TIMP-2更有效。TIMP-2對proMMP-2的抑制比TIMP-I更有效，是10倍甚至更多。但是TIMP-2對MMP-2 有雙向調(diào)節(jié)作用，因為MT-MMP需要少量TIMP-2激活反應(yīng)，從而調(diào)解proMMP-2的活性。但是大濃度的TIMP-2會抑制MMP-2。TIMP-3至少對MMP-2和MMP-9有抑制作用，而TIMP-4 是一個沒有顯著偏好的所有特定類型MMPs的良好抑制劑。TIMP-4通過抑制MTl-MMP和抑制MMP-2激活來調(diào)節(jié)MMP-2活性。雖然TIMPs會抑制已激活的MMP，但與明膠結(jié)合的MMPs是一個例外，因為TIMP 能可逆的結(jié)合MMP-2和MMP-9的前體形式。隨后，TIMP從復(fù)合體中分離，并允許繼續(xù)激活 proMMP。例如，TEMP-I 與 proMMP-9 結(jié)合，隨后 proMMP-9 被 MMP-3 激活，直到 TEMP-I 使復(fù)合體失活而被阻止。例如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，不會破壞proMMP-9。但是，TEMP-2也可能抑制MMP-9的活性形式。對于被所有TIMPs (除去TIMP-1)抑制的MMP和MMP-19，活性 MMP-13是個例子。可溶性MMP-16的活性被TIMP-2和TIMP-3抑制，但是不包括TIMP-I。此處使用的“MMPs”是指一個由至少28個分泌或跨膜酶組成的大家族，它們都可以加工或降解ECM蛋白。它們中，至少有22種MMPs迄今為止被發(fā)現(xiàn)在人體組織中表達(dá)。 Miffs具有高度的蛋白序列同源性，并且已經(jīng)定義了結(jié)構(gòu)域。因此，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點，MMI^s既可以按分泌MMPs歸類，又可以被分類為膜錨定MMPs，進(jìn)一步可分為8個獨立的亞群。分泌 MMPs包括最小域MMPs，簡單血液結(jié)合素域MMPs，明膠結(jié)合MMPs，弗林蛋白酶激活分泌MMPs 和類體蛋白嵌入MMPs。而膜結(jié)合MMf3S包括I型跨膜MMPs，糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接MMPs 和II型跨膜MMPs。MMPs的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步揭示了準(zhǔn)確的域組織，多肽折疊以及主要的特異性決定因素。迄今為止，除了豬的全長MMP-I蛋白和人proMMP-2蛋白外，人MMP-1，MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-11, MMP-12, MMP-13和MMP-14蛋白刺激域的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解決。第三個限制MMPs蛋白水解活性的層次，包括內(nèi)源性MMPs組織抑制劑(TIMPs)。 Tnffs特異性抑制MMPs的活性形式，以及某些情況下潛在的MMf3S形式，同時打亂這種平衡， 導(dǎo)致組織發(fā)生病變?；钚訫Mf3S可以被α -巨球蛋白，尤其是α 2_巨球蛋白滅活。最近的研究結(jié)果表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑和組織因子途徑抑制劑-2(TFPH)抑制MMP-I，MMP-2, MMP-9和MMP-13 (Herman等2001)。鈣結(jié)合蛋白多糖(N-TES，睪丸素-1或睪丸素_3)能夠抑制MTl-或MT3-MMP介導(dǎo)的proMMP-2的激活。此外，還有許多外源性抑制劑。例如一些綠茶中的黃酮醇(如沒食子兒茶素-3-沒食子酸或兒茶素)，可以抑制MMP-2，MMP-9, MMP-12 的活性以及proMMP-2的激活。有些合成抑制劑對MMI3S活性也具有很好的抑制作用。一種 “具有生物活性的TIMP”多肽，是指具有相同或更強的優(yōu)先抑制MMPs能力的多肽。這種多肽可以是一個全長TIMP，TIMP，片段，或是TDVDP的類似物。他可以承擔(dān)TIMP氨基酸的替換，刪除，增加或衍生。此處所述“彈力素”指一個成熟的彈力素多肽(見如，F(xiàn)rancart，等，1997, Solution Structure of R-elafin, a Specific Inhibitor of Elastase, J. Mol. Biol. (1997)268, 666-677)。一個“具有彈力素生物學(xué)活性”的多肽指有相同/更強的能傾向于抑制彈性蛋白酶的物質(zhì)。此多肽可以是全長的彈力素，一段彈力素片段，具有氨基酸替代物的彈力素類似物，缺失，或增加，或彈力素衍生物如在美國專利5734014中所述。彈力素通常也稱為“皮膚衍生抗白細(xì)胞蛋白；彈性蛋白酶抑制劑；和SKALP)。彈力素是一個具有57個氨基酸殘基的多肽(6kDa)，其最初從銀屑患者的鱗屑中分離。彈力素是人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HLE)，豬胰彈性蛋白酶抑制劑，蛋白酶-3，三種能切割重要結(jié)締組織蛋白質(zhì)彈性蛋白的酶的特定抑制劑。它對其他絲氨酸蛋白酶沒有抑制作用，如纖維蛋白溶酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶和組織蛋白酶G。彈力素與其目標(biāo)以解離常數(shù)緊密結(jié)合。彈力素對于保護含有彈性蛋白的組織結(jié)構(gòu)的完整性，免遭免遭彈性蛋白酶降解，有重要作用，因此是一個潛在的治療價值的彈性蛋白酶引起的疾病的化合物。近日，彈力素已經(jīng)被證明，其以物理方式結(jié)合與彈性蛋白纖維可防止由紫外線引起的彈性蛋白的降解。彈力素基因序列已公開。此處所述，“超氧化物歧化酶”或“S0D”指至少三類結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶蛋白(S0D1-3)的成員之一，S0D1-3顯示不同程度的序列同源性，顯示，他們由相關(guān)的基因家族編碼。SOD歧化催化超氧化物生成氧氣和過氧化氫。因此，對于所有暴露在氧氣的細(xì)胞中，它具重要的抗氧化防御作用。在人中，超氧化物歧化酶的三種形式存在。SODl存在于細(xì)胞質(zhì)中，S0D2存在于線粒體和S0D3在細(xì)胞外。SODl是一個二聚體O個亞基)，而其他兩個是四聚體G個亞基)。SODl和S0D3含有銅和鋅，S0D2在其反應(yīng)中心含錳。S0D1，2和3的基因分別21，6和 4號染色體上(21q22. 1，6q25. 3和4ρ15. 3_ρ15· 1)。SOD已經(jīng)證明能防止成纖維細(xì)胞端粒的縮短，轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并減少皮膚輻射后的纖維化疤痕Gerra，et. al.， 2003. J Biol Chem. Feb 28 ；278 (9) :6824-30 ；Vozenin-Brotons. et. al. ,2001. Free Radic Biol Med. Jan 1 ；30(1) :30-42)。SODl 和 S0D2 基因序列已公開。此處所述，“熱激蛋白”或“HSPs”指一類結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的成員之一，該組蛋白具不同程度的序列同源性，顯示，他們由相關(guān)的基因家族編碼。熱激蛋白(HSPs)是存在于從細(xì)菌到人之間可組成或誘導(dǎo)表達(dá)的高度保守蛋白(S. Lindquist，Ann. Rev. Biochem 55,1151(1986)。組成型Hsp對許多不同的細(xì)胞功能具有重要作用。據(jù)分子量，可將 Hsp 分成 6 大類(a) 20-30kDa ； (b) 40_50kDa ； (c) 50_60kDa ； (d) 70kDa ； (e) 90kDa ；和 (f) IOO-IlOkDa(Minowada G 等，J. Clin. Invest. ,95,3(1995) ；Morris SD, Clin. Exper. Dermatol.，27，220 (2001))可誘導(dǎo)型Hsps可由一系列脅迫誘導(dǎo)，如升溫(M. Schlesinger 等，Cold Spring Harbor Laboratory, 1982),重金屬(Μ· Schlesinger 等，Alan R. Liss, Inc.，137(1989))，氨基酸類似物(P. Kelley 和 M. khlesinger，Cell 15,1277(1978) ；L. Hightower，J. Cell. Physiol. 102，407 (1980))，氧自由基(M. Ashburner, Chromosoma 31， 356(1970) ;J. Compton 和 B. McCarthy，Cell 14，191 (1978))，局部缺血或有缺氧導(dǎo)致的局部缺血(S. Guttman，Cell 22,299(1980) ；Μ· Ashburner 和 J. Bonner，Cell 17,241(1979)), 機械創(chuàng)傷(L. Hightower 禾口F. White，Cold Spring Harbor Laboratory, 369 (1982) ；D. Gower 等，J. Cell Biol. 103，291 (1986))，和細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的出現(xiàn)(J. Ananthan 等，Science
17232,522(1986))。熱激蛋白的統(tǒng)一功能是在非理想環(huán)境中維持細(xì)胞正常功能。Hsps在正常或休眠的皮膚細(xì)胞中均可組成型表達(dá)，對重要的生物過程起重要作用，例如分子伴侶作用(Maytin EV, J. Invest. Dermatol.，104，448 (1995)，和 / 或當(dāng)環(huán)境脅迫下，對脅迫蛋白的表達(dá)起迅速上調(diào)作用(Welch WJ，Physiol. Rev.，72，1063 (1992)。 一些Hsps在皮膚細(xì)胞中表達(dá)。Hsp72在角質(zhì)細(xì)胞中組成型表達(dá)(例如參見，Trautinger F 等，J. Invest. Dermatol. , 101,334(1993) ；Charveron M 等，Cell Biol. Toxicol.，11， 161(1995)；和 Laplante A 等，J. Histochem. Cytochem.，46，1291 (1998))。另外 Hsps 27，47，60，90，和 110 可能存在于正常的表皮中(Wilson N 等，J. Cutan. Pathol.，27， 176(2000)).任何這些Hsps似乎在正常組織中起特定作用。例如，Hsp 27穩(wěn)定肌動蛋白，而Hsp 90可作為分子伴侶，和/或激活特定轉(zhuǎn)錄因子(Charveron M等，Cell Biol. Toxicol.，11，161 (1995))，皮膚中Hsp 27可控制發(fā)育皮膚細(xì)胞的分化(Jantschitsch C 等，Br. J. Dermatol.，139，247 (1998))。有證據(jù)表明，Hsps在細(xì)胞之間能互換(L. Hightower和P. Guidon, J. Cell. Physiol. 138,257(1989) ；Μ. Tytell 等，Brain Res. 363，161 (1986) ；Μ. Tytell, Int. J. Hyperthermia, 21，4450455 (2005))。因此，Hsps起作用的位點可能并不限于產(chǎn)生其的細(xì)胞，而擴散到相鄰細(xì)胞。對具有美容功能的細(xì)胞講行基因修飾因此，本發(fā)明涉及用于基因修飾具美容功能的細(xì)胞以提升外貌的組合物和方法。 本發(fā)明可以其他多種方法予以實施。在一個實施例中，本發(fā)明可能包括一種用于受體中具美容功能的基本完整細(xì)胞在美容方面的基因修飾方法，該方法包括使用一種能編碼至少一個用于維持特定細(xì)胞具美容功能的核酸分子或多肽鏈的多聚核苷酸，將其應(yīng)用到至少一部分能發(fā)揮美容功效的細(xì)胞中，從而使上述核酸分子或多肽鏈在這些細(xì)胞中表達(dá)以提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。在另一個實施例中，本發(fā)明包括一個分離的多聚核苷酸分子，其能編碼至少一個用于維持具美容功能的細(xì)胞的核酸分子或多肽鏈。在另一個實施例中，該分離的多聚核苷酸分子被應(yīng)用于細(xì)胞，使具美容功能的細(xì)胞能表達(dá)上述提及的核酸分子或多肽，從而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。在另一個實施例中，本發(fā)明包括一個分離的多肽或一個分離的多聚核苷酸，其涉及維持具有美容功能的細(xì)胞。例如，在具體實施例中，本發(fā)明包括在此描述的一個分離的多肽或一個分離的多聚核苷酸。因此，在關(guān)于本發(fā)明的方法和組合物的另一些實施例中，分離出的多聚核苷酸可能包括 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :5，SEQ DD NO :9，SEQ ID NO :13，SEQ ID N0:17，或者是 SEQ ID NO :24 中的核苷酸 446-1030，或者是 SEQ ID NO :1，SEQ ID N0: 5，SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 17 的互補序列，或者是 SEQ ID N0:24，或者是與 SEQ ID NO 1, SEQ BD NO :5，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO 17 至少有 70%， 85%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，或 99%相似的序列，或者是 SEQ ID N0:24 中的核苷酸 446-1030，或者是與 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :17 互補序列至少有 70%，85%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，or 99%相似的序列，或者或者是/^PSEQ ID NO 24中的核苷酸446-1030。
在另一個實施例中，分離的多聚核苷酸可能包括SEQ ED N0:2(原骨膠原 C0L1A1), SEQ ID NO :6 (彈性蛋白)，SEQ BD NO 10 (超氧化物歧化酶 3)，SEQ ID NO: 14 (TIMP-I) SEQ BD NO :18(C0L1A2)，SEQ ID NO 23 (KGF-I)或者至少與 SEQ BD NO :2，SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO :18 有 70%，85%，80%，90%，95%， 96%,97%,98%,or 99%相似的多肽，或者SEQ BD NO :23?；蛘咭驯皇褂玫暮鲜鲂蛄械亩嚯?。這些核苷酸和多肽序列見圖1-5和16.在另一實施例中，本發(fā)明可能包括一個組合物用以基因修飾受體中大體完整的具美容功能的細(xì)胞。此組合物可能包括一個多聚核苷酸，其能編碼至少一個用于維持具美容功能的細(xì)胞的核酸分子或多肽鏈；還包括一個載體，用于將該多聚核苷酸應(yīng)用到至少一部分能發(fā)揮美容功效的受體細(xì)胞中，從而使核酸分子或多肽鏈在這些細(xì)胞中表達(dá)以提高或/ 和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程?；蛘撸摻M合物可能包括一個多肽用以維持具美容功能的細(xì)胞，還包括一個載體，用于將該多肽應(yīng)用到至少一部分能發(fā)揮美容功效的受體細(xì)胞中，從而使核酸分子或多肽鏈在這些細(xì)胞中表達(dá)以提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。多種多肽可能定向提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。例如，在一些具體實施例中，本發(fā)明的方法和組合物中所使用的多聚核苷酸編碼了一種角化細(xì)胞生長因子。在一個實施例中，該多肽包括一種角化細(xì)胞生長因子或由它產(chǎn)生的具生物學(xué)活性的衍生物。例如，在一些具體實施例中，該多聚核苷酸包括SEQ ED N0:24的 446-1030核苷酸，或SEQ ED NO : 的446-1030核苷酸互補序列，或與SEQ ED N0J4或其互補序列的 446-1030 核苷酸至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列，或者一條能編碼SEQ ID NO :23蛋白序列或與SEQ ED N0:23至少有70%， 75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%, or 99%相似序列的多聚核苷酸。在其他實施例中，該多聚核苷酸編碼一個膠原多肽或多肽(如C0L1A1和C0L1A2)。 或者，該多聚核苷酸可能編碼一個彈性蛋白。在其他實施例中，該多聚核苷酸可能編碼一個 TIMP-I多肽。或者，該多聚核苷酸可能編碼SOD多肽。在其他實施例中，該多肽至少包含一種轉(zhuǎn)化生長因子，一種血小板源性生長因子，一種血管內(nèi)皮生長因子，一種胰島素樣生長因子，一種肝細(xì)胞生長因子，一種血管內(nèi)皮生長因子，一種成纖維細(xì)胞生長因子，一種表皮生長因子，血小板衍化內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，一種結(jié)締組織生長因子，一種粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，一種巨噬細(xì)胞集落刺激因子，一種生長激素，TSP-I, TSP-2，一種膠原，TIMP-I, 一種超氧化物歧化酶，一種彈性蛋白，或一種缺氧誘導(dǎo)因子，或由其衍生的具生物學(xué)活性物質(zhì)中的一種。因此，在本發(fā)明的方法和組合物的另一些實施例中，多核苷酸可能包括SEQ ED NO 1, SEQ ED NO :5，SEQ ED NO :9，SEQ ID NO 13，或 SEQ ID NO 17，或 SEQ ED NO :1，SEQ ED NO 5, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :13，SEQ ED NO 17 的互補序列，和 / 或 SEQ ID NO 24 的 446-1030 核苷酸序列，或與 SEQ ED NO :1，SEQ ED NO :5，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 13 至少有 70%，85%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，or 99%相似的序列，或 SEQ ID N0: 17，和 / 或 SEQ ID NO 24 的 446-1030 核苷酸序列，或 SEQ ED NO :1，SEQ ID NO :5，SEQ ED NO 9, SEQ BD NO :13，SEQ ID NO 17 的互補序列和 / 或 SEQ ED NO 24 的 446-1030 序列。在其他實施例中，在本發(fā)明的方法和組合物的多聚核苷酸可能編碼多肽SEQ IDNO 2 (原骨膠原C0L1A1)，SEQ ID NO 6 (彈性蛋白)，SEQ ID NO 10(超氧化物歧化酶3)， SEQ ID NO 14 (TIMP-I)或 SEQ ID NO 18 (C0L1A2)，SEQ ID NO 23 (KGF-I)或與 SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO :18，or SEQ ID NO :23 多肽序列至少有70%，85%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，or 99%相似的序列?；蛘咭粋€被使用的包含這些序列的多肽。這些核苷酸和多肽的序列見圖1-5和16.在本發(fā)明的方法和組合物的具體實施例中，該多聚核苷酸包括，或被插入一個質(zhì)?；蛞粋€病毒載體。例如，在至少一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，該多聚核苷酸可穩(wěn)定地以質(zhì)粒形式存在于染色體外。在具體實施例中，購自于Gelantis的gWIZ 載體可被使用?；蛘哔徸杂?InvitrogenpVAX-BEST 可被使用。本發(fā)明的方法和組合物可能包括將單一或多種試劑導(dǎo)入細(xì)胞。在一個實施例中， 至少兩種多肽或核酸分子被導(dǎo)入細(xì)胞。在本發(fā)明的方法和組合物中的多聚核苷酸可能包括一個重組體的構(gòu)建體，用于在具有美容功能的細(xì)胞中表達(dá)特定多肽。因此，在此更詳細(xì)描述，能編碼一個核酸或多肽以維持具美容功能的細(xì)胞的多聚核苷酸，被可操作地連接到組成型啟動子或可誘導(dǎo)啟動子。在另一個實施例中，該啟動子并不是在所有細(xì)胞中表達(dá)，而僅在具美容功能的細(xì)胞中表達(dá)?？稍龠x或單選，能編碼一個核酸或多肽以維持具美容功能的細(xì)胞的多聚核苷酸，被可操作地連接到一個增強子。另外，在其他實施例中，能編碼一個核酸或多肽以維持具美容功能的細(xì)胞的多聚核苷酸，被可操作地連接到至少一段功能polyA序列，一段內(nèi)含子，一段終止序列，或一個cap位點中的一種。本發(fā)明中的方法和組合物被應(yīng)用于多種具有美容功能的細(xì)胞?？蛇x地，被改造的具美容功能的細(xì)胞至少包含角質(zhì)細(xì)胞，纖維母細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，或肌原纖維中的一種。本發(fā)明采用了多方法來操作所述的核酸(多聚核苷酸)構(gòu)建體。在一個實施例中， 所述多聚核苷酸是裸DNA引入具美容功能的細(xì)胞中。在具體實施例中，載體包括至少包括脂質(zhì)體，納米粒子，一種乳劑，一種觸變凝膠、或一種感官凝膠中的一種。因此，可選地，被引入具美容功能細(xì)胞的多聚核苷酸其載體至少包括脂質(zhì)體，納米粒子，一種乳劑，一種觸變凝膠，或一種感官凝膠中的一種。或者，引入具美容功能細(xì)胞的多聚核苷酸其通過一種油包水乳劑或水包油乳劑被導(dǎo)入。在另一實施例中，被引入具美容功能細(xì)胞的多聚核苷酸是通過至少顆粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(如金顆粒、微球)，電壓驅(qū)動轉(zhuǎn)移，無線電頻率灼燒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移，超聲波， 或微針中的一種被導(dǎo)入的。圖6顯示了本發(fā)明示例方法2的一個實施例。如，所述方法可能包括中受體對增加或維持具有美容功能細(xì)胞的需求評估的步驟4。該評估可能由一個皮膚科醫(yī)生或另一醫(yī)療保健專業(yè)人員執(zhí)行?；蛘撸撛u估可能被受者執(zhí)行(即自我評估)。接下來，所述方法可能包括對所要求的療法的性質(zhì)做出決定的步驟6。同樣，該評估可能由一個皮膚科醫(yī)生或另一醫(yī)療保健專業(yè)人員執(zhí)行?；蛘?，該評估可能被受者執(zhí)行 (即自我評估)。所述方法可進(jìn)一步包括準(zhǔn)備(或選擇)一個組合物的步驟8，該組合物包括所要求的用于治療的基因或它的混合物。在一實施例中，該步驟可能至少最初由一個皮膚科醫(yī)生或其他醫(yī)療保健專業(yè)人員執(zhí)行。一旦選出合適的組合物，受者(即自我評估)執(zhí)行該評估。 例如，受者可能要對購買何種可用的皮膚護理基因產(chǎn)品進(jìn)行評估。
