專利名稱：神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠促進(jìn)皮膚產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法。
背景技術(shù)：
皮膚具有產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(ceramide)和葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide)的能力。在皮膚中、特別是表皮角質(zhì)層中聚集著由表皮細(xì)胞合成分泌得到的神經(jīng)酰胺，它是細(xì)胞間脂質(zhì)的主要成分。而由表皮細(xì)胞合成得到的神經(jīng)酰胺暫時(shí)以葡萄糖神經(jīng)酰胺或者神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin)的形式被儲(chǔ)存起來(lái)；之后被排出至細(xì)胞外，在葡糖腦苷酯酶 (glucocerebrosidase)和神經(jīng)磷脂酶(sphingomyelinase)的作用下，再次形成神經(jīng)酰胺， 從而發(fā)揮作為細(xì)胞間脂質(zhì)的功能。皮膚中的神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺具有提高皮膚的保濕功能和皮膚的屏障功能等的生理作用。但是，近來(lái)由于環(huán)境、氣候等的影響，皮膚容易變得干燥，因此由皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺等來(lái)改善皮膚的保濕功能就顯得不足夠。因而人們嘗試了從外部向皮膚補(bǔ)充神經(jīng)酰胺的方法。例如，在專利文獻(xiàn)1中記載了培養(yǎng)假絲酵母(Candida)屬的微生物來(lái)制造葡萄糖神經(jīng)酰胺的方法，通過(guò)將該葡萄糖神經(jīng)酰胺涂布在人體的干燥性皮膚上能夠改善皮膚的保濕功能。該方法是直接從培養(yǎng)后的菌體中獲取大量存在的葡萄糖神經(jīng)酰胺，因此所合成的葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺骨架與人體中存在的神經(jīng)酰胺類的神經(jīng)酰胺骨架不同，其在兩處具有碳碳雙鍵且具有支鏈。因此，將這種從微生物中直接提取得到的葡萄糖神經(jīng)酰胺涂布在人體皮膚上的話，有可能不能與人體皮膚相適應(yīng)而產(chǎn)生使用安全性方面的問(wèn)題。另外，專利文獻(xiàn)6中報(bào)道了從芽孢桿菌屬的醋酸菌中獲得醋酸菌型神經(jīng)酰胺的方法。但這種方法所獲得的神經(jīng)酰胺也存在上述的不能與人體皮膚相適應(yīng)的問(wèn)題。并且這樣的方法需要從菌體中進(jìn)行提取來(lái)獲得神經(jīng)酰胺等的操作，工序復(fù)雜且成本高。另外，從外部向皮膚補(bǔ)充神經(jīng)酰胺的方法與以往使用的保濕劑等同樣有保濕效果的持續(xù)性不夠的問(wèn)題，而且有些狀態(tài)的皮膚對(duì)從外界補(bǔ)給的神經(jīng)酰胺等的吸收不充分，從而導(dǎo)致不能充分發(fā)揮保濕效果。而另一方面，如果能夠增強(qiáng)或促進(jìn)皮膚本身的神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生能力，則無(wú)需從外部補(bǔ)充神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，而能夠通過(guò)促進(jìn)皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺來(lái)提高皮膚的屏障功能和保濕功能。這樣，由于是由皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，所合成的是皮膚所具有的常規(guī)結(jié)構(gòu)的神經(jīng)酰胺等，因而其不存在與皮膚的適應(yīng)性不好等的安全性問(wèn)題。因此最近關(guān)于在皮膚角質(zhì)層中產(chǎn)生促進(jìn)表皮神經(jīng)酰胺等的生成的物質(zhì)的研究相當(dāng)熱門。其中，作為能夠促進(jìn)神經(jīng)酰胺生成的物質(zhì)，已報(bào)道的有以靈芝、蜂花粉(Bee Pollen)、川芎等的提取物為有效成分的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑(專利文獻(xiàn)2 4)。然而，由于這些神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑全都是從植物原料提取得到，其提取操作耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且在天然資源的可利用性方面有限制，因而其制造成本高。另外，在專利文獻(xiàn)5中，公開(kāi)了一種能夠活化皮膚表層內(nèi)部的表皮細(xì)胞自身的神經(jīng)酰胺合成的神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑，其以含有煙酸和/或煙酰胺的菌培養(yǎng)物為有效成分， 該菌培養(yǎng)物可以是乳酸菌培養(yǎng)物、雙歧桿菌培養(yǎng)物、香菇菌體培養(yǎng)物或者酵母菌培養(yǎng)物。但是，該促進(jìn)劑的制備過(guò)程中使用的培養(yǎng)基實(shí)質(zhì)上以煙酸和/或煙酰胺作為有效成分，因此這種神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑的制備成本較高。另外，芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物普遍地存在于水中以及泥土中。其中也有很多菌種甚至適應(yīng)高PH、低溫、高鹽濃度、高壓等的各種各樣的極限環(huán)境。芽孢桿菌屬 (Bacillus)中包括以枯草芽孢桿菌為代表的多種非常有用的菌種，它們可被用于生產(chǎn)各種酶(食品用酶、洗滌劑用酶以及其它多種多樣的工業(yè)用酶)等用途。但是，目前還沒(méi)有利用芽孢桿菌屬細(xì)菌來(lái)制備神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的報(bào)道。專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2010-22217號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2005-194240號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2010-70499號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本特開(kāi)2010-150237號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 日本特開(kāi)平9-194383號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 日本特開(kāi)2006-345796號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題而做出的，目的在于提供一種低成本且高效地制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的方法。