專利名稱：一種腸道病毒71衣殼蛋白1抗原、制備方法及免疫檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸道病毒71(EV71)衣殼蛋白I(VPl)基因改造及重組抗原，還涉及用于檢測EV71抗體的檢測試劑。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染在臨床上主要引起患者手足口病 (hand, foot and mouth disease，HFMD)。主要感染對象為5歲以下的幼兒。2歲以下兒童的血清抗EV71抗體水平陽性率僅為0. 8%，到5 6歲時血清抗體水平上升并達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)，約為50%;5 6歲以上人群的抗體水平則隨著年齡的增加再次逐漸下降。[Ooi E E, Phoon M C, Ishak B, et al. Seroepidemiology of human enterovirus 71. Emerg Infect Dis. 2002 ；8 :995-997.]。成年人亦可感染，并在同一家庭成員內(nèi)部傳播，但臨床癥狀不明顯。這種亞臨床感染或隱性感染也是EV71快速傳播的又一個重要途徑。EV71病毒為小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組中僅有一個開放閱讀框，編碼含2194個氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、 P3三個前體蛋白，其中Pl蛋白降解成VP1、VP2、VP3、VP4四個病毒衣殼蛋白；P2和P3前體蛋白裂解為2A、2B、2C、3A、VPg、3C、3D共7個非結(jié)構(gòu)蛋白。組成EV71病毒粒子基本單位為4 種衣殼蛋白(VPl VP4)，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外，其它3種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本上位于VPl VP3上。EV71 的基因型主要根據(jù)病毒衣殼蛋白VPl核苷酸序列的差異，目前，EV71可分為A、B、C三個基因型，其中，我國主要為 C 型[Xu JjQian Y, Wang S，et al. EV71 :an emerging infectious diseasevaccine target in the Far East ？ . Vaccine. 2010 ；28 (20) :3516-21.]EV71病毒引發(fā)的手足口病近年呈上升趨勢。由于EV71預(yù)后差，其早期癥狀與柯薩奇、皰疹病毒、埃可病毒引發(fā)的臨床癥狀極為相似，因此，EV71的早期診斷對后期疾病的防治工作意義重大。傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)和中和試驗繁瑣、靈敏度低，檢測周期通常需要 5-10天，嚴(yán)重影響EV71患者的早期臨床治療和隔離工作[Wang SY, Lin TL, Early and rapid detection of enterovirus 71infection by an IgM—capture ELISA. J Virol Methods. 2004 ； 119(1) :37-4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前，可以直接通過對患者標(biāo)本中EV71-RNA的檢測開展EV71的早期診斷工作。但通常EV71-RT-PCR檢測需要特殊的儀器，對人員素質(zhì)要求較高，很難在國內(nèi)基層醫(yī)院開展，最為重要的是EV71存在隱性感染，僅樣本中EV71-RNA陽性并不能判斷疾病的急性發(fā)病，因此，開展簡單快速的EV71-IgM酶聯(lián)檢測試劑在EV71早期臨床檢測中具有重要意義[Chang LY, Tsao KC, Hsia SH, et al. Transmission andclinical features of enterovirus 71 infections in household contacts in Taiwan. JAMA. 2004 Jan 14 ；291 (2) :222-7.]。Tsao以抗μ鏈單抗包被酶聯(lián)板，建立IgM捕獲法EV71-ELISA檢測技術(shù)，以病毒培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，該檢測技術(shù)的靈敏度和特異性分別為91. 5和93. 1%，在發(fā)病的第二天就可以檢測出 EV71_IgM 的出現(xiàn)[Tsao KC, Chan EC, Chang LY, et al. Responses of IgM for enterovirus 71 infection. J Med Virol. 2002 ；68 (4) :574-80] ；Xu 對商品化 EV71_IgM ELISA檢測試劑進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)在發(fā)病當(dāng)天，就有90%的患者中能檢測出IgM抗體，這種狀況一直維持4天，隨后敏感度上升到95%至100%，并一直保持一個月以上。在中和測試低于1 100的健康人群和健康兒童中其特異性分別為99. 9%和99.2% ；在非手足口兒童患者中，交叉率為 11. 4% [Xu F, Yan Q，Wang H, et al. Performance ofdetecting IgM antibodies against enterovirus 71 for early diagnosis. PLoS One. 2010 ；5 (6) ell388]，由此可見采用IgM捕獲法EV71-ELISA檢測技術(shù)在臨床EV71早期檢測中是可行的。