所述方法可能額外包括對需治療的細(xì)胞或組織應(yīng)用所述組合物的步驟10。在一個實施例中，為增加和/或維持具美容功能的細(xì)胞，該組合物需要按要求施用一段時間。在此更詳細(xì)地，該組合物準(zhǔn)確的劑量和治療時間根據(jù)受者情況和應(yīng)用的組合物的性質(zhì)而變化。所述方法也可能包括對受體再評估以確定受體具有美容功能的細(xì)胞是否得到改善的步驟12。如果確定具美容功能的細(xì)胞其有提升的外觀表現(xiàn)14-YES，受者可以選擇是否使用組合物16。然而，如果確定具美容功能的細(xì)胞其并無提升的外觀表現(xiàn)14-N0，受者可以選擇重復(fù)所述過程，或許用一種不同的組合物。因此，本發(fā)明的實施例包括用于對具美容功能的細(xì)胞進(jìn)行基因修飾的方法和組合物。在具體實施例中，本發(fā)明可能包括用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染重組核酸構(gòu)建體進(jìn)入具有美容功能的細(xì)胞的方法和/或組合物。所述重組構(gòu)建體可能以基因組外元件或以直接插入基因組的形式并入具有美容功能的細(xì)胞在其他實施例中，所述方法和/或組合物可能直接提供多肽或其他生物分子(即不需通過基因表達(dá))。例如，使用了能增加或維持具有美容功能的細(xì)胞的生長因子混合物。 例如，在一個實施例中，所述多肽可能包括角化細(xì)胞生長因子(KGF)，胰島素樣生長因子 (IGF-I)，和/或轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β )，和/或此處詳述的多肽的混合物?；蚱渌皇褂玫亩嚯??；蛘?，所述重組構(gòu)建體可能編碼調(diào)控多核苷酸，如反義RNA或抑制RNAs (RNAi)以增加或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。所述的本發(fā)明方法和/或組合物被用于增加和/或維持和/或改善受體和/或受體組織和/或具有美容功能的細(xì)胞的外觀。多種生物分子和/或生理過程可應(yīng)用本發(fā)明所述方法和組合物進(jìn)行調(diào)整。在具體的實施例中，本發(fā)明所述的方法和組合物可產(chǎn)生至少如下美容效果中的一項減少皮膚下垂，減少皺紋長度，減少皺紋深度；增加皮膚緊致度，堅固度，色調(diào)，或彈性；增加皮膚水合作用和保水能力，水分流動(即產(chǎn)生水通道蛋白)和滲透平衡。調(diào)整至少一種在具有美容功能的細(xì)胞表達(dá)的多種生物分子其結(jié)果由本發(fā)明的組合物和/或方法的處理決定。例如，在一些具體實施例中，用本發(fā)明的方法和組合物也可以增加皮膚蛋白質(zhì)?；蛘哂帽景l(fā)明的方法和組合物也可以增加皮膚脂類水平，如膜脂，板層體脂，分泌的細(xì)胞間脂。因此，在具體實施例中，用本發(fā)明的方法和/或組合物可能增加細(xì)胞間基質(zhì)，和/或黏性和通訊多肽，包括但不限于膠原，彈性蛋白，角蛋白(包含角蛋白中間絲)，纖連蛋白，蛋白聚糖，層粘連蛋白，整合蛋白，核心蛋白聚糖，基膜聚醣，纖調(diào)蛋白 (和其他小分子富亮氨酸蛋白聚糖(SLRP’ s))，肌腱蛋白Ε，神經(jīng)纖維細(xì)絲，巢蛋白，肌間線蛋白，波形蛋白，外周蛋白，神經(jīng)酰胺，膽固醇，磷脂，鞘脂，“天然保濕因子”(NMF)，和粘多糖 (GAGs)如透明質(zhì)酸和硫酸皮膚素。在另一些實施例中，用本發(fā)明的方法和組合物可能會增加皮膚細(xì)胞能量的產(chǎn)生， 利用和保存；增加氧氣利用，增加皮膚細(xì)胞生命(例如延長成纖維細(xì)胞壽命)和/或生命周期(如減少衰老)。利用本發(fā)明的方法和組合物的實施例可額外地或可選地使以下至少一項水平提高皮膚細(xì)胞的免疫防御，熱休克/應(yīng)激反應(yīng)，消除自由基的抗氧化防御能力(如活性氧或羰基化合物)，和/或有毒防御(如環(huán)境污染物)；能提高對紫外線的保護和恢復(fù)能力。在其他實施例中，用本發(fā)明的方法和/或組合物可能會增加皮膚細(xì)胞通訊(如神經(jīng)肽介導(dǎo)的溝通)和皮膚細(xì)胞神經(jīng)支配；改善皮膚細(xì)胞的粘附性/粘結(jié)性(如橋粒完整性)； 改善礦物質(zhì)鈣和其他礦物質(zhì)代謝，促進(jìn)皮膚細(xì)胞更替(例如脫皮)；和/或改善皮膚細(xì)胞的生物鐘節(jié)奏。在具體實施例中，利用本發(fā)明的方法和組合物的至少可實現(xiàn)以下之一皮膚紋理改善，平滑，容光煥發(fā)，神采奕奕。例如，在具體實施例中，利用本發(fā)明的方法和/或組合物的至少可實現(xiàn)以下之一減少色斑和膚色不均(包括紅斑，色素沉著(如黃褐斑)和色素不足。另一些利用本發(fā)明的方法和組合物的實施例可使一下至少一項實現(xiàn)改善血管健康，包括改善血管的完整性(即減少變色的血液制品滲漏到皮膚)，改善血管張力，改善變色的血液副產(chǎn)品分解(如改善血鐵黃素分解，膽紅素加工和改善UGTla酶的功能)和減少“蜘蛛脈”和“靜脈曲張”。在其他實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的實施可改善DNA， RNA,線粒體，膜和其他皮膚細(xì)胞器健康；改善脂肪生成以增加脂肪總量用以保持皮膚豐滿及臉或其他身體其他部位看上去飽滿、輪廓分明或圓潤；改善真皮表皮交界處(“DEJ)。例如，最明顯的和可重復(fù)的皮膚老化生物學(xué)特性之一是真皮表皮交界處的扁平化。這個過程可能由于真皮乳頭狀突起減少和rarification所致。例如，30到90歲之間，這些皮膚層之間的交錯結(jié)合可能會減少50%以上(見，例如，Kirstin et al, Phytochemistry and Photobiology，2005，81 :581-587)。在具有美容功能的細(xì)胞中，有些特定的生物大分子能過量表達(dá)。因此，在其他實施例中，利用本發(fā)明的方法和/或組合物可用來減少這樣的有害生物大分子。例如，本發(fā)明的方法和/或組合物的具體實施例可增加脂肪分解，以減少“橘皮組織”，“凹陷”的皮膚；以及減少腹部和/或全身脂肪?；蛘撸景l(fā)明的方法和/或組合物的具體實施例可使孔徑降低； 減少干燥和/或剝落；減少油性和粉刺。本發(fā)明的方法和/或組合物的具體實施例也可能被用于減少肌肉收縮，平滑肌細(xì)胞和肌原纖維(例如，以減少表情皺紋)，或增加肌肉收縮， 平滑肌細(xì)胞和肌原纖維(如減少下垂)；和增加皮膚細(xì)胞的大小(如增大臉部肌肉，以防止臉龐“凹陷”)。此外，改造維持具有美容功能的細(xì)胞(例如皮膚細(xì)胞)是以維持其美觀為目的，不論紫外線光損傷(如增強核酸內(nèi)切酶，光解酶，熱休克蛋白，金屬硫蛋白和超氧化物歧化酶的表達(dá)水平，增加內(nèi)源性“遮光劑”以保護美觀)和其他的環(huán)境侵害(如污染物和刺激物)。本發(fā)明的方法和/或組合物的具體實施例也可能被用于增加色素沉著(例如古銅色肌膚的獲得，其不需通過紫外線照射而獲得免曬古銅色)或可選地，減少色素沉著(如 “美白”)。此外，皮膚細(xì)胞可能被改造，以永久或臨時的顏色和色素變化(如改變頭發(fā)或虹膜的顏色)，包括熒光，彩虹色，磷光，反射，折射，光致發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，和/或生物發(fā)光(如熒光素酶和熒光素反應(yīng))。另外，應(yīng)用本發(fā)明的方法和/或組合物的處理，美容改善和維持的好處至少包括以下中的一項減少創(chuàng)傷后疤痕的形成；改善激光后皮膚的重新修復(fù)，提高人對光敏藥物如ACCUTANE ,的防護，抗抑郁藥，RETIN-A MICRO 等類似藥物防護；減少光老化損傷；在激光換膚/脈沖光治療或任何利用光，激光，無線電波，電磁，超聲波的類似方法對皮膚細(xì)胞進(jìn)行處理后期改善美觀和加快愈合，在磨皮手術(shù)，化學(xué)換膚(種類繁多的化學(xué)換膚)后期改善美觀和愈合；減少疤痕(前攝和倒攝)，后期注射程序，包括BOTOX , Restylane, Juviderm 禾口類^以物。
22
在一些實施例中，盡管本方法和/或組合物可能應(yīng)用于皮膚，然而靶細(xì)胞也可以為其他類型的細(xì)胞。例如，指甲有關(guān)的細(xì)胞可能會被修飾，以增加指甲和角質(zhì)層的生長速率，減少開裂和損壞，提高了長度和厚度，降低壟起和剝落，降低粗糙度和鈍度，和更好的著色。頭發(fā)有關(guān)的細(xì)胞可能會被修飾，以提高生長速度，降低生長速度，減少發(fā)梢分叉，剝落和斷裂，改善可處理性，降低鈍度，改善光澤和光彩，增加密度(更厚)，降低密度(更薄)，磨蝕，增加的長度和厚度，提高柔軟度。上述任何一個美觀改善可能會產(chǎn)生的第二個好處是增加受者自信和提升受者心情。因此，在具體實施例中，本發(fā)明提供了能在具有美容功能的細(xì)胞增加表達(dá)有提高或維持功能的核酸或多肽的體內(nèi)或體外方法。例如，所述方法可能包括使用一種能編碼至少一個用于維持特定細(xì)胞具美容功能的核酸分子或多肽鏈的多聚核苷酸，將其應(yīng)用到至少一部分能發(fā)揮美容功效的細(xì)胞中，從而使上述核酸分子或多肽鏈在這些細(xì)胞中表達(dá)以提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。在本發(fā)明的方法和組合物可能使用了能編碼多種蛋白質(zhì)的多種基因。在本發(fā)明的方法和組合物的具體實施例中，所述多核苷酸構(gòu)建體可能編碼一個反義RNA或一個siRNA， 以作為一種抑制所述蛋白表達(dá)的方法。例如，某些特定生長因子減少表達(dá)可能使具有美容功能的細(xì)胞或其周圍細(xì)胞減少炎癥。另外，特定MMP蛋白減少表達(dá)可增加細(xì)胞的膠原含量。 在具體實施例中，所述的siRNA可使能提高細(xì)胞美觀的其他基因表達(dá)減少。在一具體實施例中，由所述轉(zhuǎn)染的重組多核苷酸編碼的所述核苷酸或多肽，可能包括角化細(xì)胞生長因子(如，KFG-I或KFG-2)，和/或KGF受體和輔因子或它的一個片段。 可選地或另外地，由所述轉(zhuǎn)染的重組多核苷酸編碼的所述核酸或多肽，可能至少包括一種轉(zhuǎn)化生長因子(Tre-α，IFG-β η，其他已知的TGF-β蛋白)和/或TGF受體和輔因子或源自它它的一段片段中的之一?？蛇x地或另外地，由所述轉(zhuǎn)染的重組多核苷酸編碼的所述核苷酸或多肽，可能包括一種胰島素樣生長因子(如IGF-1，IGF-2)或一段源自它的片段。 可選地或另外地，由所述轉(zhuǎn)染的重組多核苷酸編碼的所述核苷酸或多肽，可能包括至少一種血小板源性生長因子(如DGF-AA，PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC)或一段源自它的片段。在其他實施例中，由所述轉(zhuǎn)染的重組多核苷酸編碼的所述核苷酸或多肽，可能包括至少一項以下多肽或源自它的片段血管內(nèi)皮生長因子(如VEGF-A或VEGF-C)，肝細(xì)胞生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-l，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)GF-3，或FGF-22)；表皮生長因子GnEGF; 肝素結(jié)合EGF)，血小板衍化內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)；結(jié)締組織生長因子(如CTGF-1， CTGF-2)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，單核細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)，生長激素(GH)；抗血管生成因子(如Ang-Ι，如可溶性血小板因子-4，血小板反應(yīng)素如TSP-I和TSP-2，尿激酶型纖溶酶原激活物/受體拮抗劑，如， uPA/uPAR，血管抑素，內(nèi)皮抑素和鈣網(wǎng)蛋白)；一種轉(zhuǎn)錄因子Egr-I的，或缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF-1-α)。本發(fā)明的方法和組合物使用的其他被編碼的多肽或核酸包括一些具有合成， 降解，修復(fù)和抗氧化保護的酶功能多肽，包括一些具有結(jié)構(gòu)功能包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的多肽，包括具有細(xì)胞粘附和通信功能的多肽，所述表達(dá)的多肽的因子，輔助因子，受體，和在皮膚細(xì)胞內(nèi)為非轉(zhuǎn)染的基因組多核苷酸編碼活性多肽的啟動子。例如，本發(fā)明的組合物和方法中使用的多肽或核酸可能包括，或編碼(或與編碼序列互補)源自以下的多肽或片段 神經(jīng)營養(yǎng)因子(如神經(jīng)生長因子(NGFs)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)，NT-4和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，腫瘤壞死因子(TNFs)，肝細(xì)胞生長因子(HGFs)，干擾素(INFs)，白細(xì)胞介素 (ILSs-如IL-l，IL-2，IL-6，IL-8和IL-10)，血管生成素，分散因子(SFs)，趨化因子(CCs)， 抑制素(TGF-β家族的一部分)，脂肪因子(如瘦素，白細(xì)胞介素6(IL-6)，其他細(xì)胞因子， 脂聯(lián)素，補體成分，脂肪酶，纖溶酶原激活物抑制物1 (PAI-I)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS) 的蛋白質(zhì)和其他)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。在其他一些實施例中，所述多聚核苷酸(或與編碼序列互補)可能編碼CCN蛋白家族多肽(如富半胱氨酸的(CYR61/CNN1)，一種結(jié)締組織生長因子CNN2，Nov, WISP-I, WISP-2，和WISP-3)，整合素(6) β (1)，細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPk)，粘著斑激酶，樁蛋白，和/或Rac，p42/p44MAPKs，源自它的片段或生物活性物?；蛘?，也可使用這些基因的siRNA或反義分子。在其他實施例中，多聚核苷酸可能編碼(或與編碼序列互補)至少以下一中多肽(或由其衍生具有生物學(xué)活性的或其片段)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或轉(zhuǎn)錄激活物(STATs)，甲狀腺激素(TH)，促甲狀腺激素(TSH)，催乳素，甲狀旁腺激素(PTH)，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白 (PTHrP)，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)，神經(jīng)肽(如內(nèi)啡肽)他扎羅汀誘導(dǎo)基因(TKs)，細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白(CRABI^s)，原骨膠原，膠原(所有形式)，脯氨酸羥化酶和其他參與膠原合成(如羥賴氨酰半乳糖神經(jīng)酰轉(zhuǎn)移酶和半乳糖羥賴氨酰葡糖基轉(zhuǎn)移酶)，修復(fù)/維持和降解的酶，彈性蛋白原，彈性蛋白，賴氨酰氧化酶和其他參與彈性蛋白合成，修復(fù)/維持和降解的酶，原纖蛋白，fibulins蛋白，超氧化物歧化酶(如SOD 1，2和幻，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)，過氧化還原酶VI，血紅素氧酶(HO)，巰基蛋白還原酶，抗氧化蛋白2 (Aop2)金屬硫蛋白(MT)，谷胱甘肽(GSH)，輔酶(輔酶Q)，鈣聯(lián)蛋白，與角質(zhì)細(xì)胞脫屑有關(guān)的酶(如組織蛋白酶，比如組織蛋白酶-D和組織蛋白酶-G和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)，纖連蛋白，層粘連蛋白，整合蛋白，鈣粘素，凝集素細(xì)胞黏附分子(LEC-CAMs)，水通道蛋白，肌動蛋白，傘形蛋白，兜甲蛋白，聚角蛋白微絲，角質(zhì)/角蛋白，橋粒蛋白，斑蛋白，旁血小板溶蛋白，膜聯(lián)蛋白，參與的合成，修復(fù)/維持和降解細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞粘附和細(xì)胞通信(如涉及層粘連蛋白，纖維連接蛋白和角蛋白合成酶)，DNA的合成，修復(fù)/維持和降解酶(如限制性內(nèi)切酶，光解酶，端粒酶，和其他(ERCC3，PCNA, RPA, XPA, p53，所有這一切都是隨著年齡下降； Goukassian 等，F(xiàn)ASEB J.，2000，14，1325-1334 年)和端粒 3-prime 突出序列(寡聚 T)，應(yīng)激反應(yīng)和伴侶蛋白及相關(guān)元件/激活物/因子(如熱休克蛋白27，熱休克蛋白47，熱休克蛋白60，熱休克蛋白70，alphaB結(jié)晶，Grp78，Grp94，熱休克轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子(如HSFl，2， 4)產(chǎn)生的熱休克元素(HSE)，半胱氨酸串聯(lián)蛋白(csp)，BAG-I，Hip，CHIP，Hop和Tpr-2)，涉及合成，修復(fù)/維持和降解神經(jīng)酰胺和酰胺衍生物的酶(如絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，B-半乳糖腦苷脂酶，葡糖腦苷酯酶，酸性/中性/堿性SMASE (鞘磷脂酶)，酸性神經(jīng)鞘氨醇酶，SM脫酰酶，GC脫酰酶，pSAP，葡糖神經(jīng)酰胺合酶，神經(jīng)酰胺合酶和鞘磷脂合成酶)，涉及合成，修復(fù)/維持和降解透明質(zhì)酸的酶(如透明質(zhì)酸酶/透明質(zhì)酸合成酶1-3和其他)，參與膽固醇的合成，修復(fù)/維持和降解的酶，參與脂肪酸，三酸甘油酯，磷脂，縮醛磷脂，鞘脂，類花生酸 (包括花生四烯酸級聯(lián)，前列腺素和白三烯)的合成，修復(fù)/維持和降解的酶，維甲酸受體， 類固醇受體，激素受體(如雌激素受體)，甲狀腺受體，維生素D受體，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs的)，金合歡醇激活受體(FXR)，肝激活受體(LXR)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs 包括膠原酶(MMP-I)，明膠酶(例如，MMP-2和MMP-9)，彈性蛋白酶，質(zhì)溶解素，絲氨酸蛋白酶和膜-型MMPSs)，金屬蛋白酶組的織抑制劑(TIMPs)。在其他實施例中，所述多聚核苷酸可能編碼(或與編碼序列互補)一個多肽或能編碼以下物質(zhì)至少一個片段的核酸絲氨酸蛋白酶抑制劑(如皮膚衍生抗白細(xì)胞蛋白酶 (SKALP)，也稱為彈力素(包括pr印roelafin和proelafin)和分泌的白細(xì)胞蛋白酶抑制齊[J (SLPI))，MSX (同義詞包括 CH0X-8 ；GH0X-8 ；Η0ΜΕ0Β0Χ PROTEIN MSX-2 ；H0X-8 ；H0X-8. 1 ； H0X8 ；MSH HOMEO BOX H0M0L0G 2 ；MSX-I ；MSX-2 ；MSXl ；禾口 QU0X-7)，SMAD 通路，Smad3, C-ski，和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，心臟重復(fù)蛋白，雌激素-相應(yīng)B box蛋白(EBBP)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBI^s)，玻聯(lián)蛋白，卵泡抑素。