本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行了專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，能夠高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑；從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供一種神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠使用特定的微生物并利用豆渣這樣的容易獲得的物質(zhì)作為培養(yǎng)基的主要原料，從而能夠廉價(jià)且高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，該促進(jìn)劑能夠有效提高皮膚所具有的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺的能力，從而有效提高皮膚的保濕能力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的制造方法是在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus) 的微生物，并從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。作為在本發(fā)明中使用的芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，可以列舉出枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酸居芽孢桿菌(Bacillusacidicola)、吉氏芽孢桿菌 (Bacillus gibsonii)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)、錯(cuò)狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、 球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、擴(kuò)散芽孢桿菌(Bacillus diffusus)、球芽孢桿菌 (Bacillus globigii)、角軍淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、膠質(zhì)芽抱桿菌(Bacillus mucilaginosus)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)等。其中，從所獲得的產(chǎn)品具有更高的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酸居芽孢桿菌 (Bacillus acidicola)、吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本發(fā)明所涉及的芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物都可以從中國(guó)普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心(CICIM)等商業(yè)渠道購(gòu)買得到。在本發(fā)明的制造方法中，可以單獨(dú)使用1種上述微生物，也可以組合2種以上的上述微生物進(jìn)行使用。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基是含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基。豆渣和糖類都是容易獲得的物質(zhì)，因而，本發(fā)明的培養(yǎng)基具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。并且，除此之外，也可以適當(dāng)添加例如的蛋白胨、0.5%的酵母粉等。其中，豆渣是指，將大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、再經(jīng)過(guò)濾、除水、浙干而得到的物質(zhì)。也可以使用食品產(chǎn)業(yè)中壓榨豆?jié){等的豆制品制造工序中殘留的大豆殘?jiān)Ｌ穷惪梢允瞧咸烟恰⒄崽?、麥芽糖等，它們可以任意單?dú)使用或混合使用。而從提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)考慮，其中優(yōu)選葡萄糖。從提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)考慮，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成，進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)基中豆渣的含量為5 20w/
、更優(yōu)選8 12w/v%，葡萄糖的含量為0. 2 2w/v%、更優(yōu)選0. 8 1. 2w/v%。從芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物的生理特性、以及提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選在27 35°C下進(jìn)行上述培養(yǎng)。從芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物的生理特性、以及提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)考慮，上述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為1 7天，更優(yōu)選為 48 96小時(shí)，更優(yōu)選為68 76小時(shí)。從得到更純的產(chǎn)品的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選將通過(guò)所述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物進(jìn)一步進(jìn)行精制從而得到上清液。作為精制的方法，可以根據(jù)需要適當(dāng)組合使用過(guò)濾、離心分離、離子交換或吸附色譜、溶劑提取、結(jié)晶化等的常用的操作來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選通過(guò)離心分離獲得上清液， 該離心分離的速度優(yōu)選為2000 4000rpm、更優(yōu)選為2500 3500rpm，離心時(shí)間優(yōu)選為0 20分鐘，更優(yōu)選為5 15分鐘?？梢栽陔x心后獲得的上述上清液中加入乙醇，用來(lái)進(jìn)行滅菌，并將加入了乙醇的上清液作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
