專利名稱：美洲斑潛蠅的特異性快速pcr檢測方法及所用的ss-coi引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種美洲斑潛蠅的特異性快速PCR檢測方法及所用的SS-COI引物和 試劑盒，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard，屬雙翅目、潛蠅科、斑潛蠅屬，是一種 世界性檢疫害蟲，我國農(nóng)業(yè)部于1994年將其列為進(jìn)境地植物檢疫潛在性害蟲，并制定了美 洲斑潛蠅“九五”監(jiān)測治理規(guī)劃。美洲斑潛蠅寄主非常廣泛，目前已知的寄主植物有36科 100多種，嚴(yán)重受害的植物包括茄科、豆科、葫蘆科、十字花科、菊科等，如葫蘆科的黃瓜、甜 瓜、西葫蘆、西瓜、冬瓜、絲瓜、南瓜等；茄科的茄子、番茄、辣椒、馬鈴薯、煙草、龍葵等；十字 花科的白菜、蘿卜、芥菜、青菜、花椰菜、甘藍(lán)等；豆科的黃豆、菜豆、蠶豆、豌豆、木豆、羽扇豆 等；菊科的芍藥、秋菊、萬壽菊等；錦葵科的棉花，大戟科的蓖麻等。美洲斑潛蠅成蟲和幼蟲 均可造成危害。雌成蟲常以產(chǎn)卵器刺入表面葉肉，形成扇形或筒形刺傷點，取食汁液后產(chǎn)卵 或丟棄而形成小型失水枯斑。低齡幼蟲潛入葉片、葉柄中取食為害，在葉的上表皮多蛀成彎 彎曲曲的白色蟲道，通常每片葉中可有幾頭甚至十幾頭幼蟲為害，隨著幼蟲齡期的增大，蟲 道逐漸加長增粗，被害葉片因失綠而成白色。受害葉片葉綠素被破壞，影響光合作用。受害 嚴(yán)重時葉片脫落，造成花芽、果實被灼傷，嚴(yán)重的造成毀苗。如一棚盛瓜期的西葫蘆可在發(fā) 現(xiàn)蟲害后的14 15天內(nèi)被毀滅；長徑20cm以上的瓜葉，可在一周左右被吃盡葉肉，僅留上 下表皮，之后，幼蟲還可鉆入葉柄甚至莖桿等部位為害，使幼苗折斷，植株枯萎。觀賞植物的 葉片被害后出現(xiàn)難看的蟲道和取食后枯斑，降低其觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。幼苗被害會延遲 生長，導(dǎo)致作物減產(chǎn)。此外，美洲斑潛蠅還可傳播植物病害。由于該蟲寄主范圍廣、繁殖能 力強(qiáng)、發(fā)育周期短、世代重疊、幼蟲潛葉為害，是危害茄果類、瓜類、豆類及葉菜類蔬菜、觀賞 植物、飼料作物等的一種毀滅性害蟲。例如，在美國佛羅里達(dá)洲，由于美洲斑潛蠅的嚴(yán)重為 害，曾使番茄的產(chǎn)量顯著減產(chǎn)；在加州，僅菊花業(yè)1981 1985年的損失就有9300萬美元。 在我國南京由于該蟲為害致使作物減產(chǎn)30 50%，嚴(yán)重地塊毀耕毀種，損失慘重；每年我 國因美洲斑潛蠅危害所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)25億元，給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和“菜籃子工 程”建設(shè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。美洲斑潛蠅原產(chǎn)于巴西，20世紀(jì)40年代以來陸續(xù)爆發(fā)于美國佛羅里達(dá)、夏威夷等 地，70年代后又發(fā)現(xiàn)于大洋洲的一些島嶼和阿拉伯半島南部地區(qū)。多年來該蟲隨寄主植物 及其它介質(zhì)在世界范圍內(nèi)傳播蔓延，現(xiàn)已在30多個國家和地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，許多國家將該蟲 列為一類危險的檢疫性害蟲。我國于1993年12月在海南省三亞市首次發(fā)現(xiàn)美洲斑潛蠅的 發(fā)生與為害；1994年便在華南、華中地區(qū)普遍發(fā)生，1997年已蔓延至全國25個省/直轄市 /自治區(qū)，到2000年已查明觀個省/直轄市/自治區(qū)有不同程度的發(fā)生。目前我國除西 藏地區(qū)尚未確定有美洲斑潛蠅發(fā)生外，其它省(自治區(qū)、直轄市)均有不同程度的發(fā)生和危 害，對我國的出口貿(mào)易造成了嚴(yán)重威脅，因此加強(qiáng)對美洲斑潛蠅的檢疫和監(jiān)測，是維護(hù)我國對外貿(mào)易信譽(yù)，保障人民健康生活的必要前提。美洲斑潛蠅成蟲為小型蠅類，體長為1. 3 2. 3mm ；卵長0. 2 0. 3mm,淡黃白色， 半透明，肉眼無法發(fā)現(xiàn)。成蟲將卵產(chǎn)在寄主植物組織中，幼蟲潛入葉內(nèi)在葉片柵欄組織取食 為害，老熟后爬出蟲道彈落地面在表土層化蛹。而加強(qiáng)檢疫和監(jiān)測必需建立一套快速準(zhǔn)確 的分子檢測方法。目前國際上用于美洲斑潛蠅鑒定的方法主要有1)形態(tài)特征鑒定；2)同 工異構(gòu)酶電泳法；3)PCR技術(shù)等。但目前國內(nèi)針對美洲斑潛蠅尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。RAPD技術(shù)、COI技術(shù)和RFLP技術(shù)曾用于鑒別美洲斑潛蠅及其近緣種。