RAC1，ADAMTS1蛋白酶，神經(jīng)元突觸前膜蛋白-1，轉(zhuǎn)錄因子AP-1，cjun, cFos, β-淀粉樣蛋白前體蛋白(sAPP)，β -連環(huán)蛋白，CHLl，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，DJ-1，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(如SREBP-I和 SREBP-2)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，硬脂酰輔酶A脫氫酶(SCD)，脂肪酸合成酶，羥甲基戊二酰-輔酶A合成酶(HMGCS)，CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α (C/EBP α )，C/EBP δ，F(xiàn)AS，硬脂酰輔酶一個去飽和酶-I(SCD-I)，涉及雌激素的合成(如芳香化酶)的酶，成纖維細(xì)胞生長因子同源因子(FHF)多肽，核心蛋白聚糖，基膜聚醣，纖調(diào)蛋白(和其他小富含亮氨酸重復(fù)蛋白聚糖)，多功能蛋白聚糖，雙糖鏈蛋白多糖，蛋白聚糖，短縮素，半乳凝素(如半乳糖凝集素-3與半乳糖凝集素-7)，硫酸肝素，串珠素，多配體聚糖-1，硫酸軟骨素，JUN-調(diào)節(jié)因素(如多效蛋白(PTN)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l(SDF-l) )，CXCR4(SDF-1受體)，抗凋亡蛋白 (如Bcl2和生存素)，轉(zhuǎn)錄因子核因子(NF) - κ B, 一氧化氮合酶，參與兒茶酚胺的合成和降解的酶，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(如Nrf2和Nrf3)，P21活化蛋白激酶4(PAK4)，參與合成溶血神經(jīng)鞘氨脂(SPC)的酶，脂酶，脂質(zhì)動員肽(如促脂解素和“解脂肽A和肽B”)，雙調(diào)蛋白，酪氨酸酶和其他參與黑色素，真黑素和褐黑素合成和降解的酶，黑素腎上腺皮質(zhì)激素(垂體肽類激素，包括促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和α，β和 Y黑色素細(xì)胞刺激激素(MSH)，激素原，阿黑皮素原，A-促黑激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，內(nèi)皮素1，環(huán)磷酸腺苷，PKCb，beyI，bey2，bey3，人黑素腎上腺皮質(zhì)激素_1受體(MClR)，OCAl (酪氨酸酶，TYR)，0CA2 (0CA2)，0CA3 (酪氨酸酶相關(guān)蛋白1，TYRP1)，和0CA4 (膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白， MATP)，c-Jun N-末端激酶激酶激酶(JNKKK 多肽如 MLK4, PAK4, PAK5 和 YSK2)，HiFl-α 調(diào)控基因(如ΒΝΙΡ3，缺氧誘導(dǎo)基因1，腺苷酸激酶4，半乳糖激酶，乳糖凝集素-3，凝溶膠蛋白，RhoA，Rho激酶，異構(gòu)核核糖核蛋白Hl和剪接因子和REV3)，α -SMA, Sl-P, GRO- α / CXCR-I, erbB，激活肝細(xì)胞生長因子(HGFA)，角質(zhì)細(xì)胞富含脯氨酸的蛋白(KPRP)，神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)阻滯劑(如GABA ( γ -氨基丁酸))，乙酰膽堿受體阻滯劑，蛇毒W(wǎng)aglerinl和箭毒 Curare0在其他實施例中，本發(fā)明發(fā)放和或組合物所述多聚核苷酸可能編碼(或與編碼序列互補)至少一個以下多肽(或源自它的片段)α 1-抗胰蛋白酶(一個不可逆轉(zhuǎn)的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，可改善靜脈曲張的靜脈強度)，在某些實施例中，其可能與ΜΜΡ-2 抑制聯(lián)合(ΜΜΡ-2在靜脈曲張組織中含量高)，激素敏感脂肪酶(HSL)，蛋白激酶A(激活 HSL)，甘油三酯脂酶(ATGL)，CGI-58 (最近發(fā)現(xiàn)的ATGL的輔激活因子，其促進(jìn)野生型和HSL 缺陷型WAT的TG水解酶活性，但在ATGL-缺陷型WAT中并不如此，表明ATGL是的CGI-58介導(dǎo)的激活脂肪分解的唯一目標(biāo)；同時，目前在小鼠WAT中，ATGL和HSL負(fù)責(zé)超過95%的TG 水解酶的活性)。此外已知的脂肪酶，心房利鈉肽，胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，抗感染和痤瘡皮膚抗菌肽(如SLPI，溶菌酶和防御素)，上游轉(zhuǎn)錄因子-I(USF-I)，δΝρ63α，Sirtl，血管緊張素(ANG) II 1型(ATI)和2型(AT2)受體，血管緊張素II，SHP-I (Src同源2含蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1)，和/或前列環(huán)素合酶(PGIQ可能由本發(fā)明的反義構(gòu)建體所編碼或為目標(biāo)。另外，本發(fā)明中的基因構(gòu)建體可能包括一個多核苷酸(或它的片段)，其能編碼 (或與編碼序列互補)至少一個以下參與美化或維持容貌的多肽(或它的片段)肌動蛋白，原骨膠原，或膠原片段(如KTTKS，多聚賴氨酸多肽)，彈性蛋白原或彈性蛋白片段， 層粘連蛋白片段，纖維連接蛋白片段，Matrixyl (Pal-KTTKS), Matrixyl 3000 (Pal-GHK 禾口 Pal-GQPR), RonaCare ASCIII ， CPC Peptide , Collaxyl , Peptide Vinci 01 , ALDENINE , Ameliox (肌肽二胎)，ANTARCTICINE ，BIOPEPTIDE CL , BioPeptide-EL , Kappa Elastin , SYN -C0LL，血小板反應(yīng)蛋白 T SP-I 片段，MY0XIN0L , DERMAXYL , copper peptides (GHK-Cu), CYTOKINOL LS 9028，Peptamide 6 , RIGIN , K0LLAREN , (肝細(xì)胞生長因子(HGF)活性片段)工761丨88"1，^11( 71"1，0丨？印衍(^ 2，Dermican (TSH片段)，和眾多大豆衍生的多肽和如CFTA的化妝品成分INCI數(shù)據(jù)庫中所列的。另外，可以放松肌肉的局部應(yīng)用的多肽包括SYN -AKE (ffaglerin 1模仿物)，VIAL0X (Curare模仿物)， ARGIRELINE (乙?；?3)，Leuphasyl ，和 SNAP_8 (同 SNAP-25)。另外，皮膚中的活性多肽詳見美國專利6586185。在其他實施例中，所述多聚核苷酸可能編碼用以降低，減慢和/或延遲具有美容功能細(xì)胞衰老的核酸和/或多肽，例如美國專利No. 6，953，664，以提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。在其他實施例中，所述多聚核苷酸可能編碼一個對應(yīng)于具美容功能的細(xì)胞中某蛋白的抗體，以提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。多肽的組合另外，在一些具體實施例中，由本發(fā)明的構(gòu)建體提供的多聚核苷酸包括一個編碼兩個或更多的多肽或核酸組合的多聚核苷酸。例如，在傷口愈合中，相對于個別地應(yīng)用生長因子，特定的生長因子組合可顯示協(xié)同的改善作用(見如，Lynch, 1999 J.Clin. Invest. ,84 :640-646 Jeschke 等，2004，Gene Therapy 11 :847-855 ；Sprugel 等，Wound Repair Regen. ,2004,12 :67-79 ；Endocrine Reviews, 2002 ；24 :737-767 ；Nabarrο, J. D.， 1987，Clin. Endocrinol.，26 :481-512 ；Ristow 等，1988，J. Cell Physiol.，137 :277-284 ； 0' Keefe 等，1988，J. Invest. Dermatol. ,90 2~7 ；Cook 等，J. Cell Physiol.，146 277-189)。可選地，構(gòu)建體可被操作以使所述多肽以1 1比例表達(dá)。或?qū)τ谒龈鞣N多肽可用其他比例(如 2 1，3 1,4 1,5 1,10 1,20 1,50 1,100 1,500 1， 或 1000 1)。例如，在一個具體實施例中，一個組合包含P⑶F和IGF。P⑶F可能包括已知的PDGF 亞型中的任何一個。同樣，IGF可包括其任何一個已知的亞型。構(gòu)建體可能被操作，以使所述多肽以1 1的比例表達(dá)。或者，可對于所述各蛋白使用其他比例(如2 1,3 1， 4 1,5 1,10 1,20 1,50 1,100 1,500 1 或 1000 1)。在一個實施例中， 構(gòu)建體被操作，結(jié)果PDGF-BB和IGF-I以2 1 (重量比)表達(dá)。或其他PDGF和/或IGF 和/或其他比例組合也可使用。同樣，可使用一個PDGF和TGF-α組合?；蛘撸墒褂肏GF和IGF組合。在其他實施例中，可使用PDGF和一個堿性FGF組合，或可使用HGF和堿性FGF 組合。在又一實施例中個，可使用GH和IGF-I或IGF-II組合。在一些特定實施例中，所述構(gòu)建體或多種構(gòu)建體可能編碼兩個以上蛋白。例如，在一些實施例中，PDGF和其他一些生長因子的組合可被使用。在一個實施例中，PDGF與KGF， IGF和IGFBP的組合可被使用?；蛘?，這些生長因子的次級組合可被使用。清除降解的膠原和/或其他碎片在其他一些實施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可編碼能幫助清除降解的生物大分子以維持和/或提高完整生物大分子合成的蛋白質(zhì)，這些生物大分子對提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程有重要作用。例如，在一個實施例中，所述構(gòu)建體編碼MMP-2和/或MMP-9以清除來自MMP-I的膠原碎片。所述構(gòu)建體使用完后，可使用能形成新膠原的構(gòu)建體。在一些特定實施例中，這些構(gòu)建體可編碼生長因子，膠原和/ 或 TIMP-I。另外地，在一些特定實施例中，本發(fā)明的構(gòu)建體所提供的多核苷酸可能包括一個編碼一個受體或受體組合(如KGF受體，TGF受體，F(xiàn)GF受體如FGFRiiib，等)的多核苷酸， 其作用物為具美容功能細(xì)胞中的多肽，生長因子和其他能提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的生物大分子(如如必須的輔因子或轉(zhuǎn)錄因子)。表汰的件質(zhì)本發(fā)明中的構(gòu)建體可被導(dǎo)入一個或多個類型的具美容功能的哺乳動物細(xì)胞中，例如，轉(zhuǎn)染未分化的“干”或“基礎(chǔ)”的皮膚細(xì)胞，于不同階段的正在分化的皮膚細(xì)胞，最后已分化的皮膚細(xì)胞。在一個實施例中，此技術(shù)可以將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞基因組，因此所述核酸或多肽可被細(xì)胞長期表達(dá)。所述能編碼至少一個核酸或多肽多核苷酸以維持具有美容功能的細(xì)胞，從而能提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多核苷酸，一旦被納入一個干細(xì)胞的基因組，它便可遺傳和在細(xì)胞后代中表達(dá)，如來源于未分化的 “干”或“基礎(chǔ)”細(xì)胞的角質(zhì)細(xì)胞或纖維母細(xì)胞。例如，可能會使用一個綜合載體(如如逆轉(zhuǎn)錄病毒，AAV，“睡美人”轉(zhuǎn)座子，或細(xì)菌噬菌體整合酶，如Φ031，或類似物，因此，靶細(xì)胞可以是任何具美容功能的細(xì)胞。在其他實施例中，所述技術(shù)可使核酸瞬時轉(zhuǎn)化到具有美容功能的細(xì)胞的，使核酸或多肽可由細(xì)胞瞬時表達(dá)?？蛇x地，這樣的表達(dá)可能持續(xù)數(shù)秒，數(shù)分鐘，數(shù)小時，數(shù)天，數(shù)周， 數(shù)月或數(shù)年。在其他實施例中，表達(dá)瞬態(tài)是由于所述細(xì)胞的生物學(xué)特性。以皮膚細(xì)胞為例，據(jù)終端分化，細(xì)胞更新可能會導(dǎo)致被改造細(xì)胞的減少，例如正在分化的角化細(xì)胞向上移向表皮的外圍以形成鱗狀細(xì)胞并最終因脫皮而消失?；蛘?，干細(xì)胞可能被修飾，但能提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多核苷酸可能直到細(xì)胞分化階段才表達(dá)。因此，雖然干細(xì)胞系中存在基因修飾，核酸或多肽的表達(dá)可能取決于子代細(xì)胞的發(fā)育階段，從而使修飾的瞬態(tài)取決于分化階段(即，要么局限于干細(xì)胞階段，要么是分化的細(xì)胞階段)。在某些實施例中，表達(dá)的核酸和/或多肽可能在具美容功能的干細(xì)胞，分化細(xì)胞和已分化細(xì)胞任意組合之間發(fā)揮旁分泌和/或自分泌的作用。例如，轉(zhuǎn)染的表皮成纖維細(xì)胞干細(xì)胞可能表達(dá)和分泌生長因子(如角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF))，其對正在分化的表皮角質(zhì)細(xì)胞具有自分泌的效果。另一例，所表達(dá)的核酸和/或多肽被用于將通常的旁分泌功能轉(zhuǎn)變?yōu)樽苑置诠δ?。例如，皮膚成纖維細(xì)胞通常表達(dá)和分泌角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，隨后擴散到表皮角質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮旁分泌的效果。然而，能編碼KGF的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染表皮角質(zhì)細(xì)胞后， 隨后的表達(dá)和分泌的KGF改變?yōu)樽苑置诠δ芏皇荎GF的旁分泌功能。給予的位點所述構(gòu)建體被導(dǎo)入受者一個或多個部位，從而能提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。被實施的部可能包括前額，頭皮，毛囊，上眼瞼，下眼瞼， 眉毛，睫毛，眼眶下和眼周區(qū)(包括典型的“魚尾紋”區(qū))，鬟角，鼻，鼻梁，面頰，舌，鼻唇溝， 嘴唇和periobicular包括“下頌”區(qū)，下頌線，耳朵，頸部，胸部，三頭肌下，手背，背部，腹部，兩側(cè)，臀部，大腿前和背部，膝蓋和其他受者具美容功能的細(xì)胞。在一個實施例中，所述構(gòu)建體被注射進(jìn)血液，例如通過受體介導(dǎo)輸送系統(tǒng)或組織特異性調(diào)控序列(如啟動子和/ 或信號序列)，表達(dá)的目的多肽作用于特定的具有美容功能的細(xì)胞受體。名人基因在某些實施例中，本發(fā)明的構(gòu)建體序列，可以從“名人”和公眾人物如著名的男演員，女演員，音樂家，畫家，作家，政治家，皇室成員，運動員，商界領(lǐng)袖，部長，社會活動家，科學(xué)家，英雄人物，及其他類似人物，無論生者或死者任何可用的DNA來源，或來自于上述“名人”的家族直系血親(例如，著名歌手的女兒)。在其他實施例中，本發(fā)明所述構(gòu)建體的序列可來自普遍多態(tài)性來自總哺乳動物種群，來自一個沒有接受該美容修飾(如將妻子的構(gòu)建體拷貝應(yīng)用于丈夫，反之亦然)的哺乳動物，從相同皮膚區(qū)域或更優(yōu)的皮膚區(qū)域自體移植到修飾區(qū)域，被轉(zhuǎn)染哺乳動物的直系血親(如將孩子的構(gòu)建體拷貝應(yīng)用于父母)，被轉(zhuǎn)染哺乳動物的配偶或同伴；其他國民或“種族”(如；來自法國人男性的構(gòu)建體拷貝轉(zhuǎn)染的美國人男性)；異性(婦女可能希望得到來自于著名男演員的構(gòu)建體)；或任何非哺乳動物來源(如藻類，酵母，真菌，病毒，植物，魚類和昆蟲)構(gòu)造的序列)的構(gòu)建體序列分子構(gòu)建體在某些實施例中，本發(fā)明的構(gòu)建體可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)提高導(dǎo)入和隨后表達(dá)，包括利用基因構(gòu)建體改造包括修飾內(nèi)核苷酸(internucleotides)，目標(biāo)表達(dá)載體(如角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的干細(xì)胞)，核靶，使用細(xì)胞特定的，或改良的調(diào)控啟動子和其他元件(如增強子).本發(fā)明的構(gòu)建體可能包含其他的元件以提高參與增加或/和維持具有美容功能細(xì)胞的多核苷酸和多肽的表達(dá)和/或適當(dāng)?shù)墓δ?。因此，在一些實施例中，所述?gòu)建體可能包括組成型的或可誘導(dǎo)的啟動子，其可操作地連接到能表達(dá)多核苷酸或多肽的特定核酸上，而所述多核苷酸或多肽能維持具有美容功能的細(xì)胞，從而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。在其他實施例中，所述構(gòu)建體可能包括增強子，其可操作地連接到多核苷酸或多肽上，而所述多核苷酸或多肽能維持具有美容功能的細(xì)胞，從而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。另外地或可選地，所述構(gòu)建體可能包括切割位點序列，內(nèi)含子序列，帽位點，或功能polyA元件，其可操作地連接到多核苷酸或多肽上，而所述多核苷酸或多肽能維持具有美容功能的細(xì)胞，從而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程。
給予方法本發(fā)明采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，將構(gòu)建體應(yīng)用于具有美容功能的細(xì)胞。在受體細(xì)胞的必須的發(fā)育和生理功能未被破壞的前提下，多種已知最先進(jìn)的基因?qū)爰?xì)胞技術(shù)被相應(yīng)地應(yīng)用于本發(fā)明中。基因轉(zhuǎn)化具有美容功能的細(xì)胞的方法可能包括脂質(zhì)遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體或雙相囊泡。此外，還使用乳劑滲透具有美容功能的細(xì)胞，如陽離子納米粒子，醇/碳氟微乳液，或油 /水和水/油型納米乳液?；蛘撸捎枚嗦?lián)體。多聯(lián)體，在體外試驗中，用T4連接酶處理成熟DNA能夠增強轉(zhuǎn)染效率，如同一次轉(zhuǎn)染實驗并不能轉(zhuǎn)入一個以上的分子一樣，轉(zhuǎn)染通常只能轉(zhuǎn)入較小的分子，這可能是因為轉(zhuǎn)染分子的尾部結(jié)構(gòu)起了重要作用。在其他實施例中，可使用粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在具體實施例中，可用電磁輻射提高構(gòu)建體進(jìn)入具有美容功能的細(xì)胞的能力。所述方法可能包含利用無線電頻率形成微通道，電穿孔，離子電滲，或使用電整合(electroincorporation)。該操作可能還應(yīng)用了物理導(dǎo)入方法例如顯微注射無修飾的DNA。所述技術(shù)使參與維持或修復(fù)皮膚的多核苷酸或多肽瞬態(tài)表達(dá)。或，可使用長時效基因表達(dá)技術(shù)。例如，可使用含目的核酸序列的病毒或噬菌體轉(zhuǎn)染的分子技術(shù)。同時，其他技術(shù)如如細(xì)胞融合，染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)球融合，或轉(zhuǎn)座子都包含在本發(fā)明的方法和組合物中。按已知的最先進(jìn)技術(shù)， 化學(xué)和物理的滲透促進(jìn)劑(如，加熱，前處理微晶換膚，吸留)及任何包含于本發(fā)明的方法和組合物可被使用。因此，本發(fā)明的實施例承認(rèn)了基因修飾具美容功能的細(xì)胞的潛力，其可作為改善受體美觀的方法?；蛐揎椌呙廊莨δ艿募?xì)胞提供了瞬態(tài)或長效改造細(xì)胞的方法。 niM^ii^^KM / ^mmHmmm令人不悅的容貌改變，如皮膚下垂，變薄，起皺通常是由于皮膚蛋白如膠原，彈性蛋白，或其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和蛋白聚糖的表達(dá)大量且穩(wěn)定減少所致。因此，取代這些蛋白質(zhì)或阻止這些蛋白質(zhì)的減少，成為一個潛在的有效的策略，以維持或改善皮膚的外觀和健康。本文所述的例子描述了五個重組載體構(gòu)建體的設(shè)計，所述構(gòu)建體編碼的蛋白旨在提高細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定和支持改善的皮膚外觀。這些蛋白質(zhì)為膠原，彈性蛋白，EC-SOD，TIMP-I 和角質(zhì)細(xì)胞生長因子(例如，KGF-1)。以下詳細(xì)討論這些蛋白質(zhì)對皮膚生理的作用。其他蛋白質(zhì)和/或多肽也可以使用本發(fā)明的方法和組合物。例如，皮膚細(xì)胞表達(dá)各種可能對組織的修復(fù)和維護有重要作用的不同的蛋白質(zhì)和其他因子。因此，角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL-1-α，IL-I-β，IL-Ira 的，IL-3，IL-6，IL-8，IL-10 和 IL-18)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，單核細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF的)，粒/單核細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF- α和TGF- β )，血小板衍生生長因子(PDGF)，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，干擾素(例如，INF-α，β和 Y)，胰島素樣生長因子(IGF-I)，和成纖維細(xì)胞生長因子(堿性FGF，F(xiàn)GF-22)。此外，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF-l，KGF-2) ,TGF-β -l，TGF-0 -2和TGF-β -3，結(jié)締組織生長因子(CTGF)，F(xiàn)GF-2(堿性)，PDGF-A, IGF-1，血管內(nèi)皮生長因子，肝細(xì)胞生長因子(HGF)， IL-6，IL-8，TNF-a和GM-CSF，G-CSF，F(xiàn)GF-22，和IGF-1。在另一個實施例中，目的核苷酸是HIF-I-α轉(zhuǎn)錄因子。此外，EGR-I轉(zhuǎn)錄因子多肽，或其一個生物活性片段，或核苷酸編碼的類似多肽，已有報道可用于治療傷口(美國專利號6689758)。因此，這些多肽，或其衍生的功能物，在本發(fā)明的方法和/或組合物的實施例中可用單獨或組合使用。膠原在一個實施例中，所述參與保養(yǎng)具有美容功能的細(xì)胞而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多肽，可能是一個膠原多肽或其功能衍生物。膠原是構(gòu)成人體的組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要纖維蛋白。