也可以通過(guò)離心分離從培養(yǎng)液中除去菌體，再超聲波處理，離心分離，回收上清液。接著，再將回收后的上清液過(guò)濾除去雜質(zhì)等，真空下干燥處理后作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物并從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘?jiān)l(fā)酵提取物，能夠起到在正常人體的角化細(xì)胞中使神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的量增加的作用。因此，通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物而從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘?jiān)l(fā)酵提取物，可以用于促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的治療目的或非治療目的的使用，也可以作為治療目的或非治療目的的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑使用。非治療目的的使用是以美容為目的的使用，或?yàn)榫S持健康狀態(tài)的使用等。并且，所述治療目的的使用和非治療目的的使用是可以完全區(qū)分地進(jìn)行的。通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物而從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘?jiān)l(fā)酵提取物，也可以用于制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑可以作為使角質(zhì)層中的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺增加并恢復(fù)和提高皮膚的屏障功能和保濕功能的醫(yī)藥品、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等使用。另外，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑也可以作為以神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)為概念的、并根據(jù)需要標(biāo)明該概念的準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品使用。作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的使用形態(tài)，可以是用于向培養(yǎng)細(xì)胞中添加的添加劑，也可以是配合到皮膚洗凈劑、化妝品等皮膚外用劑中使用。例如，可以列舉化妝水、乳液、凝膠、霜、軟膏等各種形態(tài)。而作為外用劑的基劑，只要是公知的外用基劑即可，沒(méi)有特別限制。在配制各種皮膚外用劑時(shí)，可以單獨(dú)地使用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，或與在皮膚洗凈劑和化妝品等皮膚外用劑中通常配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、紫外線吸收劑、增稠劑、藥效成分、香料、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等適當(dāng)組合來(lái)使用。將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑添加到培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中來(lái)促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的情況下，作為該促進(jìn)劑的干燥物的添加量?jī)?yōu)選為0. 0001 10w/v%，更優(yōu)選為0. 001 5w/v%。當(dāng)添加量為0. 0001w/v%& 上時(shí)，能得到充分的促進(jìn)效果；而當(dāng)添加量為10w/V%以下時(shí)，對(duì)表皮細(xì)胞的刺激性更小。將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑配合在皮膚外用劑使用時(shí)，從有效促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生、從而有效提高皮膚的保濕能力、而且不易顯示出培養(yǎng)物的顏色和氣味的觀點(diǎn)出發(fā)，其配合量?jī)?yōu)選為皮膚外用劑總量的0. 01 20w/v%，更優(yōu)選為0. 1 10w/v%。實(shí)施例下面，基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于此。實(shí)施例1<神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備>首先，按照以下方法制備培養(yǎng)基將大豆放入水中浸泡12小時(shí)，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，將其過(guò)濾并除去液體成分，剩余殘?jiān)愀?，得到豆渣。將該豆渣與葡萄糖以及水相混合，并使豆渣和葡萄糖在混合物中的濃度分別達(dá)到 1(^八％和，將該混合物作為培養(yǎng)基。然后，將IOOml的上述培養(yǎng)基加至三角燒瓶中，接種一定量的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1677)，在30°C下培養(yǎng)3天。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，對(duì)該無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm)30分鐘，收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品A、B，將樣品A、B分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。<神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的評(píng)價(jià)>(細(xì)胞培養(yǎng))首先，取正常人的活化角質(zhì)化細(xì)胞(Cascade Co.，Ltd)作為原代細(xì)胞，于75cm2培養(yǎng)瓶中(含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基anl)，370C XO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)細(xì)胞至80 90% 濃度。進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞至175cm2方瓶中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至80 90%濃度。然后將傳代后的人體表皮細(xì)胞接種到12孔板中，每孔容積為anl，細(xì)胞濃度為1 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至80 90%濃度。然后，在上述12孔板中更換不含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基，將樣品A、B和對(duì)照品(濃度為50v/v%的乙醇水溶液)分別加入上述12孔板中(η = 2)，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天。3天培養(yǎng)后，棄去上清培養(yǎng)液，以aiil PBS (磷酸鹽緩沖液)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2次清洗， 再加入Iml的PBS至板孔中，以細(xì)胞收集器(細(xì)胞鏟)收集細(xì)胞至試管中，以備后續(xù)神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺和蛋白質(zhì)分析。(神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的確認(rèn))在回收得到的含有細(xì)胞的PBS溶液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶劑， 進(jìn)行振動(dòng)20分鐘，進(jìn)行離心(3000rpm，5分鐘)分離，從而得到上清液a和沉淀b。將上清液a用于神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量的分析，將沉淀b用于蛋白質(zhì)含量的分析。