RAPD技術(shù)檢 測是以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，在DNA聚合酶的 催化下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫 外透視儀上根據(jù)多態(tài)性來判斷檢測結(jié)果。RFLP技術(shù)是根據(jù)不同種類基因組的限制性內(nèi)切酶 的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā) 生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同品種(個體)的DNA 水平的差異(即多態(tài)性)，多個探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。檢測是以基因 組DNA為模板，以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，在DNA聚合酶的催化下，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上 根據(jù)多態(tài)性來判斷檢測結(jié)果。mtDNA COI技術(shù)檢測是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催 化下，對目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物回收、純化、測序，根據(jù)序列比對和系統(tǒng)發(fā) 育樹構(gòu)建來判斷檢測結(jié)果。SS-C0IPCR技術(shù)檢測是在mtDNA COI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果， 無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種美洲斑潛蠅的特異性快速PCR檢測方法 及所用的SS-COI引物和試劑盒，本發(fā)明方法檢測準(zhǔn)確性和靈敏度高，操作簡便快捷，特異 性強(qiáng)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種用于檢測美洲斑潛蠅的特異性SS-COI引物對，其 上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明還提供一種美洲斑潛蠅的特異性快速PCR檢測方法，該方法是提取待測 潛葉蠅的總DNA作為模板，用權(quán)利要求1所述的特異性SS-COI引物對作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，若出現(xiàn)的DNA擴(kuò)增條帶，則待測潛葉蠅為美洲斑潛 蠅。一種美洲斑潛蠅特異性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。同時，本發(fā)明還提供一種檢測美洲斑潛蠅的試劑盒，其包含所述的特異性SS-COI 引物對。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明根據(jù)美洲斑潛蠅的線粒體DNA序列，設(shè)計一對種特異性引物，特異性強(qiáng)，該 引物只對美洲斑潛蠅具有擴(kuò)增能力，可特異性檢測美洲斑潛蠅，在其近緣種、屬潛葉蠅中無 擴(kuò)增產(chǎn)物。用本發(fā)明方法和所述引物檢測美洲斑潛蠅時，檢測準(zhǔn)確性高，可擴(kuò)增出^Mbp的 片段，不僅對美洲斑潛蠅的單頭成蟲、預(yù)蛹、蛹和2齡幼蟲可以進(jìn)行檢測，對于單粒卵和單頭初孵幼蟲也能準(zhǔn)確檢測。同時，本方法采用SS-COI PCR技術(shù)，是對美洲斑潛蠅RAPD技 術(shù)、RFLP技術(shù)和mtDNA COI技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)，操作過程簡單、快速、高效，一般整 個過程可在5個小時內(nèi)完成，提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測時間。本發(fā)明方法 和引物在美洲斑潛蠅檢測/監(jiān)測方面具有很高的應(yīng)用價值，實用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及 害蟲監(jiān)測/檢測的需要，可以試劑盒的形式在我國口岸、有機(jī)蔬菜生產(chǎn)基地、鮮切花生產(chǎn)基 地，以及蔬菜、觀賞植物種苗/植株等調(diào)運(yùn)中推廣。