I型膠原是人體皮膚的主要細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)組分，是由兩個α -1和1個α -2鏈組成的三股螺旋結(jié)構(gòu)(Myllyharju和Kivirikko， 2001, Ann. Med. ,33 :7-21)。這種原骨膠原鏈?zhǔn)怯善つw的成纖維細(xì)胞和身體其他組織的合成的。一旦合成，原骨膠原鏈裂解，以便聚集和形成較大的膠原纖維以組成ECM的關(guān)鍵組分。 骨原膠原纖維退化或產(chǎn)量不足可導(dǎo)致減少EMC結(jié)構(gòu)完整性和導(dǎo)致如皮膚等上覆組織的物理變化。膠原的喪失或退化是正常老化的一部分，但它也是光損傷皮膚中觀察到的主要變化之一 (Lavker,1995, Cutaneous Aging :chronologic versus photoaging, In PhotoaRinR, Ed. , Gilchrest, B. A. , Cambridge MA, Blackwell Science, pp. 123-135 ； Fligiel ^,2003, J. Invest. Dermatol. ，120 :842-848 ；Varani ，2001， Am. J. Pathol.， 158 :931-942).。據(jù)報道，變老的，防曬的皮膚(Varani 等，2000，J. Invest. Dermatol.，114 480-486)和光損傷皮膚(Griffiths 等，1993，N. Engl. J. Med.，329 :530-535)其原蛋白的合成持續(xù)下調(diào)。一些機制表明，正常年齡的膠原損失和由光損傷引起的膠原損失，與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的增加和皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)量的減少有關(guān)(如Fisher等，1996，Nature, 379 :335-338 ；Fisher 等，1997，N. Eng. J. Med.，337 :1419-1428 ；Millis 等，1992，Exp. Cell Res.，201 :373-379 ；Burke 等，1994，Exp. Gerontol.，29 :37-53 ；Varani 等，2000)。另一種與膠原減少至少部分相關(guān)的機制是，與年齡有關(guān)的皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成減少。因此， 已證明，老化皮膚的I型膠原的數(shù)量比年輕的成纖維細(xì)胞所合成的I型膠原數(shù)量低(Varani 等，2006)。在這項研究中，在I型膠原的合成和含量的減少是與膠原束空間較大及成纖維細(xì)胞和膠原纖絲之間的接觸較少有關(guān)，這表明纖維母細(xì)胞機械張力減少。此前的研究表明， 機械張力降低時，膠原的生產(chǎn)可能會下降，基質(zhì)MMf3S的生產(chǎn)可能會增加(Lambert等，1992， Lab. Invest. 66 :444-451 ；Delvoye 等，1991，J. Invest. Dermatol. ,97 :898-902)。因此，與年齡有關(guān)的成纖維細(xì)胞膠原的合成減少可能會導(dǎo)致在ECM減少機械張力，從而進(jìn)一步降低膠原的生產(chǎn)(Varani等，2006)。通過對皮膚補充I型原骨膠原基因拷貝，膠原產(chǎn)量可能會提高，可提供增加在ECM機械張力的潛力，從而隨后可使現(xiàn)有的成纖維細(xì)胞提高膠原產(chǎn)量。彈性蛋白在一個實施例中，所述參與保養(yǎng)具有美容功能的細(xì)胞而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多肽，可能是一個彈性蛋白多肽或其功能衍生物。彈性蛋白是ECM另一個極為重要的組成部分，提供皮膚彈力和恢復(fù)力(綜述=Mithieux ^P Weiss, 2005, Adv. Protein Chem.，70 :437-461)。彈性蛋白合成需通過其前體分子彈性蛋白原的合成和賴氨酰氧化酶介導(dǎo)的交聯(lián)。彈性蛋白是一個持久的分子，其構(gòu)成90%的彈性纖維和構(gòu)成皮膚干重的2-5%。彈性蛋白和彈性纖維的形成主要發(fā)生在胎兒發(fā)育和出生后不久。除了損傷反應(yīng)，成年期彈性蛋白基本不合成。雖然彈性蛋白的主要功能是提供組
30織彈性，但彈性蛋白-層粘連蛋白受體(ELR)已報道參與的皮膚成纖維細(xì)胞增殖(Groult 等，1991，Cell Biochem. Funct.，9 171-182)。正常老化一直伴隨著彈性纖維的退化和喪失 (Braverman 等，1982，J. Invest. Dermatol. ,78 :434-443 ；Ashcroft 等，1997a, J. Pathol.， 183 :80-89)。據(jù)報道之間的30個人-50歲，形成囊腫和陷窩是主要的異常(Braverman等， 1982)。在50-70歲個體中能觀察到多孔纖維的形成，但在70歲以上的人則更加頻繁。同樣，有研究表明，年長者的防曬部位皮膚下表皮部區(qū)域有破碎的彈性蛋白纖維，，在下表皮層以下也有破碎的彈性纖維片段(Ashcroft等，1997a)。更多最近的研究已經(jīng)證實，隨著年齡的增長皮膚彈性蛋白含量減少。據(jù)報道，防曬皮膚的彈性蛋白染色密度從生命的第十年的 49%下降到第九十年的 30% (El-Domyati 等，2002，Exp. Dermatol.，11 :398-405)。同樣，據(jù)報道，臀部皮膚(防曬的)彈性蛋白的含量在20歲至80歲間減少51% (Seite等， 2006，J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol.，20 :980-987)。有趣的是，這些作者還報道，雖然面部皮膚(嚴(yán)重太陽暴露)的彈性蛋白的含量在50至70歲之間減少44%，但在前臂皮膚 (中等強度太陽暴露)卻沒有觀察到彈性蛋白含量的變化。這種隨著年齡而增加的皮膚彈性蛋白損失是與皮膚的彈性和恢復(fù)力降低相關(guān)的主要因素之一，會導(dǎo)致皺紋和下垂。提供彈性蛋白基因的外源性拷貝可能會增加新的彈性蛋白的生產(chǎn)，并有助于抵消正常的隨年齡減少的彈性蛋白損失。這反過來又可以幫助改善皮膚的外觀。金屬蛋白酶-1組織抑制劑(TIMP-I)在一個實施例中，所述參與保養(yǎng)具有美容功能的細(xì)胞而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多肽，可能是金屬蛋白酶-1組織抑制劑(TIMP-I) 或其功能衍生物?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組酶(膠原酶，明膠酶和質(zhì)溶解素)，參與消化和重組的ECM(ffoessner, 1994，Ann. NY Acad. Sci.，732 :11-30)，且在皮膚中大量存在 (綜述 Kahari 和 Saarialho-Kere，1997，Exp. Dermatol.，6 :199-214)。MMP 活性由金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)(Birkedal 等，1993，Crit. Rev. Oral Biol. Med.，4 :197-250)。 ECM的整體更新率是由組織中MMP和TIMP的比例起作用。在正常的慢性老化期間，MMP水平，尤其是MMP-I水平，在皮膚中增多(Ashcroft 等，1997b，Cell Tissue Res.，290 :581-591 ；Varani 等，2000)。光老化過程也能觀察到皮膚MMP相類似的增多。使用紫外線(UV)誘導(dǎo)的皮膚光老化模型證明，MMP-I可能是主要負(fù)責(zé)在皮膚膠原降解的酶(Brennnan 等，2003，Photochem. Photobiol. ,78 :43-48)。與增加的 MMP含量相比，隨著正常年齡增長，皮膚TIMP-I水平可能會降低。隨年齡增長，這種MMP水平不斷提高和TIMP-I水平的下降的組合，可導(dǎo)致皮膚的膠原含量的整體下降。隨著膠原的減少和隨后支持它的ECM的減少，皮膚顯示出典型的外在老化特征包括細(xì)紋和皺紋的出現(xiàn)和堅固度的降低。最近的研究報告，各種MMP抑制劑可減少面部皮膚皺紋和支持膠原的生 Γ (McDaniel ^,2005, J. Cosmetic Derm. ,4 :167-173 ；Moon φ, 2006, Phytomedicine 13 707-711 ；Park 等，2006，Photochem Photobiol. ,82 :574-578)。作為以上數(shù)據(jù)的結(jié)論，如可抑制皮膚 MMP 的活性的 EquiStat(Engelhard)和 ECM-Protect (Atrium Biotechnologies) 化妝品成分已成功在市場推廣。本發(fā)明的實施例可提高TIMP-I合成。通過提高TIMP-I產(chǎn)量，皮膚能夠減少內(nèi)源性Miffs對皮膚的影響在本發(fā)明的方法和或組合物的實施例中，。當(dāng)如上所述的膠原基因構(gòu)建體和TIMP-I基因構(gòu)建體同時轉(zhuǎn)染，可以生成一個雙管齊下的措施以改善皮膚的外觀。一方面，膠原基因構(gòu)建體可加強膠原的生產(chǎn)以對皮膚的ECM提供額外支持，而MMP-I構(gòu)建體的使用將能保護新的和現(xiàn)有的膠原免受因MMP活性而導(dǎo)致的降解。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(S0D-3)在一個實施例中，所述參與保養(yǎng)具有美容功能的細(xì)胞而提高或/和維持對外貌產(chǎn)生積極效果的生物化學(xué)或/和生理過程的多肽，可能是一個細(xì)胞外超氧化物歧化酶(SODj)或其功能衍生物。皮膚以及許多其他組織含有內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)，其包含三個強有力的酶超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和過氧化氫酶 (Steenvoorden 等，1997，J. Photochem Photobiol B :Biology 41 :1-10 ；Afaq 禾口 Mukhtar， 2001，J. Photochem Photobiol B =Biology, 63 :61-69) 超氧化物歧化酶催化過氧化物轉(zhuǎn)化為低毒性的過氧化氫，其隨后被谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶催化為水和氧。這些酶的變化已經(jīng)在衰老和光老化中被報導(dǎo)。已經(jīng)證實表皮中SOD和過氧化氫酶的含量比真皮高，而在年輕和衰老皮膚真皮中GPX的含量均比表皮高(Rhie et al,2001, J. Invest. Dermatol.，117 :1212-1217)。在天然的和光老化的皮膚中SOD或GPX的含量均沒有明顯變化，但是過氧化氫酶的含量在表皮中增加了、在真皮中減少了(Miie等，2001)。與此相反，有報導(dǎo)稱光老化會導(dǎo)致角質(zhì)層中這三種抗氧化酶的大量減少以及表皮中CuSI-SOD 的減少(Sander等，2002，J. Invest. Dermatol.，118 :618-625)。這種抗氧化酶活性的喪失與光老化皮膚上層真皮中氧化蛋白的增加是一致的。超氧化物歧化酶在皮膚中有三種存在形式(Cu/Zn-SOD，Mn-SOD和EC-S0D)。最近的研究表明EC-SOD可能在抗氧化和抗衰老方面有重要作用。細(xì)胞外SOD mRNA在真皮和表皮中都存在，盡管真皮中的含量要更高，而EC-SOD蛋白在表皮和真皮中都高水平表達(dá) (Choung 等，2004，Exp. Dermatol, 13 :691-699)。有研究表明暴露于 UVA 和 UVB 下 EC-S0D 的mRNA的表達(dá)會增加(Choimg等，2004)。其他人則檢測了在正常和超氧情況下成纖維細(xì)胞中抗氧化基因的表達(dá)(Serra等，2003，J.Biol. Chem.，278 :6824-6830)。在這些研究中， 超氧引起EC-SOD基因的表達(dá)，特別在具有高抗氧化活性的成纖維細(xì)胞中。而且，EC-SOD 的表達(dá)與端粒酶的縮短成反比，因此EC-SOD表達(dá)的增加可以減慢端粒酶的縮短，使成纖維細(xì)胞的復(fù)制生命周期延長(Serra等，2003)。也有研究表明胞外SOD對I型膠原有直接的保護作用。EC-SOD可以通過C端的肝素結(jié)合區(qū)與I型膠原直接結(jié)合(Petersen等，2004， J.Biol. Chem.，279 :13705-13710)。另外，這些科學(xué)家報導(dǎo)結(jié)合的EC-S0D可以阻止氧化造成的I型膠原的斷裂。除了潛在的皮膚保護作用，EC-SOD也有抗炎癥功效(Ha等，2006， Biochem. Biophys. Res. Comm.，348 :450-458)，可以減少化學(xué)因素誘導(dǎo)的腫瘤形成的可能性 (Kim等，2005，Oncol. Res.，15 :333-341)，可以減緩膠原引起的關(guān)節(jié)炎的一些癥狀(Iyama et al,2001, Arthritis Rheum. ,44 :2160-2167 ；Ross ^,2004, Arthritis Rheum. ,50 3702-3711)。外在局部給予EC-SOD基因可能與內(nèi)源EC-SOD mRNA的過表達(dá)有相同效果，如增加EC-SOD的表達(dá)量、增強細(xì)胞的抗氧化能力、延長細(xì)胞壽命等。通過延長皮膚成纖維細(xì)胞的壽命和增強其抗氧化活性，這些細(xì)胞產(chǎn)生和維持對健康皮膚所必須的ECM的能力就會增強。而且，EC-SOD對膠原的直接保護作用可以保護皮膚的膠原免受與皮膚衰老和光老化有關(guān)的氧化損傷。KGF
在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)。KGF-I (或FGF-7)是一個肝素結(jié)合生長因子，可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生(例如參見，au dem Keller, Eur. J. Cell Biol.，2004，11-12,607-612)。KGF也可以刺激膠原和/或彈性蛋白的產(chǎn)生，這兩種蛋白對維持皮膚和其他有外在功能的組織的健康有重要作用。這個^5-28kDa的蛋白C 端的三分之二與FGF家族的8個蛋白的同源性是30-45% (Rubin et al，Cell Biol. Int., 1995，19，399-411)。KGF是由一系列的間葉細(xì)胞產(chǎn)生的，上皮細(xì)胞不產(chǎn)生KGF。上皮細(xì)胞會表達(dá)高親和力的KGF受體，F(xiàn)GFRl- IIIb,它是KGF結(jié)合的唯一的FGF受體(Grazu-Bilska et al，2003 ；Werner et al, Cytokin Growth Factor Rev.，1998，9，153-65)。KGF 可以與其他生長因子共同作用。因此，KGF cDNA的非病毒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到傷口可以使VEGF和IGF-I的表達(dá)增加(Grazu-Bilska et al，2003)。在一案例中，可通過大量給予KGF來增加IGF-I、 VEGF和PDGF的表達(dá)。KGF-2 (也叫FGF-12)與KGF有57%的同源性，與KGF-I有相似的傷口治愈功能。 另外，已有報道指出KGF的切短突變——KGFdesl_M可增強細(xì)胞的有絲分裂活性(U. S. Patent No. 5，677，278)。Itepifermin是一個用于治療慢性靜脈郁血性潰瘍的切短的重組人 KGF-2 (Robson et ah, Wound Repair Regen. ,2001,9,347-52 ；Fricker, Mo I. Med. Today, 1998,4,229) 0另外，最近的研究表明樹突狀Y-δ上皮T細(xì)胞(DETCs)可產(chǎn)生FGF-7和 FGF-12，在傷口治愈中可促進(jìn)角化細(xì)胞的增殖(Baum和Arpey，Demato 1. Surg.，2005，31， 674-686 ；Born et ah, Nat.Med,2002,8,560-1 Jaeson, Science,2002，296 :747-9)。例如，包括KGF-I、KGF-2及其類似物的多核苷酸載體已經(jīng)在美國專利 (Nos. 5，731，170 ;5，677，278 ;5，814，605，；6，228，839 以及 6，916，786)中被描述。這些序列也許能夠被應(yīng)用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體，還有被縮短了的序列比如Kepivance (palifermin)，它不同于內(nèi)源性的人KGF，因為它起始序列N端的23個氨基酸被刪除了以增強其穩(wěn)定性。IGF在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是胰島素樣生長因子(IGF)。胰島素樣生長因子主要在肝臟產(chǎn)生， 但是通過自分泌機制也有可能在所有細(xì)胞中產(chǎn)生。IGF-I和IGF-2可能參與了組織生長調(diào)節(jié)、發(fā)育和再生(參考Grazul-Bilska et ah, 2003) 0 IGF-I和PDGF可能一起作用增強皮膚傷口的愈合、骨骼再生以及牙周傷口痊愈。例如，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移非常少量的IGF-lcDNA 能夠提高具有燒傷傷口的大鼠的再上皮化速度(Pierre et ah, J. Burn Care Rehab.，1997， 18,287-91 Jeschke et ah,Gene Therapy，1999，6，1015-1020)。IGF-I 能夠和生長激素通過協(xié)同方式相互作用(Meyer et ah，J. Trauma，1996，41，1008-12)。在某些實施例中，IGF-I 也可能升高細(xì)胞的脂濃度。這將可能有利于增強組織的豐滿度，例如面部肌膚或者嘴唇。TGF-β在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)。TGF-β由幾種類型的細(xì)胞合成，包括血小板、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞。TGF-β在成纖維細(xì)胞中可能刺激纖連蛋白和膠原的產(chǎn)生，以及促進(jìn)這些蛋白多聚體進(jìn)入胞外基質(zhì)中(ServoicbClin.Pod. Med. Surg.，1991，8，937-53)。TGF-β 的應(yīng)用有利于傷口愈合(Graham et al，J. Wound Care，1998，7，536-40)。因此，TGF-β可能參與了增強和調(diào)節(jié)皮膚組織的作用。HBF-I在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是一種缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)。HIF-I是一種DNA結(jié)合蛋白，它能夠激活具有HIF-I結(jié)合位點的基因的表達(dá)。能夠被HIF-I激活的基因包括VEGF、紅細(xì)胞生成素以及糖酵解基因。HIF-I由兩個亞基組成，HIF-I-α和HIF-1-β。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)每一個亞基的變體都可以被用來滅活HIF-1，即通過形成沒有功能的HIF-I 二聚體。因此，在另一種實施方案中，參與維持細(xì)胞美容功能的核苷酸或者多肽就是能夠編碼HIF-I-α、HIF-I-β 以及它們的變體的多肽，或者是包括HIF-I結(jié)合位點的核苷酸。這樣的序列能夠在美國專利(No. 5,882,914)中找到。其他與皮膚功能相關(guān)的多肽在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是表皮生長因子(EGF)。EGF是一個6KD的分子，與TGF-α有30% 的氨基酸同源性。EGF由血小板產(chǎn)生，在傷口愈合過程中濃度很高。EGF可以提高傷口上皮化速率，也可以通過阻止傷口過度收縮而減少傷疤的形成。EGF可能與KFG、PDGF以及其他生長因子共同維持和/或修復(fù)皮膚組織。在另外一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽可能是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員(FGF))。FGF由幾個相關(guān)聯(lián)的多肽組成，包括酸性FGF(aFGF或者FGF-I)、堿性FGF(bFGF或FGF-2)、幾個癌基因 (int-2，hst/K-FGF，F(xiàn)GF-5)以及KGF (見上面討論)。在皮膚中FGF-I、FGF_2以及KGF被認(rèn)為是最重要的成纖維生長因子。在其他實施例中，也有可能用到FGF-IO和/或FGF-22 (參考 au dem Keller, Eur. J. Cell Biol.，2004，11-12，607-612)。FGFs 能夠刺激血管生成， 以及與傷口愈合相關(guān)的許多細(xì)胞的增殖和/或遷移，包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及一些特別的細(xì)胞種類，比如軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞。FGF-2還可以刺激膠原的合成，上皮形成，纖連蛋白以及蛋白多糖的合成(參考例如， Grazu-Bilska,2003)。在另一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是血小板源生長因子(例如，PDGF 4々^8，88，0及其他)。？06 是間充質(zhì)來源細(xì)胞的強有力的有絲分裂原，并且能夠促進(jìn)傷口愈合。PDGF促進(jìn)成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生，從而有利于成纖維細(xì)胞的遷移以及改變傷口基質(zhì)。例如，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)血小板源生長因子(PDGF)能夠促進(jìn)傷口愈合(Eming et al,Hum. Gene Ther.， 1998，9，529-539)。