(1)神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量的分析在由此得到的上清液a中加入PBS 氯仿=1. 25ml 1. 25ml的溶劑，進(jìn)行振動(dòng) 20分鐘，進(jìn)行離心(3000rpm，5分鐘)分離，得到上下兩相?；厥障孪?，并在30°C、氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行干燥40分鐘。在得到的干燥品中加入100 μ 1的氯仿甲醇=^iil Iml的溶劑進(jìn)行溶解，并用下述薄板層析(TLC)法對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(分別記為 Cer和GlyCer，單位為μ g/ml)的解析。將神經(jīng)酰胺(或葡萄糖神經(jīng)酰胺)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液點(diǎn)至干燥TLC板上，以 CHC13 CH30H CH3C00H(190 9 lv/v/v)為展層劑進(jìn)行薄板層析，待展層劑行至薄板頂端，以吹風(fēng)機(jī)吹干展層劑；重復(fù)以上步驟一次。然后以 CHCl3 CH30H C3H60(76 20 4v/v/v)為展層劑進(jìn)行薄板層析，待展層劑行至距薄板底端2. 5cm處，停止展層，以吹風(fēng)機(jī)吹干。噴以硫酸銅磷酸溶液，吹干，將層析板放置于180°C烘烤板上烘烤7分鐘顯色。掃描顯色TLC板并進(jìn)行神經(jīng)酰胺(或葡萄糖神經(jīng)酰胺) 分析。(2)蛋白質(zhì)含量的分析為了表征細(xì)胞中的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量分析。在上述沉淀b中加入90 μ 1的SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液并進(jìn)行混合，在60°C下加熱2小時(shí)使蛋白質(zhì)變性降解，冷卻后在其中添加100 μ 1的2N的HCl溶液，按照BCA Kit (蛋白質(zhì)定量分析試劑盒)法測(cè)定其中蛋白質(zhì)的量(記為ftx)，單位為yg/ml)。(3)分析結(jié)果對(duì)于本發(fā)明品和對(duì)照品的樣品，分別測(cè)定Cer/Pro和GlyCer/Pro (見(jiàn)下式)。以對(duì)照品的Cer/Pro和GlyCer/Pro為1，在表1中表示本發(fā)明品的Cer/Pro和GlyCer/Pro的相對(duì)值。另外，以對(duì)照品每孔中的蛋白質(zhì)的量為100，求出本發(fā)明品的每孔中的蛋白質(zhì)的量的相對(duì)值(ftx). (%))，并據(jù)此求出每孔的神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(相對(duì)于對(duì)照品的相對(duì)量)，即，Cer/Well = Cer/ProXPro. (% ), GlyCer/ffell = GlyCer/ProXPro. (% )。 一并表示在表1中。如果Cer/ftx)(或Cer/Well)大于1 (對(duì)照品的值)，則表明該樣品具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果；如果GlyCer/ftx)(或GlyCer/Well)大于1 (對(duì)照品的值)，則表明該樣品具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例1的樣品A、B具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。實(shí)施例2在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1923)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，對(duì)該無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm)30分鐘，收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品C、D，將樣品C、D分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品C、D的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例2的樣品C、D具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。實(shí)施例3在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用酸居芽孢桿菌(Bacillus acidicola)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1297)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品E，存于4°C冰箱中以備用作細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。對(duì)上述無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 30分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品F、G，將樣品F、G分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品E、F、G的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例3的樣品E、G具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。實(shí)施例4在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用吉氏芽孢桿菌(Bacillusgibsonii)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1171)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品 H，存于4°C冰箱中以備用作細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。對(duì)上述無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 30分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品I、J，將樣品I、J分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品H、I、J的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例4的樣品H、I、J具有神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。實(shí)施例5在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1294)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品 K，存于4°C冰箱中以備用作細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。對(duì)上述無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 30分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品L、M，將樣品L、M分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品K、L、M的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例5的樣品K、L、M具有神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。