圖1為引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅及其近緣種、屬潛葉蠅的SS-COI PCR擴(kuò) 增結(jié)果，其中，M 分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000 ；1 美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard ；2 南 美斑潛蠅；3 豌豆斑潛蠅；4 三葉草斑潛蠅；5 蔥斑潛蠅；6 水(陰性對照)。圖2為引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅不同蟲態(tài)和性別的SS-COI PCR擴(kuò)增結(jié) 果，其中，M 分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000 ；1 雌性成蟲；2 雄性成蟲；3 蛹；4 一齡幼蟲；5 二齡幼 蟲；6 三齡幼蟲；7 單粒卵；8 水(陰性對照)。圖3為引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅最低檢出量的測定，其中，M 分子量標(biāo) 準(zhǔn) DGL2000 ；1-12 分別為 1 :1/15 ；2 :1/30 ；3 :1/60 ；4 :1/20 ；5 1/240 ；6 1/480 ；7 1/960 ； 8 :1/1920 ；9 :1/3840 ；10 :1/7680 ；11 :1/15360 ；12 :1/30720 頭雌性成蟲。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限 制，僅僅作示例說明。實施例1 檢測引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅的擴(kuò)增效果(1)潛葉蠅模板DNA的制備將單頭潛葉蠅置于滴有20 μ L提取緩沖液(50mM Tris-HClUmM EDTAU % SDS, 20mMNaCl,pH 8. 0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液 以微量移液器移入1. 5mL離心管；然后以200 μ L緩沖液分4次清洗勻漿器，移入同一離心 管，混勻，加入8 μ L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60°C水浴1. 5h (中途混勻1次)；然 后沸水浴8min，加入220 μ L氯仿/異戊醇(V V = 24 1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后， 冰上放置30min ；4°CU2000r/min離心20min，取上清液，加入440 μ L預(yù)冷的無水乙醇，輕 輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于_20°C放置30min ；4°C、12000r/min離心15min，小心棄 去上清液。加入500 μ L預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4°C、12000r/min離心15min，小心棄去上清 液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管加入30 μ L超純水，充分溶解 后于-30°C保存?zhèn)溆谩?2)合成檢驗美洲斑潛蠅的SS-COI特異性引物引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，即Primer LSZYCE 5' -TCGAGCAGAATTAGGACAT-3‘Primer LSZYCF 5' -ATTGAAGAAAGTGGAGGGT-3‘由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)
1)反應(yīng)體系反應(yīng)體系為20μ L，其中 10XPCR buffer 2. 0 μ L、dNTP (IOmM) 0. 4 μ L、Taq 聚合 酶(5υ/μ L)0. 2μ L、上游引物和下游引物(20ng/ μ L)各2. 0 μ L、模板DNA 2. 0μ L、超純水 11. 4μ L。2) PCR擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性 3min ；40 個循環(huán)94°C 60sec、54°C 60sec、72°C 60sec ；最后 72°C延伸 5min。G) PCR產(chǎn)物的鑒定取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色 后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。(5)實施結(jié)果利用引物primer LSZYCE/LSZYCF以美洲斑潛蠅總DNA為模板，以南美斑潛蠅、三 葉草斑潛蠅以及豌豆?jié)撊~蠅、蔥斑潛蠅等4種其他常見種類的潛葉蠅為對照進(jìn)行SS-COI PCR擴(kuò)增。在1泳道的美洲斑潛蠅中擴(kuò)增出了 ^Mbp的目的條帶(見附圖1的1泳道)，在 其他4種近緣種、屬的潛葉蠅中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明本發(fā)明所設(shè)計的來自美洲斑潛蠅線粒 體DNA的特異性SS-COI PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。擴(kuò)增出的^Mbp片段的核苷酸序列如 SEQ ID No. 3 所示。