在另一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。VEGF高度保守且與PDGF具有高度的結(jié)構(gòu)同源性。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原和化學(xué)引誘物，具有強有力的體內(nèi)血管生成活性(參考Grazu-Bi 1 ska，2003)，這對于皮膚細(xì)胞維持和修復(fù)非常重要。在另一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽是肝細(xì)胞生長因子(HGF)(參考Ono et al,SurgRes. 2004Jul ；120(1) :47-55)。HGF具有許多生物學(xué)活性，例如促有絲分裂、單性生殖、 抗凋亡、抗成纖維化以及形態(tài)發(fā)生。對內(nèi)皮細(xì)胞而言它還具有血管生成和血管保護活性。在另一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽至少包括結(jié)締組織生長因子(CTre-i，CTre-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)(參考美國專利No. 6，689，351，描述了用GMCSF治療創(chuàng)傷)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)、生長激素(GH)中的一種。同時，維持細(xì)胞的美容功能從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽可能包括抗血管生成多肽，例如 TSP-I或TSP-2 (參考美國專利No. 6，712，617)。其他活躍在具有美容功能細(xì)胞中的多肽和因子比如上面描述的，可以查閱以引用全文的方式并入本文中的第6，586，185號美國專利。分子構(gòu)津體及其制備方法在各種實施例中，目標(biāo)基因通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。一個重組DNA分子包括一個多核苷酸序列，這段多核苷酸序列編碼至少一種維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程核苷酸或者多肽，它能夠利用本領(lǐng)域公知的常規(guī)基因表達(dá)技術(shù)來操作和表達(dá)。通過這種方式，能夠大量產(chǎn)生具有合適的側(cè)翼序列的目標(biāo)多肽或者多核苷酸。本文中提到的這些方法和化合物中的每一種多核苷酸或者多肽包括生物活性衍生物、類似物和/或保留了全長多核苷酸或多肽具有的生物活性的片段。這些衍生物或者類似物可能包括翻譯后修飾的多肽或者磷酸化的多肽?；蛘撸ㄟ^化學(xué)合成具有修飾殘基的核苷酸分子而形成的多核苷酸類似物。多肽類似物也可能利用常規(guī)的氨基酸替換、刪除、 添加或者位點突變的方式而產(chǎn)生。在一個實施例中，可以通過刪除參與了皮膚維持和/或治療的核苷酸的一段序列或者多肽的氨基酸殘基就能得到一個目標(biāo)基因片段，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一個多核苷酸序列編碼至少一種維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程核苷酸或者多肽，它能夠在原核或者真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行增殖和表達(dá)。在另一個實施方案中細(xì)菌、哺乳動物、酵母以及昆蟲細(xì)胞系均可以被用于重組載體的增殖。在一個實施例中，一個多核苷酸序列編碼至少一種維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程核苷酸或者多肽，它能夠進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，即與另外一種維持具有美容功能的細(xì)胞的編碼序列以正確的框架和方向聯(lián)合。這些融合蛋白用于增強維持具有美容功能的細(xì)胞的核苷酸和多肽的穩(wěn)定性或者保證其正確加工?；蛘撸S持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的核苷酸或者多肽能夠與其他合適的意向用途的分子相連接。例如，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的核苷酸或者多肽能夠與一種結(jié)合組分相連接從而變成一種被目標(biāo)細(xì)胞認(rèn)識的受體。除非另有說明外，本發(fā)明的實踐應(yīng)用中將會利用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA 以及免疫學(xué)中的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都被包括在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)的解釋，包括 Sambrook，等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) ；DNA Cloning，Vol. I 禾口 II，D. N Glover ed. (IRLPress,1985) ；B.Perbal, A Practical Guide To Molecular T/US2010/04205 ；Cloning, Wiley (1984) ； ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J. H. Miller^PM. P. Calos eds. (Cold Spring Harbor Laboratory,1987) ；Methods In Enzymology, Vol.154 禾口 155, Wu 禾口 Grossman, eds.,禾口 Wu, ed. , respectively(Academic Press,1987).重組構(gòu)建體由維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的核苷酸或者多肽組成，能夠利用公知的重組技術(shù)得到。就此而言，目標(biāo)序列通過正確的閱讀框和方向可以可操縱地連接到一個或者多個合適載體的調(diào)節(jié)序列上。因此，目標(biāo)序列可以被插入，例如，插入到一個哺乳動物載體上在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。圖7顯示了本發(fā)明編號20的重組構(gòu)建體。這個重組構(gòu)建體由一個DNA分子組成， 它編碼一個維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程蛋白或多肽22。或者，這個載體由一段多核苷酸組成(例如反義RNA或者siRNA)，它能夠用來調(diào)節(jié)維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽的表達(dá)。在一個實施例中，維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽的編碼序列來源于一種互補DNA(cDNA)，它由宿主細(xì)胞的胞內(nèi) RNA逆轉(zhuǎn)錄而成，能夠用本文舉例中描述的方式或者本領(lǐng)域中其他已知的方式表達(dá)目標(biāo)基因。如圖7所示，在某些實施例中，重組載體可能包含一段調(diào)節(jié)序列比如啟動子 24(或)增強子沈。因此，一段包含了在目標(biāo)細(xì)胞中強有力的啟動子M的常規(guī)序列可能通過分子技術(shù)被連接到cDNA序列上。也可能用到其他的調(diào)節(jié)序列，比如一個或者多個增強子序列26，一個核糖體結(jié)合位點28，一個具有功能性剪接供體和受體位點序列的內(nèi)含子，一段指導(dǎo)重組多肽30分泌的信號序列，一段終止序列32，一個多腺苷酸化信號和/或多腺苷酸化序列34，其他轉(zhuǎn)錄終止序列以及一段宿主基因組同源序列。其他序列，比如復(fù)制起始位點能夠被插入到載體中從而優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)品的表達(dá)。同時，一個選擇標(biāo)記也有可能被包括在載體上以便用來對轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。調(diào)節(jié)序列具有多種來源。例如，它們中一個或者多個可能能夠正常地與編碼序列相連結(jié)，或者來源于宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，或者與宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)系統(tǒng)同源(例如角質(zhì)細(xì)胞)。同樣地，啟動子可能來源于一個基因，這個基因能夠啟動應(yīng)答使具有美容功能的細(xì)胞退化的化合物或者條件，比如紫外線或者一些化學(xué)試劑。表達(dá)載體的各種組分能夠直接連結(jié)到一起，或者由通過本領(lǐng)域中已知的限制性酶識別位點組成的連結(jié)體來連結(jié)。任何能夠使維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對皮膚外觀有益的生化或生理過程的多肽編碼序列表達(dá)的啟動子都能夠被用于本發(fā)明。例如，能夠應(yīng)用于此的哺乳動物啟動子序列是一些哺乳動物病毒，它們能夠進(jìn)行高表達(dá)且具有廣泛的宿主范圍。啟動子可以是那些能夠在大部分哺乳動物中進(jìn)行持續(xù)表達(dá)的啟動子，比如PKG啟動子。舉例來說，能夠在真核細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的合適的調(diào)節(jié)元件是一些能夠被RNA聚合酶 III識別的啟動子或者病毒啟動子、CMV增強子、CMV啟動子、SV40啟動子或者LTR啟動子， 如來自MMTV (小鼠乳腺瘤病毒，Lee et al，1981，Nature, 214, 228-232)和其他病毒的啟動子和激活序列，例如來自HBV，HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV或者HIV。舉例來說，能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)元件是由四聚體組成的操縱子及其相應(yīng)的阻遏物(Gossen M.，等，1994，Curr. Opin. Biotechnol.，5，516-20)。在一個實施例中，目標(biāo)基因的表達(dá)在組織特異性啟動子控制下才發(fā)生。在另一個實施例中，組織特異性啟動子可能包括皮膚特異性啟動子，比如人KlO啟動子(Bailleul et al,1990，Cell，62，697-708 ；Sawamura 等，J. Invest.Dermatol,1999，112 :828-830)，人 K14 啟動子(Vassar et al, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA，86，1563-67)，人套膜蛋白啟動子 (Carroll 等，1993, Proc. Natl, Acad. ScL，90 :10270-10274)，牛細(xì)胞角蛋白 IV 啟動子，或者其他人角蛋白啟動子(例如，Kl 和 K5) (Bryne 等，1994，Development, 120 :2369-2383)。另一種方案中，啟動子可能是在細(xì)胞周期或者發(fā)育過程中特定時間啟動的啟動子。例如，重組載體可能包括能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，例如啟動子或者來自啟動子的激活序列，或者一些只在某些細(xì)胞類型中表達(dá)蛋白的編碼基因的增強子。舉例來說，這些在真核生物細(xì)胞周期中特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)元件是以下基因的啟動子 cdc25A, cdc25B, cdc25C, cyclin A, cyclin Ε, cdc2, E2F-lto E2F-5, B-myb or DHFR( # 考美國專利 No. 6，856，185 ;No. 6，903，078 ；以及 Zwicker J.和 Muller R. 5 1997，Trends Genet.，13，3-6)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)啟動子僅限于增殖細(xì)胞中多肽或者核苷酸的表達(dá)。在一個實施方案中，一種叫做FiRE的元件能夠使角質(zhì)細(xì)胞在皮膚中特異性表達(dá) (Jaakkola et al，2000，Gen. Ther.，7，1640-1647)。這種 FiRE 元件是一種 AP-1 驅(qū)動分子， FGF 誘導(dǎo)的 Syndecan-I 基因應(yīng)答元件(Jaakkola et al, 1998,FASEB J.，12，959-9)。同樣的，那些能夠?qū)崿F(xiàn)真核細(xì)胞中代謝特異性表達(dá)的元件是一些被低氧(如HIF-α )、葡萄糖缺乏、磷酸濃度或者熱休克調(diào)節(jié)的啟動子。在另一個實施例中，一個增強子元件能夠與啟動子序列相連接.這樣的增強子不僅僅可以擴增基因，還可以調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。在一個實施方案中，增強子可以來源于通常位于多肽編碼基因(例如膠原)附近的一段序列，這種多肽參與了維持或者作用于與美容相關(guān)的細(xì)胞。被應(yīng)用于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中合適的增強子元件是，例如，來源于具有廣泛宿主范圍的病毒增強子，如SV4早期基因增強子，來源于勞斯氏肉瘤病毒LTR以及人巨細(xì)胞病毒的增強子/啟動子。此外，還有那些能夠包含在啟動子序列里面合適的增強子，這些增強子只有在誘導(dǎo)物存在時才能夠被激活，比如本領(lǐng)域已知的激素、金屬離子或者酶的底物。在本發(fā)明的另一個實施例中，一段轉(zhuǎn)錄終止序列被放在目標(biāo)基因編碼序列翻譯終止密碼子的3’端.因此，這段終止序列和啟動子分別位于編碼基因的兩側(cè)。表達(dá)載體可能還包括一個復(fù)制起始位點從而使其作為一個復(fù)制子，進(jìn)行大量的復(fù)制且在宿主中穩(wěn)定存在。這樣的復(fù)制起始位點包括那些能夠使表達(dá)載體在胞內(nèi)合適蛋白存在的條件下進(jìn)行大量復(fù)制的序列，例如2μ和自主復(fù)制序列能在酵母中發(fā)揮作用，SV40中重要T-抗原的復(fù)制起始位點能在C0S-7中發(fā)揮作用。哺乳動物復(fù)制系統(tǒng)可能包括一些來源于動物病毒的序列，需要反式作用因子才能進(jìn)行復(fù)制。例如，乳頭多瘤空泡病毒的復(fù)制系統(tǒng)如SV40，在適量的重要T-抗原存在的條件下能夠大量復(fù)制乳頭多瘤空泡病毒，或者也利用那些來源于牛乳頭瘤病毒和巴爾病毒的序列。在某些情況下，表達(dá)載體可能不止一個復(fù)制系統(tǒng)，從而使其能夠在哺乳動物中表達(dá)以及在原核宿主中克隆和擴增(參考美國專利No. 5，677，278)。在一個實施例中，表達(dá)載體能夠作為整合載體被整合到宿主基因組上。此處的整合載體至少包含了一段多聚核苷酸序列，這段序列與宿主基因組同源從而使得載體能夠整合。例如，在一個實施例中，利用了噬菌體或者轉(zhuǎn)座子插入序列。本技術(shù)的最佳實施方式如文獻(xiàn)中描述(例如，Branski 等，2006，Gene Therapy, 2006,1-10 ；和 Hengge，2006，Gene Therapy, 13 155-1563)。在本發(fā)明的某些實施方案中，表達(dá)載體還可能包含一個或者多個選擇標(biāo)記，從而能夠選擇轉(zhuǎn)化成功的宿主細(xì)胞。能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記包括一些能夠使宿主細(xì)胞具有耐藥性的基因，例如衣霉素、G418、氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)、四環(huán)素。選擇標(biāo)記還可以是一些生物合成基因，比如那些參與組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑的基因，如ade2、hiS4、Ieu2、trpl，或者是一些能夠使得宿主細(xì)胞在毒性化合物中(如金屬)生長的基因。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括了一種產(chǎn)生多聚核苷酸的方法，這種多聚核苷酸編碼至少一種維持細(xì)胞具有美容功能的核酸或者多肽，使得這種核酸或多肽能夠在具有美容功能的細(xì)胞中表達(dá)從而增強和/或維持對美容有積極作用的生理和/或生化過程。 這種方法還包括在表達(dá)重組載體中插入一段多聚核苷酸。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包括了一種由多聚核苷酸組成的表達(dá)載體，這段多聚核苷酸編碼至少一種維持細(xì)胞具有美容功能的核酸或者多肽。同樣地，在某些實施方案中，本發(fā)明包括了轉(zhuǎn)染了這種載體的宿主細(xì)胞。例如，這種方法還包括將DNA構(gòu)建體整合到表達(dá)載體上。這種方法可能進(jìn)一步包括將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)染了本發(fā)明表達(dá)載體的細(xì)胞。例如，可以構(gòu)建表達(dá)參與維持細(xì)胞具有美容功能的多肽的質(zhì)粒。表達(dá)盒式序列可以被插入到表達(dá)載體如pcDNA3. 1上或者利用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)載體 (Invitrogen, CA)。如本技術(shù)領(lǐng)域所知，這樣的核酸構(gòu)建體可以通過突變進(jìn)行修飾，例如，通過包含了突變位點的引物來PCR擴增核酸模板。通過這種方式，可以設(shè)計包含了不同水平生物活性的多肽。在另一個實施方案中，突變序列可能與原始DNA具有70%、75%、80%、85%、90% 或者更高的同源性。這樣的話，突變體可能包括了能在嚴(yán)格條件下雜交的核酸序列(例如在Imol鹽濃度，低于DNA雙鏈的溶解溫度(Tm值)20-27°C的條件下。同樣地，這種方法還包括將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽能夠在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，包括將表達(dá)構(gòu)建體利用病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒轉(zhuǎn)入到哺乳動物細(xì)胞中的系統(tǒng)。適合作為表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，包括很多合適的來自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)的永生細(xì)胞系。特別包括了中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)、NS0、SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼地鼠腎細(xì)胞(BHK)、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝癌細(xì)胞(Hep G2)、A549細(xì)胞以及許多其他細(xì)胞系。細(xì)胞系的選擇取決于在哪一種細(xì)胞系中多肽能夠高水平表達(dá)。也可能利用到昆蟲細(xì)胞系，如SF9細(xì)胞。還有可能利用到植物宿主細(xì)胞，如煙草、擬南芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等等。微生物宿主細(xì)胞包括大腸桿菌和鏈霉菌屬。酵母宿主細(xì)胞包括粟酒裂殖酵母、釀酒酵母和畢氏酵母。當(dāng)編碼目的基因的重組表達(dá)載體被導(dǎo)入到哺乳宿主動物細(xì)胞中，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞足夠的時間本發(fā)明涉及的多肽就能在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，或者分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液上清中。 表達(dá)的多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化方法從培養(yǎng)液中回收。