但遺憾的是，上述IgM-ELISA檢測技術(shù)均采用的是滅活的EV71病毒顆粒作為檢測抗原，生產(chǎn)及操作的安全性遠(yuǎn)比重組抗原差，Siih等曾用EV71的VPl基因的原核表達(dá)產(chǎn)物作為抗原診斷EV71的感染，結(jié)果表明，原核表達(dá)的VPl蛋白作為檢測抗原，既可檢測急性感染期患兒血清中的IgM，也可檢測曾感染EV71患者血清中的IgG，而且與CA16抗血清無交叉免疫反應(yīng)。初步證實重組蛋白VPl抗原在制備EV71-ELISA診斷試劑的重要地位 [Shin-Ru Shih,et al Expression of Caspid Protein VP Ifor Use as Antigen forthe Diagnosis of EV71 Infection. J Med Virol, 200061 :228-234]。除此以外，用原核表達(dá)的 VPl蛋白作為基因工程亞單位疫苗對實驗?zāi)甘筮M(jìn)行免疫接種，結(jié)果表明，VPl蛋白疫苗對新生小鼠有免疫保護(hù)效果，在疫苗研究中也具有同等重要地位。但由于VPl抗原基因中含有大量的大腸桿菌稀有密碼子，基因表達(dá)量較低，無法大量制備，限制了其在EV71-IgM ELISA 檢測試劑及疫苗中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了滿足EV71-VP1抗原在檢測試劑及疫苗生產(chǎn)中的需求，本發(fā)明采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子對EV71-VP1基因進(jìn)行改造，并采用退火延伸PCR技術(shù)獲得改造后的VPl基因， 采用基因重組技術(shù)對上述VPl基因進(jìn)行克隆表達(dá)，獲得高表達(dá)的VPl抗原，以此重組抗原為基礎(chǔ)建立IgM捕獲法EV71-ELISA檢測試劑，并評價其EV71-VP1抗原的免疫學(xué)活性。本發(fā)明的目的是提供有大腸桿菌優(yōu)勢密碼子組成的EV71-VP1基因。本發(fā)明公開的EV71-VP1基因，其基因序列如序列表中序列1所示(1)序列表中序列1，本發(fā)明還公開了上述EV71-VP1基因的拼接改造及克隆表達(dá)技術(shù)及其在制備 EV71-IgM抗體檢測試劑中的用途。本發(fā)明提供了一種基于重組VPl抗原建立的鑒定 EV71-IgM的臨床檢測技術(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點1.發(fā)明是建立在改造的EV71-VP1基因的基礎(chǔ)上EV71-VP1含有重要的中和性抗原表位，在EV71診斷與疫苗研發(fā)中處于重要地位， 但由于其基因含有大量的大腸桿菌稀有密碼子，表達(dá)量低。本發(fā)明根據(jù)VPl氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子，反向翻譯成基因序列，并采用退火延伸PCR技術(shù)進(jìn)行基因拼接，獲得891個核苷酸組成的改造后VPl基因，并以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行EV71-VP1抗原的高效表達(dá)。CN 102242132 A
說明書
3/6頁2.發(fā)明是建立EV71-VP1重組抗原的基礎(chǔ)上目前EV71_IgM檢測試劑中采用的診斷用抗原均是來自滅活的EV71病毒顆粒，生產(chǎn)和檢測中安全性差。本發(fā)明是建立高效表達(dá)的EV71-VP1重組抗原的基礎(chǔ)上，可有效的避開生產(chǎn)和檢測過程中與EV71病毒的接觸，降低了整個實驗的危險性。3.本發(fā)明是在IgM捕獲法基礎(chǔ)上實現(xiàn)對EV71的臨床診斷。目前報道的重組VPl抗原由于受到表達(dá)量及后續(xù)抗原標(biāo)記過程的限制，均是采用 VPl抗原包被，抗IgM抗體標(biāo)記辣根酶顯色的間接ELISA檢測技術(shù)，本研究將利用抗μ鏈單抗包被酶聯(lián)板，以辣根酶標(biāo)記重組VPl抗原，建立IgM捕獲法EV71-ELISA檢測技術(shù)，與間接 ELISA技術(shù)相比，具有較高的特異性。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人根據(jù)我國主要EV71-VP1氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子反向翻譯成核苷酸序列，改造后的VPl基因序列如序列表中序列1所示。采用退火延伸PCR技術(shù)，獲得改造后的VPl基因，基因工程表達(dá)后，大量純化制備 VPl抗原，并進(jìn)行辣根酶標(biāo)記，制備酶標(biāo)二抗；采用IgM捕獲法實現(xiàn)對EV71-IgM的臨床檢測。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的利用生物信息學(xué)軟件，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子反向翻譯成核苷酸序列。為了便于基因拼接，本發(fā)明將VPl序列分成4段進(jìn)行退火延伸PCR，為了便于基因克隆到表達(dá)載體， 在連接臂的兩端引入BamHI和EcoRI兩個酶切位點，以適合表達(dá)載體pBET_28a。雙酶切后插入載體pBET-28a中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。測序法證明各基因片段已獲正確地插入。EV71-VP1抗原表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli BL21后，通過IPTG誘導(dǎo)，取全菌液進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定，證明該質(zhì)粒均已獲得了高效的表達(dá)，再經(jīng)鎳柱及凝膠過濾純化，可獲得電泳純的EV71-VP1抗原純品。采用碘化鈉法進(jìn)行辣根酶標(biāo)記，制備酶標(biāo)抗原復(fù)合物。采用IgM 捕獲法對EV71患者血清中IgM進(jìn)行檢測，并評價其檢測的靈敏度和特異性。實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所提供的四份手足口病患者中檢出M份陽性，檢出率為 82.8%, 50份健康人血清中檢出50份，特異性為100%，顯示出本發(fā)明獲得的VPl抗原具有 EV71特異性的免疫學(xué)活性，在診斷試劑和疫苗研究中具有一定的應(yīng)用價值。