實施例2 檢測引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅不同蟲態(tài)和性別的擴(kuò)增效果(1)美洲斑潛蠅模板DNA的制備將不同蟲態(tài)和性別的單頭/單粒美洲斑潛蠅置于滴有20 μ L提取緩沖液 (50mMTris-HClUmM EDTAU % SDS、20mMNaCl，pH 8.0)的 parafilm 膜上，制備方法與實施 例1相同。(2)合成檢驗美洲斑潛蠅的特異性引物，引物核苷酸序列與實施例1相同。(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序同實施例1。(4)鑒定PCR產(chǎn)物，鑒定方法同實施例1。(5)實施結(jié)果利用引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF以不同蟲態(tài)和性別的美洲斑潛蠅總DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。美洲斑潛蠅的雌性成蟲和雄性成蟲均擴(kuò)增出了 的目的條帶(見附圖2的1、2泳 道)；同時美洲斑潛蠅的蛹、單頭初孵幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲和單粒卵也擴(kuò)增出了 294bp 的目的條帶(見附圖2的3、4、5、6、7泳道)，說明本發(fā)明所設(shè)計的美洲斑潛蠅的種特異性 SS-COI PCR擴(kuò)增弓I物的準(zhǔn)確性高。實施例3 引物L(fēng)SZYCE/LSZYCF對美洲斑潛蠅最低檢出量的測定(1)美洲斑潛蠅模板DNA的制備將單頭美洲斑潛蠅雌性成蟲置于滴有20 μ L提取緩沖液(50mM Tris-HCl、 ImMEDTAU % SDS、20mM NaCl, pH 8.0)的paraf ilm膜上，制備方法與實施例1相同。然后 原模板溶液以2倍進(jìn)行遞減梯度稀釋至1/30720頭，取2 μ L作為PCR擴(kuò)增的模板，直接加 到PCR反應(yīng)體系中。(2)合成檢驗美洲斑潛蠅的特異性引物，引物核苷酸序列與實施例1相同。(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序同實施例1。
(4)鑒定PCR產(chǎn)物，鑒定方法同實施例1。(5)實施結(jié)果利用引物primer LSZYCE/LSZYCF做最低檢出量的測定，以不同稀釋倍數(shù)的美洲斑 潛蠅總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能檢測到的最低模板DNA濃度為1/3840頭雌性成蟲(見 附圖3)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測美洲斑潛蠅的特異性SS-COI引物對，其上游引物核苷酸序列如SEQID No. 1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一種美洲斑潛蠅特異性基因片段，其特征在于所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
3.一種美洲斑潛蠅的特異性快速PCR檢測方法，其特征在于提取待測潛葉蠅的總DNA 作為模板，用權(quán)利要求1所述的特異性SS-COI引物對作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，若出現(xiàn)294bp的DNA擴(kuò)增條帶，則待測潛葉蠅為美洲斑潛蠅。
4.一種檢測美洲斑潛蠅的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的特 異性SS-COI引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種美洲斑潛蠅的特異性快速PCR檢測方法及所用的SS-COI引物和試劑盒，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。該方法根據(jù)美洲斑潛蠅特有的線粒體DNA序列，設(shè)計一對特異性引物，該引物對只對美洲斑潛蠅具有擴(kuò)增能力，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為294bp，其檢測靈敏度達(dá)到了1/3840頭雌性成蟲。是對美洲斑潛蠅RAPD技術(shù)、RFLP技術(shù)和mtCOI技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時，本方法采用SS-COI PCR技術(shù)，提高了檢測的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，可以試劑盒的形式在我國口岸、有機(jī)蔬菜生產(chǎn)基地、鮮切花生產(chǎn)基地，以及蔬菜、觀賞植物種苗/植株調(diào)運(yùn)中推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102146449SQ20111002484
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者萬方浩, 劉萬學(xué), 張桂芬, 張金良, 郭建英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所