編碼本發(fā)明涉及的多肽的核酸分子和含有這些核酸分子的表達(dá)載體可以用于在合適的哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)染?？梢酝ㄟ^已知的任何一種轉(zhuǎn)化方法將多聚核苷酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。在本技術(shù)領(lǐng)域?qū)愒炊嗪塑账釋?dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中的方法是已知的，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體包裹以及將DNA直接微注射到核里。另外，也可以通過病毒載體把核酸分子導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中。在本技術(shù)領(lǐng)域，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法也是已知的，包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化、直接注射、電穿孔和病毒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)菌和酵母細(xì)胞的方法也是已知的。表達(dá)載體也可以通過DNA基因槍的方法導(dǎo)入到表達(dá)系統(tǒng)里，在該方法中將質(zhì)粒沉淀到微顆粒上，最好是金顆粒，然后微顆粒被推進(jìn)目的細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)中。DNA基因槍技術(shù)和手段已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，如一種“基因槍”已經(jīng)被商業(yè)應(yīng)用于將微顆粒導(dǎo)入到細(xì)胞(例如，Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs.，Hercules, CA)禾口皮膚中(PMED Device, PowderMed Ltd.，Oxford, UK)。本發(fā)明涉及的多肽在生產(chǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)量可以通過一些已知技術(shù)得到提高。例如，谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))和抗新霉素細(xì)胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是在一定條件下提高表達(dá)量的常用方法。當(dāng)本發(fā)明涉及的多肽用不同細(xì)胞系表達(dá)時，它們會有不同的糖基化方式。然而，這里所描述的核酸分子編碼的多肽，或組成的氨基酸序列，都是立即產(chǎn)物，不考慮其糖基化在一種實施方案中，重組DNA載體可以轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵細(xì)胞中，得到最優(yōu)表達(dá)。 在另一種實施方案中，細(xì)胞可產(chǎn)生的蛋白濃度為0. 1-20克每升，或0，5-10克每升、1-5克每升，或1-2克每升。例如，重組載體可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)中，其中表達(dá)有維持美容功效的多肽的細(xì)胞被篩選和克隆出來。在一種實施方案中，可通過加入抗生素 G418篩選有新霉素抗性的表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞。通過Western Blot檢測細(xì)胞上清液得到的高表達(dá)重組蛋白的單克隆可被挑選出來和擴增，基因產(chǎn)物可通過蛋白A親和層析純化。牛嶋馬輔月謝雜/淑臺棘紐白__本·至"捕容功能效的細(xì)胞中很多方法都可以用于轉(zhuǎn)移編碼有美容功效的多肽的多聚核苷酸，從而增強或維持對皮膚有益的生化或生理過程。因此，本發(fā)明的配方含有幫助蛋白進(jìn)入細(xì)胞的特殊成分。為了通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染等手段使核酸進(jìn)入到真核或原核細(xì)胞中，核酸可以被整合到質(zhì)粒中，作為病毒載體或非病毒載體的一部分。合適的病毒載體包括桿狀病毒、牛痘病毒、慢病毒(參考 Siprashvili 和 Khavari，MoI Ther.，2004，9，93-100)、腺病毒、腺依賴病毒和皰疹病毒。有基因治療功效的載體是病毒載體，例如腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 真核表達(dá)載體也適用于單獨的基因治療，因為裸DNA可以在局部敷用中穿透進(jìn)入有美容功效的細(xì)胞中(Hengge et al，1996，J. Clin. Invest.，97，2911-6 ；Yu et al, 1999, J. Invest. Dermatol, 112,370-5)。另一種基因治療載體可通過把上述核酸做成金顆粒得到，然后用所謂的基因槍注射到組織中(Wang et ah，1999，J. Invest. Dermatol, 112, 775-81, Txxi' vag et al，1998，J. Invest. Dermatol，111，183-8)，最好使皮膚中，或者細(xì)胞中。一些本發(fā)明可以用到的基因轉(zhuǎn)染方法會在下文更詳細(xì)地說明。裸DNA
39
在一個實施方案中，編碼至少一個參與維持具有美容功能的細(xì)胞從而增強和/或維持對美容有積極作用的生化和/或生理過程的核酸或多肽的多核苷酸重組體被直接注射入具有美容功能的細(xì)胞中，稱之為裸DNA。且在局部施用后，寡核苷酸(例如，編碼RNAi) 能被有效的轉(zhuǎn)入表皮的各個細(xì)胞層。在某些的實施方案中，這些DNA和水或者緩沖液一起使用?；蛘?，也可以利用在此被詳細(xì)描述過的脂質(zhì)體。并且，在某些的實施方案中，皮膚可能被磨損了，通過移除一部分毛發(fā)(如剝離)，或者刷掉，或者利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他方法。(Choi et al，Skin Pharmacol. Appl Skin Physiol. ,2003,16 :271-282 ；Choi 等，Current Drug Delivery, 2006,3 :37-45).在其他實施方案中，可能用到包含了與DNA連接的多肽的基因載運系統(tǒng)。在另一個實施方案中，載體(稱之為“裸”表達(dá)載體)會被傳入到生物相容的基質(zhì)中，如膠原基質(zhì) (Goldstein 禾口 Banadio，U. S. Pat. No. 5，962，427)。一些研究報道說，裸質(zhì)粒DNA能夠成功地經(jīng)皮膚傳送(Fan等，1999，Nature Biotech. , 17 :870-872 ；Yu 等，1999，J. Invest. Dermatol.，112 :370-375 ；Kang 等，2004， J. Gene Med.，6 1238-1246)。例如，據(jù)報道，磷酸鹽緩沖液(PBS)中的DNA局部施用后，產(chǎn)生了抗細(xì)菌β-半乳糖苷酶的抗體，表明了裸質(zhì)粒DNA可以經(jīng)皮膚傳送(Fan等(1999)。利用具有毛囊和不具有毛囊的小鼠進(jìn)行傳送對比，F(xiàn)an等人(1999)發(fā)現(xiàn)這種傳送是通過毛囊的。但是，也有其他報道稱，裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)運導(dǎo)致了報告基因不僅在毛囊中表達(dá)也在上皮細(xì)胞中的角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Yu等，1999)。也有論證表明，300 μ g質(zhì)粒DNA局部施用2小時后，導(dǎo)致每克組織轉(zhuǎn)運了大約1，OOOng的質(zhì)粒DNA，施用M小時后每克組織轉(zhuǎn)運了大約 IOOng的質(zhì)粒DNA，局部施用的一天后mRNA就開始表達(dá)(Kang等，2004)。早期的研究表明，質(zhì)粒DNA可能會通過缺損的系統(tǒng)(這些缺損是在適當(dāng)條件下暫時形成的孔道)滲透進(jìn)入角質(zhì)層(Menon 和 Elias，1997，Skin Pharmacol, 10 :235-246)。 也有論證表明，被極性脂類環(huán)繞的水合區(qū)域構(gòu)成的孔道也可能促進(jìn)了細(xì)胞間極性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移(Sznitowska 等，1998，J. Pharm. &L，87 :1109-1114)。并且，近期研究表明，質(zhì)粒 DNA 在胞內(nèi)主要由角質(zhì)細(xì)胞通過吞噬作用攝取，還涉及到與DNA連接的埃茲蛋白和膜突蛋白 (Basner-Tschakar jan 等，2004，Gene Therapy 11:765-774)。裸質(zhì)粒DNA的安全性和擴散性已得到廣泛的評價(如，Hengge UR，Vol-Platzer B(eds)，The Skin and Gene Therapy. Springer-Verlag :Berlin, 2001, pp. 67-80)。與病毒載體轉(zhuǎn)運DNA不同，裸質(zhì)粒cDNA不會引起不良的免疫應(yīng)答，也不會導(dǎo)致插入突變，且能保持啟動子的功能。潛在的擔(dān)憂在于質(zhì)粒DN會A從靶點向其他組織和器官遷移，然而，報道稱在任何時間點都不能檢測到質(zhì)粒DNA整合進(jìn)入了宿主DNA，并且質(zhì)粒cDNA的表達(dá)時間很短暫，以至于處理11天之后，表達(dá)的RNA只在被處理過的皮膚中發(fā)現(xiàn)，除此之外的任何其他組織中都未發(fā)現(xiàn)(Hengge等，1995，Nat. Genet, 10 :161-166)。據(jù)猜測，質(zhì)粒DNA的遺失是由于組織核酸酶的降解以及表皮再生引起的。由于質(zhì)粒DNA表達(dá)的短暫性以及質(zhì)粒DNA的快速降解，因此皮膚的基因療法被認(rèn)為是安全的。脂質(zhì)體和微囊體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移例如，在其他的實施方案中，脂質(zhì)體和/或微囊體被用于促進(jìn)多聚核苷酸的轉(zhuǎn)移，多聚核苷酸編碼參與維持具有美容功能的細(xì)胞具有從而增強和/或維持對美容有積極作用的生化和/或生理過程的多肽，脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的、含有雙層磷脂的小囊泡 (Jeschke，M. G. et al，Gene Ther. , 12,1718-24(2005)；美國專利 No. 6，576，618)。微囊體是非常小的脂質(zhì)體，但是其制作方法本質(zhì)上與脂質(zhì)體相同。核酸、蛋白質(zhì)和其他生物物質(zhì)能夠被包含在脂質(zhì)體和/或微囊體中，通過質(zhì)膜融合的方式被運輸進(jìn)入哺乳細(xì)胞中。脂質(zhì)體和/微囊體是引人注目的運載系統(tǒng)，因為它們是無病毒的、穩(wěn)定的，并且能夠與細(xì)胞膜相互作用。利用脂質(zhì)體和/或微囊體直接施用到皮膚上，可以把脂質(zhì)雙分子層中包含的物質(zhì)通過質(zhì)膜融合的方式導(dǎo)入具有美容功能的細(xì)胞中。 傳送的方式可以是內(nèi)吞作用也可以是膜泡運輸途徑。例如，脂質(zhì)體和/或微囊體能夠皮下注射轉(zhuǎn)染真皮中的細(xì)胞，導(dǎo)致皮膚注射位點的蛋白表達(dá)。也可以先用空脂質(zhì)體和/或空微囊體對皮膚進(jìn)行預(yù)處理，然后再用含裸DNA的脂質(zhì)體處理。脂質(zhì)體和/或微囊體由陽離子、陰離子、中性脂質(zhì)和混合物構(gòu)成(Luo，D. & Saltzman, W. M. ,Nat. Biotech.，18，33-37 (1999)。為了轉(zhuǎn)移 DNA，脂質(zhì)分子可以通過化學(xué)修飾使其包含化學(xué)基團從而促進(jìn)DNA的壓縮或釋放。陽離子脂質(zhì)，例如季銨鹽洗滌劑、膽固醇和甘油二酯陽離子衍生物、聚胺類脂質(zhì)衍生物，更有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，因為它們降低了 DNA 的凈負(fù)電荷并且增強了其同細(xì)胞膜的相互作用(Nishikawa，Μ. &Huang, L.，2001，Hum. Gene Ther. , 12,861-70 ；Badea J. Biol. Gene Medi 2005，7 :1200-1214)。也可以使用包括 1，2， 3-三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺在內(nèi)的其他脂質(zhì)體。中性脂質(zhì)，例如磷脂酰乙醇胺(DOPE)、甘油月桂酸、聚氧乙烯-10-硬脂(P0E-10)、 膽固醇，可以作為輔助性脂類加入到陽離子脂質(zhì)DNA復(fù)合物中，從而在細(xì)胞通過內(nèi)吞作用攝取復(fù)合物后，促進(jìn)DNA從內(nèi)吞體中釋放出來。也應(yīng)該充分利用能促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移的輔助物，例如可以連接到DNA上的聚合物、蛋白質(zhì)或者促進(jìn)DNA更有效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中的合成肽-DNA 分子(參考 Niidome，Τ. & Huang，L.，Gene Ther.，9，1647-52 (2002))。這樣，由于陽離子聚合物(例如聚賴氨酸或魚精蛋白)能夠引起DNA緊密壓縮，從而防止復(fù)合物聚合以及核酸酶的降解作用，所以陽離子聚合物可以被應(yīng)用于脂質(zhì)-DNA復(fù)合物中。例如在混合質(zhì)粒DNA之前，先將1，2，3_三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺(DOTAP)與帶有硫酸魚精蛋白的脂質(zhì)體混合，然后產(chǎn)生穩(wěn)定的135nm的小顆粒，可以導(dǎo)致基因在各個組織中高水平的表達(dá)(如， lung, ,liver, heart) (Li, S. et al，Gene Ther.，5，930-37 (1998))。加入作為輔助性脂質(zhì)的膽固醇，可以增強脂質(zhì)-肽-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。并且，在添加陽離子脂質(zhì)(脂質(zhì)體RPR 115335或RPR 120535)或者聚合物(聚乙烯亞胺)之前，預(yù)先將熒光素酶基因或β _半乳糖苷酶基因與來源于人組蛋白或魚精蛋白的短肽緊密連接，即使在血清存在的情況下，也可以增強轉(zhuǎn)染效率。正如本技術(shù)領(lǐng)域所知，脂質(zhì)體可以通過加熱脂質(zhì)從而形成脂質(zhì)相的方式來制作 (ffu, H. et al，Int. J. Pharmaceut，221，23-24 (2001))。隨后，在冷卻條件下，通過注射器來回推動，將包含有水、鹽、緩沖液的水相與脂質(zhì)相混合。其后，通過聲波降解法直至最終形成直徑在100-140nm的脂質(zhì)體。然后通過倒置混合，DNA或蛋白質(zhì)(溶液)可以被加入到脂質(zhì)體中。這樣制備的脂質(zhì)體可以直接應(yīng)用或注射到皮膚內(nèi)。制作脂質(zhì)體所要用到的脂質(zhì)種類和比例、DNA的濃度、以及加到皮膚上的脂質(zhì)體的量，需要根據(jù)經(jīng)驗來判斷最終實現(xiàn)最優(yōu)化。促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移的輔助物，例如多肽，可以在加入脂質(zhì)體混合物之前，與DNA混合；但是， DNA輔助物必須維持高度的水溶性，從而被密封在脂質(zhì)體脂質(zhì)相的外部。
另外，通過對包含有陽離子脂質(zhì)以及DOTMA或磷脂酰乙醇胺(DPOE)的懸浮脂質(zhì)體進(jìn)行超聲處理可以制備小的單層囊泡，例如細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑GS^88。倒置混勻之后，DNA或蛋白質(zhì)將通過離子鍵連接到脂質(zhì)體的表面，按照可以維持復(fù)合物表面凈正電荷的比率，此時DNA 將100%混入脂質(zhì)體中。而且，陽離子巰基洗滌劑也可以被用于制備轉(zhuǎn)運DNA的脂質(zhì)體(例如參見，Dauty，E.et al，J. Am. Chem. Soc, 123,9227-34(2001)) 一旦被氧化，脂質(zhì)中的巰基就會轉(zhuǎn)變成二硫化物，促進(jìn)DNA-脂質(zhì)復(fù)合物形成穩(wěn)定的納米級小顆粒，這些小顆粒會以靜電的形式連接到細(xì)胞表面，陰離子肝素硫酸蛋白多糖會促使細(xì)胞對其的攝取。小尺寸的納米粒子和脂雙層結(jié)構(gòu)均會促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)入具有美容功能的細(xì)胞中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽所提供的還原性環(huán)境會將二硫化物轉(zhuǎn)化為硫醇并釋放DNA。油包水和水包油的納米乳劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移在另一個實施例中，油包水和/或水包油的納米乳劑可以被用來轉(zhuǎn)移多核苷酸或多肽，這些多核苷酸或多肽可以用來維持具有美容功能的細(xì)胞，進(jìn)而增強和/或維持對細(xì)胞美容功能具有積極作用的生理生化過程。水包油和/或油包水的納米乳劑是由水、油和表面活性劑構(gòu)成的熱力學(xué)穩(wěn)定的液態(tài)均質(zhì)分散體系，構(gòu)成了將DNA或蛋白質(zhì)(或其它生物分子)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中的技術(shù)(Wu,H. et al,Int. J. Pharmaceut, 221, 23-24 (2001)；同時參考美國專利 Nos. 5，753，241，6，274，150，6，335，022，6，464，990，6，541，018，以及 6，689，371)。利用具有生物學(xué)安全的成分，例如聚氧乙烯-失水山梨醇單油酸酯(吐溫 80)、 失水山梨醇單油酸酯和橄欖油，可以使人體試驗中對人體刺激的風(fēng)險降到最低。在這些成分精確的化學(xué)計量比率下，緩慢加熱以及輕輕混勻，納米粒子會開始自發(fā)形成。這樣就不需要高剪切力的作用，從而消除了對被轉(zhuǎn)運的生物分子明顯的物理損傷。這項技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了規(guī)模化，可以封裝大量的水相物質(zhì)。納米乳劑可以直接應(yīng)用于皮膚，從而實現(xiàn)將生物分子導(dǎo)入具有美容功能的細(xì)胞中。例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和人干擾素- α 2的cDNA已成功實現(xiàn)了對離體小鼠表皮的轉(zhuǎn)染，其中，DNA沉積物主要進(jìn)入了濾泡角質(zhì)細(xì)胞(Wu et al，2001)。 單次施用以后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)量在24h達(dá)到最大，且多次施用后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平顯著提高。 也可以用相似的方式使用包含有乙醇-氟碳的微乳狀液。顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移在另一實施方案中，轉(zhuǎn)運方法包括顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(例如參見，Nishikawa， Μ. &Huang, L.，Hum. Gene Ther.，12，861-70 (2001) ；Luo, D. &Saltzman，W. Μ.，Nat. Biotech, 18,33-37(1999))。例如，由金粒子或鎢粒子等金屬粒子包被的DNA顆粒(1_5 μ m)，能夠被“基因槍”加速到極高的速度，從而穿透細(xì)胞膜(Williams, R. S. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. ,88, 2726-30 (1991))。通過將微粒子在溶液中與DNA溶液、氯化鈣和亞精胺自由基循環(huán)混勻，微粒子表面可被包被上DNA。將經(jīng)由酒精淋洗后的顆粒涂抹到基因槍的涂藥器上，待顆粒干燥、酒精揮發(fā)后，基因槍就可以將顆粒射入具有美容功能的細(xì)胞中，從而增強和維持對細(xì)胞美容功能有積極影響的生理生化過程。這項技術(shù)可以將一種生物分子同時導(dǎo)入多個細(xì)胞中，并且將生物分子經(jīng)由細(xì)胞膜直接導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞核中，因此可以避免體內(nèi)潛在的酶解反應(yīng)。另外，在一個實施方案中，這項技術(shù)只能實現(xiàn)顆粒對細(xì)胞層較淺部位的滲透作用，因此可有效地用于被運輸進(jìn)入表皮的DNA的局部表達(dá)?；驑尩念w粒轟擊會造成輕微的細(xì)胞損傷以及炎癥。例如，Oshikawa等人使用氦脈沖PowderJect )(R基因傳送裝置，將內(nèi)部包被著白細(xì)胞殺菌素的12個基因DNA的金顆粒射入小鼠表皮中，或者覆蓋在腫瘤位點上，或者與腫瘤位點有較遠(yuǎn)距離(Oshikawa，K. et al,Hum. Gene Ther.，12， 149-60(2001)) 0結(jié)果發(fā)現(xiàn)，覆蓋在腫瘤位點上的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以有效地抑制腫瘤的生長，但是如果不考慮轉(zhuǎn)染位點的話，這種療法具有抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移效果(Oshikawa等，2001)。類似的方法也得到了成功的應(yīng)用，在人肌動蛋白啟動子的控制下，編碼熒光素酶的基因DNA 可以有效轉(zhuǎn)染小鼠表皮，基因槍轟擊區(qū)域10-20%細(xì)胞會表達(dá)轉(zhuǎn)入的基因(Williams等， 1991)。電壓驅(qū)動的轉(zhuǎn)移還可以使用其他的轉(zhuǎn)移方法，例如電穿孔法、離子電滲法等(參考Banga，Α. K. et al, Int. J. PharmaceuL，179，1-19(1999) ；Banga AJ. &Prausnitz, Μ. R. , TIBTech,16,408, 12(1998) ;Andre,F.&Mir,L. Μ. ,Gene Ther. , 11, S33-42 (2004)) 在這些方法中，當(dāng) DNA 已被注射進(jìn)入表皮或者敷在表皮上時，電流可以促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，在高離子強度的介質(zhì)中效果更好。由于皮膚易于處理，所以是應(yīng)用這些技術(shù)的最佳組織。使用這些技術(shù)時必須充分考慮DNA的劑量、電極形狀(如針狀、鉗狀)和數(shù)量、電場強度和持續(xù)時間。處理后的細(xì)胞的滲透性逐漸降低，這表明這些技術(shù)對細(xì)胞所造成的損傷均是可逆的。另外，由于受到電流的作用，這些技術(shù)可以實現(xiàn)在低刺激的條件下達(dá)到DNA高水平轉(zhuǎn)移的目的。電穿孔電穿孔涉及到使用非常短促的高電壓(通常應(yīng)大于100V)，電脈沖會使細(xì)胞膜暫時通透，促使細(xì)胞對大分子的攝取(參考Nishikawa，Μ. &Huang，L.，Hum. Gene Ther.， 12,861-70(2001)) 0電流會使細(xì)胞膜形成通透孔，DNA和蛋白質(zhì)會通過該孔順濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而，促進(jìn)或維持在注射和/或施用后對生物分子的攝取。這項技術(shù)已被用于活體表皮轉(zhuǎn)染通過皮內(nèi)注射，將編碼報告基因的質(zhì)粒注射進(jìn)入豬或小鼠的表皮，然后用 PulseAgile 電穿孔設(shè)備和軟件給予電脈沖。(CytoPulse Sciences,Hanover,MD) (Drabick, JJ et al,Molec. Ther. ,3,249-55(2000)).轉(zhuǎn)染細(xì)胞主要位于真皮中，包括脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞及其他細(xì)胞中。離子導(dǎo)入離子導(dǎo)入涉及到低壓電脈沖的使用(通常為IOV或更小)，這種電脈沖通常是高頻脈沖或持續(xù)的恒定脈沖(通常0. 5mA/cm3或更小)，進(jìn)而促進(jìn)帶電分子進(jìn)入表皮 (Nishikawa, Μ. &Huang, L.，Hum. Gem Ther. , 12,861-70 (2001)) 具有與極性分子相同的電荷的電極可以驅(qū)動帶電分子進(jìn)入皮膚。例如，帶有負(fù)電荷的陽極可用來驅(qū)動帶負(fù)電荷的 DNA分子。電極通常非常小，可以被納入到基質(zhì)中，基質(zhì)可以應(yīng)用于施用過DNA溶液的表皮 (Mikszta,J. A. et al,Nat. Med.，8，415-19 (2002))。除了使用包括汗腺在內(nèi)的原有路徑外， 該技術(shù)與電穿孔類似，在表皮上形成了新的孔道來實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。與電穿孔相比，該技術(shù)更適用于人體。被轉(zhuǎn)運的DNA與施用于表皮上的電流和基質(zhì)大小成正比。因此，用量易于調(diào)節(jié)， 并且可以根據(jù)病人的需要進(jìn)行優(yōu)化。另外，由于離子導(dǎo)入法是一種驅(qū)動型的轉(zhuǎn)移，所以與其他藥物驅(qū)動系統(tǒng)相比，它對其他生物變量的依賴較小，例如膜滲透活細(xì)胞內(nèi)組件(Banga， Α. K. et al, Int. J. Pharmaceut. , 179,1-19(1999))。在一個實施方案中，micorenhancer 芯片可以利用裸露的熒光素酶基因DNA，對BALB/c小鼠的具有美容功能的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，與局部施用相比，該過程具有更顯著的轉(zhuǎn)基因活性(增強了觀00倍)(Mikszta，J. A. et al, 2002)。