附圖1EV71-VP1改造基因的克隆表達(dá)的SDS-PAGE
具體實施例方式1、EV71_VP1基因的改造和合成。我們通過生物信息學(xué)軟件，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子將EV71-VP1抗原的氨基酸序列反向翻譯成核苷酸序列，改造后的EV71-VP1基因序列如序列表中序列1所示；考慮到目前國內(nèi)基因引物合成效率，本發(fā)明將上述基因分為E、F、G、H共4段分別予以合成，四段基因片段末端具16個核苷酸的匹配序列。在進(jìn)一步拼接成完整EV71-VP1基因序列，每段合成的引物序列如序列表中的2-33所示，為了方便描述所述制備方法，為相應(yīng)基因序列命名，SEQ ID NO :2 至 5 分別命名為 EF4、EF3、EF2、EFl ；SEQ ID NO :6 至 9 分別命名為 ERl、 ER2、ER3、ER4 ； SEQ ID NO 10 M 13 分別命名為 FF4、FF3、FF2、FFl ； SEQ ID NO 14 M 17 分別命名為 FRl、FR2、FR3、FR4 ； SEQ ID NO 18 M 21 分別命名為 GF4、GF3、GF2、GFl ；SEQ ID NO 22 至 25 分別命名為 GR1、GR2、GR3、GR4 ；SEQ ID NO 26 至 29 分別命名為 HF4、HF3、HF2、 HFl ；SEQ ID NO 30至33分別命名為HR1、HR2、HR3、HR4 ；所述方法共分為3步第1步E、F、G、H基因片段的合成合成上述基因共需要4輪退火延伸PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司 2 XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水23μ 1、XF1及)(R1引物各1 μ 1，期中X代表Ε、F、G、H，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；后續(xù)第η輪PCR 反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水22 μ 1、XFn及Xfoi引物各1 μ 1，η_1 輪PCR產(chǎn)物1 μ 1，η代表2，3，4 ；反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)條件為94°C 3分鐘后，94°C 1分鐘， 550C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得E、F、G、H四段基因。第2步EF基因片段和GH片段的PCR退火延伸合成EF基因片段拼接的PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水 23μ 1、E基因及F基因各1μ 1，PCR反應(yīng)條件為94 °C 1分鐘后，94 °C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分，5個循環(huán)；第二輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水 22μ 1、引物EF4及引物FR4基因各1μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1 分鐘，720C 1分鐘，5個循環(huán)；30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得EF基因片段；GH基因片段的拼接方法同EF，相應(yīng)E換成G，F(xiàn)換成H，即可獲得GH基因片段。第3步EV71_VP1基因片段的獲得PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水23μ 1、EF基因及GH基因各1μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；第二輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2 XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水22μ 1、引物EF4及引物HR4 基因各1 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得整個基因片段。2、EV71_VP1改造基因的克隆、表達(dá)及標(biāo)記。1. EV71-VP1抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1. IPCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pBET_28a雙酶切取以上合成基因產(chǎn)物及pBET_28a表達(dá)載體各30 μ 1分別放于Eppendorf離心管中，各加入 10 X buffer (D) 4 μ 1、BamHI (lOu/ μ 1)和 EcoRI (12u/ μ 1)各 1 μ 1，加滅菌蒸餾水至40 μ 1，置37 °C水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVILl經(jīng)雙酶切后，用 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，具體方法按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行。 