實(shí)施例6在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1282)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品 N，存于4°C冰箱中以備用作細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。對(duì)上述無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 30分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品0、P，將樣品0、P分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品Ν、0、Ρ的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例6的樣品N、0、P具有神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。實(shí)施例7在實(shí)施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制備過(guò)程中，作為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(保藏于江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM，編號(hào)CICIM B1298)，除此以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)。然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇稀釋，對(duì)該無(wú)水乙醇稀釋后的混合液進(jìn)行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm)30分鐘，收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過(guò)濾得濾液，濾液于真空干燥機(jī)中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的樣品Q、R，將樣品Q、R分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細(xì)胞培養(yǎng)用添加物。按照與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)樣品Q、R的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，結(jié)果一并表示在表1中。如表1所示，確認(rèn)了實(shí)施例7的樣品Q、R具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果。表 權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酸居芽孢桿菌(Bacillus acidicola)、吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)或地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)。
3.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述糖類是葡萄糖。
4.如權(quán)利要求3所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)基由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求4所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)基中所述豆渣的含量為8 12W/v%，所述糖類的含量為0. 8 1. 2W/v%。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 在27 35 °C下進(jìn)行所述培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)時(shí)間為1 7天。
8.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 將通過(guò)所述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，從而得到所述上清液。
9.如權(quán)利要求8所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 在離心后獲得的所述上清液中加入乙醇后，將其作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
10.如權(quán)利要求9所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法， 其中，進(jìn)一步對(duì)所述加入了乙醇后得到的物質(zhì)通過(guò)超聲波處理、離心分離、過(guò)濾、真空干燥處理進(jìn)行精制后，得到神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
11.豆渣的發(fā)酵提取物用于促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生的非治療目的的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物得到的。
12.豆渣的發(fā)酵提取物作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的非治療目的的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物得到的。
13.豆渣的發(fā)酵提取物在制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑中的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物得到的。
14.如權(quán)利要求11 13的任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酸居芽孢桿菌(Bacillus acidicola)、吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)或地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠利用容易獲得的物質(zhì)作為培養(yǎng)基并利用特定的微生物，來(lái)廉價(jià)而高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
文檔編號(hào)C12P1/04GK102586330SQ201110023670
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者孔凡旗 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社