電整合電整合是對離子電滲法和電泳的一種改進(jìn)，使用這種方法，電脈沖會造成皮膚上層細(xì)胞的破裂，從而使包裝在囊泡或顆粒(例如微球體和金顆粒)中的分子被轉(zhuǎn)移進(jìn)入表皮。電極可直接設(shè)置在目標(biāo)位置，且顆粒直接施用于皮膚上。表皮上層細(xì)胞的破裂后，雙向電泳和/或壓力驅(qū)動粒子進(jìn)入表皮(zhang等Bioelectrochem. Bioenerg.，42， 283-92(1997)).此外，也可使用壓力介導(dǎo)的電整合技術(shù)。射頻消融介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移此外，在一個實施方案中，DNA和/或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移方法還包括射頻消融介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。通過射頻消融技術(shù)能在具有美容功能的細(xì)胞上形成微通道或瞬間微通道(Birchall， J. et al,Int. J. Pharmaceut, 312，15-23 (2006))。這些通路足夠大，具有足夠的形態(tài)和深度來轉(zhuǎn)運直徑達(dá)到IOOnm的納米粒子。在另一個實施方案中，DNA和/或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移方法還包括超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，或稱為超聲滲透法。ViaDerm 是一種可以通過射頻消融形成微通道來實現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)移儀器。該儀器在總面積為1. 4cm2、電極密度為100/cm2的范圍內(nèi)，具有一個電極控制單元和一個可支配的不銹鋼電極陣列。通過施加^OV或330V以及1-5次射頻頻率為100kHz、持續(xù)時間為700 μ s的電壓，微通道就會形成。在將DNA施加到表皮上以前，以及施加過以后，對表皮作如是處理，可以增強轉(zhuǎn)移的效果。例如，具有半乳糖苷酶基因或綠色熒光蛋白報告基因的質(zhì)粒DNA，可以經(jīng)由ViaDerm 這種儀器來轉(zhuǎn)染離體的人皮膚(Birchall et al，2006)。超聲波超聲波可以增加細(xì)胞膜對大分子比如DNA的通透性(參考，Newman, CM.， et al, Echocardiography,18,339-47(2001) ；Niidome, Τ· &Huang, L. , Gene Ther. ,9, 1647-52(2002))。例如，將DNA注射進(jìn)入皮膚后，超聲波照射可以促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。由于這項技術(shù)具有靈活性和安全性的特征，通常可用于人體，尤其是肌肉組織。與微泡或超聲造影劑結(jié)合的超聲技術(shù)，例如充滿全氟丙烷的白蛋白微泡，可以通過超聲能量降低細(xì)胞空心化的極限值(Teupe, C. et al, Circulation, 105,1104-09 (2002)) 例如，利用超聲介導(dǎo)的對運載質(zhì)粒的白蛋白微泡進(jìn)行破壞的方法，將編碼激活型一氧化氮合酶(eNOQ的DNA轉(zhuǎn)染豬的冠狀動脈，導(dǎo)致蛋白的表達(dá)量顯著提高，增強的一氧化二氮導(dǎo)致被緩激肽刺激的動脈舒緩(Teupe 等，2002)。促進(jìn)基因的長期表達(dá)的組織特異性、自我復(fù)制和整合質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)在一個實施方案中，使用的DNA轉(zhuǎn)移方法可能包括自我復(fù)制和整合型質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)(## Newman, CM. ， et al, Echocardiography, 18, 339-47 (2001) ；Niidome, Τ. &Huang, L. ,Gene Ther.，9，1647-52 Q002))。并且，在某些實施方案中，整合還可能具有組織或細(xì)胞類型特異性。因此，至少這里探討的某些技術(shù)是暫時的，并且不是針對生物學(xué)上某些特定類型的細(xì)胞。在一個實施方案中，可以通過如下方式來實現(xiàn)組織特異性轉(zhuǎn)運將蛋白質(zhì)或肽配體合并到DNA復(fù)合物中，從而促進(jìn)受體介導(dǎo)的靶細(xì)胞表面表達(dá)特定的受體。另外，DNA元件可以被包含在被轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA中，以至于編碼基因只能在含有相應(yīng)的蛋白因子的細(xì)胞中表達(dá)。例如，可以將組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或啟動子包含在被轉(zhuǎn)移的DNA分子中。這項技術(shù)已被成功用于將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染活體小鼠肝臟，該質(zhì)粒DNA具有人因子EX微基因序列，該序列包含第一個內(nèi)含子和3’非翻譯區(qū)的一部分，在肝臟載脂蛋白E位點控制區(qū)和α-抗胰蛋白酶啟動子的控制之下，且利用了牛生長激素PolyA信號(Miao，CH.等，MoI. Ther.，1，522-32 Q000))。除了基因序列自身以外，這些遺傳元件使得基因在持續(xù)十個月的治療范圍內(nèi)其表達(dá)水平的提高。在其他的實施方案中，可以通過將能自我復(fù)制的DNA分子轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中的方式來實現(xiàn)被轉(zhuǎn)入基因長時間的持續(xù)表達(dá)(Shirakata M. &Hirai, K.，J. Biochem.，123， 175-81 (1998))。例如，DNA質(zhì)?？赏ㄟ^巴爾病毒提供的系統(tǒng)來維持自身的游離狀態(tài)，并隨著細(xì)胞代代遺傳下去(Shirakata M. &Hirai，K.，J. Biochem.，123，175-81 (1998))。該系統(tǒng)需要被轉(zhuǎn)移的DNA含有巴爾病毒核心抗原1 (EBNAl)編碼序列和oriP DNA元件，這樣在被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中后，EBNAl蛋白的表達(dá)可以促使被轉(zhuǎn)入的DNA的復(fù)制以及與基因組DNA結(jié)合。為了使目標(biāo)蛋白在皮膚中長期持續(xù)表達(dá)，被轉(zhuǎn)入的DNA需要被引入基底細(xì)胞中。例如，該系統(tǒng)在體外用于自殺基因療法，在體內(nèi)用編碼EBV病毒元件的質(zhì)粒和1型單純性皰疹病毒基因來增力口細(xì)胞對化學(xué)療法藥物 ganciclovir 的敏感性(Maruyama-Tabata, H. et ah, Gene Ther.， 7，53-60 (2000))。并且，將可編碼β 2-腎上腺素受體和攜帶有EBV元件的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入倉鼠心室肌中，可以實現(xiàn)β 2-腎上腺素受體的長期表達(dá)(Tomiyasu，K. et a Gene Ther.，7， 2087-93(2000))。如果被轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA被整合進(jìn)了皮膚基底細(xì)胞或其他具有美容功能的細(xì)胞染色體DNA中，它就可以在細(xì)胞分裂時被傳遞給子細(xì)胞，這樣就可以使相應(yīng)的蛋白進(jìn)行持續(xù)表達(dá)。將轉(zhuǎn)入的DNA整合到染色體DNA中需要使用到一種酶，這種酶可以切割染色體DNA， 從而使被轉(zhuǎn)入DNA插進(jìn)去。一種有效的將DNA插入到具有美容功能的細(xì)胞基因組中的方法是使用轉(zhuǎn)座子，例如“睡美人”(SB)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。因此，在一個實施方案中，轉(zhuǎn)座子可以實現(xiàn)特定構(gòu)建體從供體質(zhì)粒向哺乳動物基因組的精確轉(zhuǎn)移(參考Hackett，P.B. , et ah, Adv. in Genet, 54，189-232 (2005)，同時參考美國專利No. 6，489，458))。以轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)的方法中， 除了攜帶可以編碼維持具有美容功能的細(xì)胞的核酸或多肽的DNA外，被轉(zhuǎn)入的DNA還包含有轉(zhuǎn)座酶編碼序列或者轉(zhuǎn)座酶mRNA。例如，SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是由約有340個堿基對的兩個終端重復(fù)序列組成的，它可以介導(dǎo)外源性核苷酸序列近乎隨機地插入基因組的TA堿基對中(雖然兩側(cè)的DNA序列可能會影響特定位點整合的幾率)。SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)被用于模擬人體疾病的小鼠疾病的研究中，并且使得激活體細(xì)胞癌基因的NARS基因被整合到小鼠肝細(xì)胞 DNA 中(Carelson et al, Proc. Nat. Acad. ScL U. S. A.，102，17059-64Q005))。在另一個實施方案中，可通過噬菌體整合酶實現(xiàn)基因組的整合(reviewed in Groth, A.C.&Calos，Μ· P.，J. Biol. Chem. , 335 (3), 667-678 (2004)) 例如，噬菌體整合酶可用于介導(dǎo)兩個不同的、相對較短序列的高效特異性重組。因此，發(fā)現(xiàn)絲氨酸催化家族的 OC31整合酶在人細(xì)胞中可以高效地調(diào)節(jié)識別位點的整合，以及調(diào)節(jié)與這些位點具有部分同源性的宿主染色體序列的整合。MM在某些實施例中，多聚核苷酸編碼至少一個維持細(xì)胞美容功能以而增強和/或維持對美容具有積極效果的生理生化反應(yīng)的核酸或多肽，該多聚核苷酸可與藥物相容的載體相混合，從而產(chǎn)生治療用的化合物，該化合物可用于具有美容功能的細(xì)胞的治療。對于用到本發(fā)明的各種方法和成分的大量闡述都在美國專利出版號為No. 2006/0058256和No. 2006/0025363中被描述過，這兩篇專利的全文均被包含在本文的參考文獻(xiàn)中。在一個實施方案中，本發(fā)明的組成包括一個局部給藥制劑。該制劑由溶解或懸浮在媒介中的物質(zhì)組成，如凝膠、洗滌劑、乳液，懸浮物或載體還可能包括礦物油、石油、酒精或者藥物處方的其他基礎(chǔ)成分。任何其他合適的配方均可用于轉(zhuǎn)運這些化合物，這些化合物可能包括本技術(shù)領(lǐng)域中公知的藥物佐劑，就如Remington' s的醫(yī)藥科學(xué)所描述的那樣 (16版，1980)。在某些實施方案中，在化合物中加入其他成分，例如可可油和蘆薈，也是可行的。制劑可能包括那些適合于口腔，直腸，局部，鼻，眼或注射(包括皮下，肌肉注射和靜脈注射)治療的藥物制劑，所有的這些都可能作為本發(fā)明的給藥途徑。制劑可以以劑量方便的形式呈現(xiàn)，也可以通過藥劑技術(shù)領(lǐng)域公知的方法制備。制劑可能通過由一個或多個助劑構(gòu)成的載體來使活性化合物激活而進(jìn)入相應(yīng)組織。在一般情況下，配方是由液體載體或精細(xì)分開的固體載體或兩者結(jié)合將活性化合物帶入組織的，然后，如有必要，將產(chǎn)品包裝成所需的制劑。適合用于注射給藥的制劑，可方便地制成無菌水制備的活性化合物，最好與受體的血液等滲。噴鼻劑制劑可能是包含防腐劑和等滲劑的活性化合物的水溶液。這種制劑最好調(diào)整其pH和等滲狀態(tài)，使之與鼻腔粘膜兼容。直腸給藥制劑可能通過一個合適的載體制成栓劑的形式，如可可脂，氫化脂肪或
氫化脂肪羧酸。眼科制劑可通過與噴鼻劑類似的方法來制備，除了將pH和等滲因素調(diào)整到最適用于眼的狀態(tài)。本發(fā)明的制劑適用于口服給藥，制劑可能是制成為獨立單元，如膠囊，扁囊，片或含片，每種都包含等同于粉末或顆?；蛑|(zhì)體或懸浮在水溶液中或非水液體中的預(yù)定量， 如糖漿，酏劑，乳液或頓服水劑。例如，藥片可任意與一個或多個助劑壓縮成型。壓縮藥片可在一個合適的機器中壓縮形成?；钚曰衔镆苑勰┗蝾w粒等自由流動的形式通過粘合劑，崩解劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，表面活性劑或分散劑以任意比例進(jìn)行混合。合適的粉末狀活性化合物的混合物及其載體組成的模壓片可能會在一個合適的機器成型。或者，糖漿可能通過將活性化合物加入到濃縮的糖水溶液，例如蔗糖，也可以添加任何助劑。這種助劑可能包括調(diào)味劑，合適的防腐劑，延緩糖結(jié)晶劑，增加其他成分溶解度的試齊U，如多元醇，甘油或山梨醇。在實施例中，參與維持細(xì)胞美容功能的編碼至少一個核酸或多肽的藥劑可能是局部的。局部給藥制劑可能包含溶解或懸浮在一種或多種媒介的活性化合物，如礦物油，凡士林，多羥基醇或外用藥物制劑中使用的其他基質(zhì)，可能還需添加其他助劑。例如，本發(fā)明的制備形式可能是護膚霜，面霜，乳液，軟膏，或任何其他適于皮膚局部使用的形式(美國專利4760096全部納入?yún)⒄?。根據(jù)其預(yù)期用途，可添加其他成分使其具有適于皮膚的流變性能。因此，在實施例中，本發(fā)明的制劑可能是溶液的形式，如水溶液，膠體溶液，乳化乳液，水包油型的霜(親水膏)或水凝膠，其中水相是連續(xù)相。另外，制劑也可能是油性混合物的形式，如軟膏，油包水型的面霜，凝膠質(zhì)地，吸收基質(zhì)或親水性軟膏中，油相是連續(xù)相。此夕卜，可能會添加非水的水溶性基質(zhì)，如聚乙二醇的混合物，此外，在具體實施中，也可以制成添加了固體分散劑的懸浮基質(zhì)，如震動乳液?？梢允褂糜托猿煞?，乳化劑，分散劑，凝膠劑和固體材料來制備這些制劑，它們都是眾所周知的化妝品和外用產(chǎn)品中常用的成分。本技術(shù)領(lǐng)域公知的可使用的油性成分可能包括碳?xì)浠衔锶缫后w石蠟，凡士林， 固體石蠟，微晶蠟等。此外，高級脂肪醇，如十六醇，十六烷醇，硬脂醇，油醇，酸酯的高脂肪低醇，如十四酸異丙酯或十六酸異丙酯，植物油，改性植物油，無水羊毛脂及其衍生物，角鯊烯或角鯊?fù)椋呒壷舅?，如棕櫚酸、硬脂酸。在一個實施例中，藥劑可使用物理層(如擦皮術(shù)和包藏)，和/或化學(xué)滲透/滲透促進(jìn)劑(二甲基亞砜，氮酮，醇，脂肪酸和萜烯)，已經(jīng)證明滲透增強劑能擾亂或液化角質(zhì)層的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)以增加通透性)。此外，本發(fā)明的藥劑可使用其他增強通透性的方法，例如，電整合，超聲，改變細(xì)胞的同滲容摩，納米粒子和任何其他合適的能有效地加強本發(fā)明的藥劑的滲透性的技術(shù)或方法，例如，局部用藥。在一個實施例中，L-絲氨酸，L-羥脯氨酸，或其他可能增強和/或有助于增強生長因子作用的氨基酸，都可能包括在本發(fā)明的藥劑中。在另一個實施例中，本發(fā)明的局部給藥制劑可能包含有用的乳化劑和陰離子、陽離子、非離子表面活性劑等分散劑。非離子表面活性劑可能是首選，因為它們對皮膚的刺激性較小。典型的非離子表面活性劑可能包括，如單硬脂酸甘油酯等單甘酯，山梨醇等脂肪醇，蔗糖脂肪酯，聚氧乙烯硬脂酸酯等聚氧乙烯脂肪，十六烷基聚氧乙烯醚等聚乙二醇高等醚醇，聚乙二醇醚，聚乙二醇脂肪酸之類的(美國專利4760096)。此外，還可以使用如羧甲基纖維素，纖維素膠，聚乙烯醇，聚乙二醇和各種樹膠等凝膠劑。這些油性成分，乳化劑，分散劑和凝膠劑可單獨使用或相互結(jié)合使用。此外，還可使用納米乳液。除上述成分外，本發(fā)明的制劑可能還包括一種或多種助劑，如稀釋劑，緩沖劑，調(diào)味劑，粘合劑，崩解劑，表面活性劑，增稠劑，潤滑劑，防腐劑(包括抗氧化劑)等之類的物質(zhì)。MM服用多核苷酸藥物，相當(dāng)于提供一定量的用于維持和/或改進(jìn)具有美容功能的細(xì)胞的多肽或多核苷酸。對于多肽的局部給藥，在不同的實施例中，用藥的劑量從lng/cm2到 lmg/cm2組織面積，或從10ng/cm2到100 μ g/cm2組織面積，或從IOOng/cm2到10 μ g/cm2組織面積，或從500ng/Cm2到10 μ g/cm2組織面積，或從1 μ g/cm2到5 μ g/cm2組織面積，或從 1 μ g/cm2到2 μ g/cm2組織面積?；蛘?，對于全身用藥(如腹腔)的劑量范圍可能從約lng/kg/d至100mg/kg/d，或從 lmg/kg/d 至 10mg/kg/d,或從 100ng/kg/d 到 5mg/kg/d,或從 1 μ g/kg/d 至 lmg/kg/d,或從100 μ g/kg/d到500 μ g/kg/d,或從10 μ g/kg/d到100 μ g/kg/d?；蛘?，在這些范圍內(nèi)都可以使用。在不同的給藥方案中，提供的多核苷酸相當(dāng)于多肽的劑量，范圍從lng/cm2到Img/ cm2組織面積，或從10ng/cm2到100 μ g/cm2組織面積，或從100ng/cm2到10 μ g/cm2組織面積，或從500ng/cm2到10 μ g/cm2組織面積，或從約1 μ g/cm2到5 μ g/cm2組織面積，或從 10 μ g/cm2到2μ g/cm2組織面積?；蛘?，在這些范圍內(nèi)都可以使用。例如，載體構(gòu)造可應(yīng)用裸DNA劑量，范圍從lng/cm2到lmg/cm2組織面積，或從10ng/cm2到10mg/cm2組織面積，或從100ng/cm2到100 μ g/cm2組織面積，或從500ng/cm2到 10 μ g/cm2組織面積，或從1 μ g/cm2到5 μ g/cm2組織面積，或從10 μ g/cm2到2 μ g/cm2組織面積?；蛘?，在這些范圍內(nèi)都可以使用。這些劑量范圍通過在體外和動物中，在感興趣的美容細(xì)胞中研究得到精確的基因轉(zhuǎn)染效率來確定。同樣地，可使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的其他特定的方法來確定其他載體如脂質(zhì)體，超微粒子，納米乳液，顆粒介導(dǎo)傳遞，電壓驅(qū)動傳遞的劑量范圍。在評估有美容功能的細(xì)胞的基因改造的研究時，質(zhì)?？稍谌魏蝿┝糠秶o藥，在具有美容功能的細(xì)胞中產(chǎn)生了預(yù)期的效果。例如，質(zhì)?？梢院线m的制劑通過局部途徑給藥， 個人劑量范圍約從5到2000微克/毫升(μ g/ml)，較好的個人劑量范圍是從50至1000微克/毫升；更好的個人劑量范圍約從100至500微克/毫升。有研究表明，亞治療的微磨皮術(shù)可用于是提高KGF-lpDNA到豬皮的傳遞速度，劑量約為100到500 μ g/ml KGF_lpDNA。 根據(jù)一個給藥方案，質(zhì)粒傳遞的濃度為100，250，500，750，1000，1500和2000微克/毫升 (μ g/ml 的)。因此，本發(fā)明的實施例考慮到有美容功能的細(xì)胞的基因修飾能提高和/或維持基因表達(dá)，這可能會刺激皮膚蛋白的生長，所以看起來更年輕。