純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖，放于Eppendorf離心管中，各加入Sl液，置55°C水浴 10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55°C溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑盒說明書進(jìn)行純化。1. 2.連接于滅菌Eppendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因各 1 μ 1U0XT4 DNA Ligase buffer 1μ1、Τ4 DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加滅菌蒸溜水至 10μ 1，置 16°C 過夜。1. 3轉(zhuǎn)化在超凈工作臺中，用無菌吸頭取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物5 μ 1， 輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。立即轉(zhuǎn)移到42°C水浴中放置2分鐘，每管加入0.5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30°C水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0. 2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個菌落，分別接種于LB 中(5ml/管)，培養(yǎng)過夜，次日各取0. Iml轉(zhuǎn)移到LB中(^iil/管)，32°C培養(yǎng)3小時，ImMIPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)小時，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達(dá)菌株，并測序鑒定。2.抗原的表達(dá)與純化2. 1表達(dá)菌株的培養(yǎng)取_70°C保存的表達(dá)菌株20 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5 %的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)， 30°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時，當(dāng)0D600值達(dá)到0. 7時，加入ImM IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)小時，將菌液合并，6000rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。2. 2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C，1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用Imol/ L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8. OTE配制) 溶解，加β -巰基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清，EV71-VP1 克隆表達(dá)的情況參見附圖1。2. 3純化將上述溶解的包涵體溶液過鎳離子柱，用吸附緩沖液(pH8. 0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0. β -巰基乙醇，5mM咪唑，0. 25M NaCl)平衡清洗上樣后，用洗脫緩沖液(pH8. 0, 20mmol/L TE含6mol/L脲，0. 1 % β -巰基乙醇，200mM咪唑)洗脫，收集第一洗脫峰。再過Sephardex G-50凝膠過濾柱，緩沖液采用ρΗ8· 0，20mmol/L TE含0· 1 % SDS,收集第一洗脫峰。洗脫抗原采用SDS-PAGE進(jìn)行純化鑒定。3.辣根酶(HRP)標(biāo)記EV71-VP1抗原取HRP 5mg溶于0. 2mol/L PH 5. 6醋酸鹽緩沖液0. 5ml ；加入新鮮配制的0. Imol/ L NaI04 0. 25ml ；混勻。(此時溶液顏色應(yīng)由黃棕色變?yōu)槟G色)4°C 30分鐘；加入2. 5% 己二醇0.5ml，混勻。室溫置30分鐘。(此時溶液應(yīng)恢復(fù)為黃色)；加入待標(biāo)記抗體5 10mg，用 1. Omol/L PH 9. 5CBS 調(diào) PH 至 9. 0，混勻。4°C過夜；加入 NaHB4 0. Iml (0. 5mg)，混勻。4°C 2小時后對O.Olmol/L PH 7. 4PBS透析，4°C過夜。加入適量中性甘油后小量分裝。3、基于重組VPl抗原EV71_IgM抗體檢測(捕獲法)技術(shù)的建立及其應(yīng)用。1.基于重組VPl抗原建立EV71_IgM抗體檢測(捕獲法)技術(shù)抗IgM-μ鏈單抗包被酶聯(lián)板(PBS稀釋到2μβ/π 1)，每孔100μ1，4 過夜后棄液，蒸餾水沖洗3次，拍干，每孔加入BSA 100 μ 1，室溫2小時，棄液。每孔加入100 μ 1 樣品稀液后，分別加入10 μ 1的待測樣本血清，37°C 30分鐘，棄液，用洗滌液洗板5次后棄液，拍干，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的EV71-VP1抗原(1 1000) 100μ 1，37°C溫浴20分鐘， 棄液洗板5次拍干。