在一些實施例中，本發(fā)明的方法和成分對于目前可用的化妝品增強劑可能有明顯的優(yōu)勢，包括整形外科，肉毒桿菌 (注射用肉毒毒素)，激光換膚，微磨皮術(shù)，脈沖光治療，注射填充劑/結(jié)締組織替代，自體成纖維細(xì)胞注射，局部皮膚護理產(chǎn)品等其他方法。比起組織的局部給藥，本發(fā)明有一個優(yōu)勢，本發(fā)明的方法和成分能更好的將治療性分子定量輸送到有美容功能的細(xì)胞。此外，在某些情況下，局部使用的復(fù)合物，包括生長因子，可能會被蛋白酶快速的消化從而限制了其功效的持續(xù)時間，或刺激免疫原性反應(yīng)。本發(fā)明的實施例可能會刺激有美容功能的細(xì)胞生成，進(jìn)而增加細(xì)胞本身的蛋白生成，因此，有可能會減少蛋白酶激活或免疫原性反應(yīng)。與建議每日兩次局部用藥以達(dá)到改善美觀的生長因子蛋白產(chǎn)品不同，本發(fā)明的給藥方案，可提供每周一次或每月一次劑量(即全面的美容效益不需要每天或每天兩次的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用程序)，或在干細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，一次劑量就可改善外觀。恒晝夜化妝品都在提高多肽的表達(dá)。例如質(zhì)粒編碼的角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，在7天內(nèi)，比起有表達(dá)高峰和低谷期的每日兩次局部用藥的KGF多肽，有明顯的優(yōu)勢。實際上，這種方法將皮膚變成一個能持續(xù)生產(chǎn)具有美容功效的多肽的生物反應(yīng)器。此外，由于本發(fā)明的方法和成分的用藥頻率比局部治療量常常要低一些，本發(fā)明的方法和成分可以消除或降低創(chuàng)傷性，有時復(fù)雜的手術(shù)、注射和激光/光療法會對皮膚產(chǎn)生損害。本發(fā)明通過減少用藥頻率來改善。亞治療的微磨皮術(shù)為確定皮膚蛋白和其他生物分子，如膠原，彈性蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，蛋白多糖， 生長因子的表達(dá)和/或水平是否在皮膚上有整容修復(fù)的效果，并大幅評價完整的細(xì)胞的美容遺傳改造后是否有美容功能，首選使用亞治療的微磨皮術(shù)。質(zhì)粒DNA(pDNA)的傳遞通過完整的皮膚利用各種滲透增強術(shù)已深入研究，包括屏障破壞(如微磨皮術(shù)和膠帶剝離)，脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體)，和不穩(wěn)定膜技術(shù)，如電擊(Choi MJ 禾口 Maibach HI. Topical Vaccination of DNA Antigens :Topical Deliveryof DNA Antigens. Skin Pharmacol. App 1. Skin Physiol. 2003 ；16 :271-282)。高分子量質(zhì)粒DNA，需要滲透到最上面的角質(zhì)層以達(dá)到可行的角質(zhì)細(xì)胞。用膠帶剝離和創(chuàng)面電灼術(shù)物理擊穿角質(zhì)層以提高大分子及質(zhì)粒DNA穿過動物皮膚的傳遞速度(Yu WH, Kashani-Sabet M, Liggitt D, Moore D, Heath TD, Debs RJ. Topical gene delivery to murine skin. J Invest Dermatol 1999 ；112 :370-375)。Lee^A (Microdermabrasion as a novel tool to enhance drug delivery via the skin :an animal study. Dermatol Surg. 2006Aug ；32 (8) : 1013-22)發(fā)現(xiàn)亞治療的微磨皮術(shù)(即，使用低吸入壓力和短期治療持續(xù)時間[15cmHg 10秒=20千帕])將小鼠和豬的藥物傳遞速度增加了 8-M倍。亞治療的微磨皮術(shù)的治療參數(shù)的強度低于用于治療目的微磨皮術(shù)(即減少皺紋)，而且不引起皮膚炎癥反應(yīng)。使用亞治療的微磨皮術(shù)，微觀分析已經(jīng)證明整個皮膚沒有明顯的破壞，只是角質(zhì)層(SC)輕微稀疏。SC層出現(xiàn)集中和壓實。表皮和真皮層沒有變化，亞治療的微磨皮術(shù)得到的結(jié)果是可控和可重復(fù)的。增加的高分子的傳遞也可在靈長類動物和人的微磨皮術(shù)中看到(I^rausnitz MR, φ Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 2008Nov ；26 (11) :1261-8 ；Gill HS, 等 Selective removal of stratum corneum by microdermabrasion to increase skin permeability. Eur J Pharm Sci. 2009) 吉爾等人O009)發(fā)現(xiàn)，可通過控制經(jīng)過猴子和人的頭部的微磨皮術(shù)中的皮膚來控制去除角質(zhì)層的程度。然而，變壓(25kPa vs 50 kPa)并沒有表現(xiàn)出差異。如本示例所述，可以在不同哺乳動物物種中可靠地使用亞治療的微磨皮術(shù)，例如， 在小鼠或豬。應(yīng)該理解，本文所述的實驗研究(例如，如前所示的例子)包括用亞治療的微磨皮術(shù)的研究，也可以在其他哺乳動物物種中進(jìn)行，例如，為確定其他生長因子是否表達(dá)， 如，對皮膚有美容修復(fù)功效的PDGF(血小板衍生生長因子)。亞治療的微磨皮術(shù)也可以用來評估完整的細(xì)胞被遺傳修飾后是否有美容功效。此外，除了亞治療的微磨皮術(shù)以外的技術(shù)，也可以用來評估其他生長因子是否表達(dá)，如對皮膚有美容修復(fù)功效的PDGF (血小板衍生生長因子)。組織學(xué)和其他分析方法在動物研究中，為確定皮膚蛋白和其他生物分子，如膠原，彈性蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，蛋白多糖，生長因子的表達(dá)和/或水平在皮膚上是否有美容修復(fù)的功效，并評價完整的細(xì)胞通過美容遺傳改造后其美容功能，其結(jié)果可通過標(biāo)準(zhǔn)且著名的組織學(xué)程序進(jìn)行分析。組織學(xué)程序也可以用來分析在光或電子顯微鏡下有很小差別的物體，因為著色使兩個組織形成對比，同時使感興趣的特定的特征更顯著。例如，在涉及KGF-I質(zhì)粒DNA傳遞到動物的皮膚的研究時，并要確定KGF-I的表達(dá)在皮膚上是否有美容修復(fù)的效果，可以利用標(biāo)準(zhǔn)和知名的組織學(xué)程序。類似的組織學(xué)程序也可以用來評價一個或多個其他生物大分子的表達(dá)是否對皮膚有美容修復(fù)的功效。使用組織學(xué)程序的例子包括使用光顯微鏡的污跡，如蘇木精和曙紅(H&E)的污漬。其他知名的及建立在組織學(xué)和組織病理學(xué)上的程序，也可用于評估一個或多個其他生物大分子的表達(dá)在皮膚上是否有美容修復(fù)的效果。也可以采用其他典型的染色技術(shù)，包括馬森三色染色法，這是組織學(xué)經(jīng)常使用的典型的三色染色法，還有馮·吉布森染色染色的。使用H&E進(jìn)行染色，梅森三色和馮·吉布森染色法，可用于各種組織學(xué)測量，包括皮膚厚度的分析，膠原和彈力纖維成分分析。在另一種典型的實施例中，H&E染色劑，可用于評估表皮的厚度，角質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量， 膠原厚度和真皮的密度的變化，KGF-I質(zhì)粒DNA傳遞到動物皮膚前后的變化。染色是使這兩個組織形成對比，以及突出感興趣的特定特征。蘇木，一種堿性染料，由于對細(xì)胞核中的核酸的親和力比較強，所以將核染成藍(lán)色；曙紅，一種酸性染料，將細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。醋酸鈾和檸檬酸鉛常用來使組織在電子顯微鏡下形成對比。此外，還有各種其他技術(shù)可用于選擇性染色細(xì)胞和細(xì)胞組分。其他化合物，可用于組織切片染色，例如， 番紅，剛果紅，固綠FCF，銀鹽，以及許多自然和人工染料。組織樣品也可以通過其他程序分析來確定皮膚蛋白和其他生物分子，如膠原，彈性蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，蛋白多糖，生長因子的表達(dá)和/或水平對皮膚是否有美容修復(fù)的功效，并評價完整的細(xì)胞通過美容遺傳改造后其美容功能。例如，抗體可以用來使特定的生物分子可視化，例如，用免疫組化，或利用免疫熒光進(jìn)行熒光染色。其他技術(shù)，如非放射性原位雜交，可與免疫組化結(jié)合起來，用于鑒定與免疫熒光和酶聯(lián)熒光擴增的熒光探針或標(biāo)簽結(jié)合的特定的DNA或RNA分子。不同的成像技術(shù)可用于研究組織學(xué)樣本，例如，染色后的組織樣本，或用熒光染色后的免疫熒光。在某些實施例中，熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡可用于檢測細(xì)胞內(nèi)的具體的熒光信號。數(shù)碼相機也可以用來捕捉組織學(xué)和病理學(xué)圖像。動物樽型根據(jù)此處所述的實施例，任何合適的動物模型都可用于確定皮膚蛋白和其他生物分子，如膠原，彈性蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，蛋白多糖，生長因子的表達(dá)和/或水平是否對皮膚有美容修復(fù)的功效，并大幅評價完整的細(xì)胞的美容遺傳改造后是否有美容功能?！皠游铩?一詞旨在包括但不僅限于任何哺乳動物的物種。這些哺乳動物的例子包括但不僅限于不同品種的豬(豬)和鼠科動物(小鼠)。熟悉這些領(lǐng)域的技術(shù)的人都知道，考慮到豬和和人的皮膚在生理和形態(tài)上已知的相似之處，豬的動物模型存在一定的優(yōu)勢。動物模型的選擇，需要對許多不同的因素進(jìn)行評估。在選擇一個合適的動物模型時，考慮的因素包括皮膚層的厚度及藥物通過皮膚的滲透能力。角質(zhì)層(SC)，這是表皮外的保護層，是疏水性的，帶負(fù)電荷的PDNA難以穿透這層 (Branski LK，等，Gene Ther. 2007Jan ； 14(1) :1_10)。小鼠背側(cè)皮膚角質(zhì)層的細(xì)胞只有1-2 層，兔子有1-2背部SC細(xì)胞層。相比之下，豬和人的角質(zhì)層的厚度和皮膚比較相似(Meyer， W.，等，1978，Curr. Prob. Dermatol. 7 :39-52 ；Bronaugh, R.，等，1982，Toxicol. Appl. Pharmacol. 62:481-488 ；Kiritsy CP，等Crit Rev OralBiol Med. 1993 ；4(5) :729-60)。人面部皮膚有9士2層；毛囊很少；非面部有14-17細(xì)胞層。小鼠有更薄的真皮層和較少的角化角質(zhì)層(Hengge, U. R.，等 J.Clin. Invest.，(1996) 97, 2911-2916) 皮膚的滲透性(通常比人體皮膚的滲透性高10-100倍)是選擇動物模型的一個考慮因素，如無毛小鼠和大鼠 (Paasonen L，等 Int.J.Pharm. 2006Jan 13 ；307 (2) :188-93)。正常治愈的豬模型已廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)性部分皮層傷口的研究，因為他們的皮膚外層與人及其相對無毛時很相似。此外，豬同人一樣，被認(rèn)為是緊皮膚的動物，與兔子和豚鼠等皮膚寬松的嚙齒類動物形成對比。松散皮膚的動物包含一層纖肌膜，那就是肌肉層下方、 附著在皮膚上的肉膜。Hengge等人(J. Clin. Invest. , (1996)97,2911-2916)報道，當(dāng)裸 PDNA通過皮內(nèi)注射入小鼠皮膚后，在表皮、真皮和底層的脂肪及肌肉中表達(dá)。而在豬和人的皮膚中，只在表皮中表達(dá)。同樣的，Glasspool-Malone (Mol. Ther. 2000 ；2 =140-146)等人報道PDNA注射入豬和獼猴后，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)很大程度上只局限于表皮。小型豬對于皮膚測試是一個很有吸引力的模型，因為它們的體型更小，與人的皮膚更相似(Mortensen JT，等 Scand. J. Lab. Anim. Sci. Supp 1. 1. 1998. Vol. 25)。兩個物種的表皮都比較厚，豬大約 70-140 毫米，人大約20-120毫米，不同地方有很大的區(qū)別。豬表皮類似于有網(wǎng)狀真皮-表皮結(jié)合點的人。各種動物模型的皮膚滲透性排名大致如下家兔>大鼠>豚鼠>豬>獼猴>人。小型豬的皮膚對刺激物不如兔皮膚敏感?；谥T多因素的評價，豬是一個適于局部實施PDNA 測試的動物模型。正如此處其他所述，本文所有引用參考全部納入在此披露。應(yīng)該理解，此處所描述的典型實施例只是在描述意義上進(jìn)行考慮，不是限制使用目的。據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域公認(rèn)，在這些實施例中可能會有一些變化，但沒有違背該發(fā)明的原則和精神，其范圍在要求及其等價物中有限制。
實施例此處描述的實施例描述四個編碼設(shè)計為改進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性和支持皮膚的改進(jìn)的外觀的重組載體構(gòu)建體的合成。這些都是膠原，彈性蛋白，EC-SOD和TIMP-I。此處詳細(xì)討論了這些蛋白在皮膚生理學(xué)中的作用。每個構(gòu)建的質(zhì)粒由以下組成一個有用的基因和有人巨細(xì)胞病毒立早啟動子的設(shè)計為提供高水平穩(wěn)定性和瞬時表達(dá)該有用的基因的質(zhì)粒cDNA。整合到該質(zhì)粒cDNA載體的基因包括膠原1，彈性蛋白，金屬蛋白酶_1組織抑制劑(TIMP-I)，和細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)。包含有用的基因的cDNA質(zhì)粒構(gòu)建體可被制成局部使用的護膚霜。實施例2描述了擴增，克隆和表達(dá)來自人肺組織的cDNA的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-1(KGF-1，F(xiàn)GF-7)。此外，此處描述的實施例也描述了給小鼠局部施用的KGF質(zhì)粒評估的研究(實施例3)。在小鼠中也進(jìn)行了亞治療的微磨皮術(shù)的效度研究(實施例4中描述)；并且在小鼠中進(jìn)行劑量增加研究(實施例5中描述)。豬體內(nèi)也進(jìn)行了一獨立組的試驗性研究。通過實例，實施例6描述了在豬體內(nèi)進(jìn)行的亞治療的微磨皮術(shù)的效度研究；實施例7描述了在豬體內(nèi)進(jìn)行的劑量范圍研究。實施例1-擴增、克隆和表達(dá)來自ιΗ常組織cDNA的1型人膠原al，l型膠原α 2， TIMP-I及彈力蛋白從正常的人組織產(chǎn)生的第一鏈cDNA購自BioChain研究所(Hayward，CA)。 1型膠原α I(COLAlA)，1型膠原a2(C0LlA2)和彈性蛋白從正常人皮膚(目錄號 C1234218-10)的cDNA擴增，而TIMP-1從正常的人肺(目錄號C1234152_10)和腦(目錄號C1244035-10)的cDNA擴增。使用高保真的鉬Pfx聚合酶Qnvitrogen Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn)行基因擴增，參照說明書，使用基因的特定寡核苷酸。表1概述了用于每種基因擴增的寡核苷酸序列，以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的條件。表1也顯示了自正常人組織cDNA擴增C0LA1A，C0L1A2,彈性蛋白及TIMP-1所用的寡核苷酸序列和PCR參數(shù)。表 1從正常組織克隆C0LA1A，C0L1A2,彈性蛋白及TIMP-lcDNA的引物及PCR參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種用于受試者中基本完整的具有美容功能的細(xì)胞的美容遺傳修飾的方法，所述方法包括對至少一部分所述細(xì)胞給予分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼涉及維持具有美容功能的細(xì)胞的核酸或多肽的至少一種，以使所述核酸或多肽在所述具有美容功能的細(xì)胞中表達(dá)以增強和/或維持具有對于美容外觀有積極作用的生物化學(xué)和/或生理學(xué)過程。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含至少以下一種(i)序列ID號24的核苷酸446至1030 ;(ii)或與序列ID號24的核苷酸446至1030有至少90 %同一性的序列；或(iii)編碼具有SEQ ID號23序列的蛋白的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括質(zhì)?；蛘卟《据d體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多核苷酸在至少一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中保持為染色體外質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽包括角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其生物學(xué)活性的衍生物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中至少兩種不同的多肽或核酸分子被給予至所述細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼涉及維持具有美容功能的細(xì)胞的核酸或多肽的多核苷酸被可手術(shù)地連接至組成型或誘導(dǎo)型啟動子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述啟動子不是普遍地表達(dá)，而是在具有美容功能的細(xì)胞中表達(dá)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼涉及維持具有美容功能的細(xì)胞的核酸或多肽的多核苷酸被可手術(shù)地連接至增強子。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼涉及維持具有美容功能的細(xì)胞的核酸或多肽的多核苷酸被可手術(shù)地連接至以下至少一種功能性多聚A序列，內(nèi)含子，剪切序列，終止序列或者加帽位點。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)修飾的有美容功能的細(xì)胞包含以下至少一種角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，脂肪細(xì)胞或肌原纖維。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸以裸DNA被轉(zhuǎn)入至具有美容功能的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸被經(jīng)以下至少一種轉(zhuǎn)入至具有美容功能的細(xì)胞中脂質(zhì)體、納米顆粒、乳劑、thixogel或感官性能的凝膠。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸通過油包水乳劑或水包油乳劑被轉(zhuǎn)入具有美容功能的細(xì)胞中。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸經(jīng)以下至少一種方式被轉(zhuǎn)入具有美容功能的細(xì)胞中顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，電驅(qū)動的轉(zhuǎn)移，射頻消融介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，或超聲波，微針。
16.一種用于遺傳修飾受試者中基本完整的具有美容功能的細(xì)胞的組合物，所述組合物包含編碼涉及維持具有美容功能的細(xì)胞的分離的核酸或多肽的至少一種的多核苷酸；和用于將所述多核苷酸給予至至少一部分所述具有美容功能的受試者細(xì)胞的載體，以使所述核酸或多肽在具有美容功能的細(xì)胞中表達(dá)以增強和/或維持具有美容外觀的積極作用的生物化學(xué)和/或生理學(xué)過程。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述多核苷酸包含序列ID號 的核苷酸446至1030 或與序列ID號24的核苷酸446至1030有至少90%的同一性的序列；或編碼有序列ID號23的序列或與序列ID號23有至少90%同一性的序列的蛋白的多核苷酸。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述多核苷酸包括質(zhì)?；蛘卟《据d體。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中所述多肽包括角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其生物學(xué)活性的衍生物。
20.權(quán)利要求16的組合物，包含至少兩種不同的多肽或核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明公開的以下方法和組合物用于遺傳修飾基本完整的具有美容功能的細(xì)胞以增強哺乳動物的美容外觀，從而增強和/或維持對美容外觀有積極作用的生物化學(xué)的和/或生理過程。所述方法和組合物可提供美容益處，比如減少的皮膚下垂，增加的皮膚厚度，減少的皺紋，增加的皮膚厚度和膠原含量，增加的膚色和彈性，增加的皮膚水合作用，改善的皮膚質(zhì)地和顏色。
文檔編號C12N15/09GK102471769SQ201080032214
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者亞倫·T.·塔波爾, 約翰·沃森·哈蒙 申請人:亞倫·T.·塔波爾, 約翰·沃森·哈蒙