加TMB顯色液A和B液各50 μ 1，37°C避光顯色10分鐘，每孔加入終止液50 μ 1，用酶標(biāo)儀讀取450nm吸光值0D。OD > 0. 1判斷為陽性。2. EV71-IgM抗體檢測(捕獲法)技術(shù)的臨床檢測共采用四份手足口病患者血清進(jìn)行檢測，VPl-IgM抗體陽性M例，檢出率為 82.8%, 50份健康人血清中檢出50份，特異性為100%，顯示出本發(fā)明獲得的VPl抗原具有EV71免疫學(xué)活性，在診斷試劑和疫苗研究中具有一定的應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種由大腸桿菌優(yōu)勢密碼子組成的腸道病毒71 (EV71)衣殼蛋白I(VPl)抗原，其核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。
2.制備如權(quán)利要求1所述抗原的方法，其特征在于，通過如下步驟獲得基因表達(dá)為相應(yīng)基因序列命名，SEQ ID NO :2至5分別命名為EF4、EF3、EF2、EFl ；SEQ ID NO 6 至 9 分別命名為 ERl、ER2、ER3、ER4 ； SEQ ID NO 10 M 13 分別命名為 FF4、FF3、FF2、FFl ； SEQ ID NO 14 M 17 分別命名為 FR1、FR2、FR3、FR4 ； SEQ ID NO 18 M 21 分別命名為 GF4、 GF3、GF2、GF1 ；SEQ ID NO 22 至 25 分別命名為 GR1、GR2、GR3、GR4 ；SEQ ID NO 26 至四分別命名為 HF4、HF3、HF2、HF1 ；SEQ ID NO 30 至 33 分別命名為 HR1、HR2、HR3、HR4 ；第1步合成E、F、G、H基因片段；合成E、F、G、H基因片段共需要4輪退火延伸PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水23 μ 1、XFl及XRl引物各1 μ 1，其中X代表Ε、F、G、H， PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；后續(xù)第η輪 PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水22 μ 1、XFn及Xfoi引物各1μ 1， η-1輪PCR產(chǎn)物1 μ 1，η代表2，3，4 ；反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)條件為94°C 3分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得E、F、G、H四段基因；第2步EF基因片段和GH片段的PCR退火延伸合成；EF基因片段拼接的PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2 XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水23 μ 1、E 基因及F基因各1 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；第二輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水22μ 1、引物EF4及引物FR4基因各1 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘， 720C 1分鐘，5個循環(huán)；30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得EF基因片段；GH基因片段的拼接方法同EF，相應(yīng)E換成G，F(xiàn)換成H，即可獲得GH基因片段；第3步獲得EV71-VP1基因片段；PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2 XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水23 μ 1、EF基因及GH基因各 1μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)；第二輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2 XPCR反應(yīng)液25μ 1、雙蒸水22μ 1、引物EF4及引物HR4基因各1 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個循環(huán)； 30個循環(huán)后再72°C延伸5分鐘，即獲得整個基因片段。
3.—種EV71抗體檢測試劑，其特征在于，使用如權(quán)利要求1所述的EV71-VP1抗原制備。
4.一種EV71重組疫苗，其特征在于，使用如權(quán)利要求1所述的EV71-VP1抗原制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子拼接的腸道病毒71(EV71)衣殼蛋白1(VP1)抗原基因序列。本發(fā)明直接由32條短的基因引物片段，通過退火延伸PCR技術(shù)，獲得改造后的VP1基因，無需EV71病毒模板；改造后的VP1基因具有較高表達(dá)量，可以通過純化獲得相應(yīng)的重組EV71-VP1抗原，較病毒裂解法具有較高的安全性。
文檔編號C12R1/19GK102242132SQ20111009767
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者修冰水, 宋曉國, 張賀秋, 王國華, 陳堃 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所