專利名稱：采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及到藥用蛋白酶的生化分離技術(shù)，尤其是涉及一種采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理和臨床上的功用主要有分解液化血凝塊、膿性分泌物、壞死組織等，能使膿液變稀，易于引流并能促進(jìn)傷口愈合。國內(nèi)提取胰蛋白酶的工藝長期以來一直采用多重結(jié)晶結(jié)合透析的工藝，多重結(jié)晶工藝復(fù)雜、純化能力弱，透析工藝耗時長、不便于規(guī)?；a(chǎn)，以這種傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品活性一般在2000-2500單位/毫克，最高只能達(dá)到2700單位/毫克左右。根據(jù)分析，胰蛋白酶工藝未獲得重大突破的原因有二 一是生產(chǎn)廠家的工藝慣性，工藝一旦穩(wěn)定不輕易變動；二是親和層析技術(shù)本身的技術(shù)難度使得開發(fā)以親和層析工藝來制備胰蛋白酶的技術(shù)不是那么容易。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工業(yè)化的高效手段采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(I)獲取生產(chǎn)用原料將新鮮的牛胰或豬胰進(jìn)行冷凍保存，得到冷凍原料；(2)原料粉碎、提取蛋白用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿狀，加入三倍體積預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，控制溫度為4°C攪拌提取3-5h，放置過夜，次日將提取液進(jìn)行固液分離，在清液中加入硫酸銨至30%飽和度，并加入硅藻土助濾，控制溫度為4°C放置過夜后過濾，得到的清液即為提取液；(3)分級鹽析、酶原沉淀在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，用I. 5倍重量的冰水溶解沉淀，加入O. 5倍重量的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至5，在25°C下保溫靜置48h，過濾收集濾液，再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解胰蛋白酶粗品用10倍體積的去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高純胰蛋白酶，控制溫度為4°C酶解48h，酶解后的溶液離心得到酶解液，根據(jù)中國藥典2010年版第二部的相應(yīng)方法測定酶解液中胰蛋白酶的效價，進(jìn)行質(zhì)量跟蹤；(5)親和層析分離純化將親和層析介質(zhì)裝柱，用O. IM Tris-Hcl,pH8. O緩沖液作為平衡液進(jìn)行平衡，平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD280值小于O. 1，然后用O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl, ρΗ2· 2緩沖液洗脫，流速為50cm/h,收集洗脫峰；(6)超濾濃縮除菌采用超濾膜對收集的洗脫峰進(jìn)行濃縮，將濃縮液通過O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品采用真空冷凍干燥技術(shù)，將過濾除菌后得到的酶液直接冷凍干燥，即得到高純度胰蛋白酶成品，成品取樣，參照中國藥典2010年版第二部的要求，進(jìn)行全項測定。步驟(2)中所述的固液分離采用的裝置為機(jī)電一體化箱式板框過濾設(shè)備，而非傳統(tǒng)的布袋壓濾。所述的硫酸銨為試劑級溶劑。步驟⑷中所述的酶解使用的胰蛋白酶為高純度的胰蛋白酶,活性> 3300u/mg。步驟(5)中所述的親和層析介質(zhì)以GE Health凝膠介質(zhì)為基礎(chǔ)，接上慈菇蛋白酶抑制劑作為配基而得，使用的層析緩沖液為O. IM Tris-Hcl，pH8. O緩沖液，使用的洗脫液為O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl,pH2. 2緩沖液,用這種創(chuàng)新的親和層析純化方法,可以一步純化胰蛋白酶，是生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的關(guān)鍵。所述的慈燕蛋白酶抑制劑的加入為10mg/ml凝膠介質(zhì)。步驟(6)中所述的超濾膜的截流分子量為10000。步驟(7)中所述的真空冷凍干燥中酶液的冷凍溫度為-40°C以下。本工藝的路線如下所示新鮮冷凍牛胰或豬胰一粉碎提取一板框過濾一分級鹽析一酶原沉淀一酶原酶解—親和層析一超濾濃縮一除菌過濾一冷凍干燥一成品與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立起一套生產(chǎn)規(guī)模的制備工藝，體現(xiàn)出了親和層析法生產(chǎn)胰蛋白酶的優(yōu)越性，有利于工藝的簡化和質(zhì)量的可控，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，以較高的收率得到純度很高的產(chǎn)品(> 3000單位/毫克)，大大提高了產(chǎn)品的市場競爭力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I取新鮮冷凍牛胰150公斤，用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎。加入450L預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，轉(zhuǎn)移到I噸攪拌容器中，在4度冷庫中攪拌提取3小時，放置過夜。次日用板框過濾設(shè)備過濾，分離后的殘渣裝袋后按照環(huán)保要求處理，得到的清液攪拌加入硫酸銨至30%飽和度，并加入少量硅藻土助濾，在4度冷庫中放置過夜后過濾得到提取液。在提取液中補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，在4度冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，離心得到沉淀7. 5公斤。用11. 25L冰水溶解沉淀，再加3. 75公斤的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至5. O。在25°C下保溫靜置48小時，過濾得到濾液，再加20公斤的飽和硫酸銨溶液，在4度冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得酶原粗品2. 5公斤。粗品用25L去離子水溶解，調(diào)節(jié)PH到8. O,再加入125mg胰蛋白酶(效價3400單位/毫克)，在4度冷庫中酶解48小時。離心得到酶解液。將IOL自制的親和層析介質(zhì)裝柱，用30L O. IM Tris-Hcl,
4PH8. O緩沖液進(jìn)行平衡；平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/小時；上樣完畢，用30L上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD28tl值小于O. I。換用O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl,pH2. 2緩沖液洗脫，流速為50cm/小時，收集洗脫峰20L。用截流量10000的超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，濃縮至4. 5L，將濃縮液通過O. 22 μ m的濾膜過濾除菌。除菌后的酶液裝凍干盤，采用真空冷凍干燥技術(shù)，將酶液直接冷凍干燥，得到成品。成品取樣，參照中國藥典2010年版第二部的要求，進(jìn)行全項測定，全項指標(biāo)完全符合中國藥典的要求，酶活力達(dá)到3350單位/毫克。實(shí)施例2取新鮮冷凍牛胰450公斤，用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿。加入1350L預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，轉(zhuǎn)移到2噸攪拌容器中，在4度冷庫中攪拌提取5小時，放置過夜。次日用板框過濾設(shè)備過濾，分離后的殘渣裝袋后按照環(huán)保要求處理，在清液中攪拌加入硫酸銨至30%飽和度，并加入少量硅藻土助濾，在4度冷庫中放置過夜后過濾得到提取液。在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，在4度冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，離心得到沉淀23公斤。用34. 5L冰水溶解沉淀,再加11. 5公斤的飽和硫酸銨溶液,調(diào)節(jié)pH至
5.O。在25°C下保溫靜置48小時，過濾得到濾液，再加60公斤的飽和硫酸銨溶液，在4度冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得酶原粗品7. 2公斤。粗品用72L去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH到8. O,再加入360mg胰蛋白酶(效價3400單位/毫克)，在4度冷庫中酶解48小時。離心得到酶解液。將25L自制的親和層析介質(zhì)裝柱，用75L
O.IM Tris-Hcl, pH8. O緩沖液進(jìn)行平衡；平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/小時；上樣完畢，用75L上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD28tl值小于O. I。換用O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl，pH2. 2緩沖液洗脫，流速為50cm/小時，收集洗脫峰50L。用截流量10000的超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，濃縮至8L，將濃縮液通過O. 22 μ m的濾膜過濾除菌。除菌后的酶液裝凍干盤，采用真空冷凍干燥技術(shù)，將酶液直接冷凍干燥，得到成品。成品取樣，參照中國藥典2010年版第二部的要求，進(jìn)行全項測定，全項指標(biāo)完全符合中國藥典的要求，酶活力達(dá)到3435單位/毫克。實(shí)施例3采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，包括以下步驟(I)生產(chǎn)用原料將新鮮的牛胰或豬胰進(jìn)行冷凍保存，得到冷凍原料；(2)原料粉碎、提取蛋白用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿狀，加入三倍體積預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，控制溫度為4°C攪拌提取3h，放置過夜，次日將提取液進(jìn)行固液分離，在清液中加入試劑級的硫酸銨至30%飽和度，并加入硅藻土助濾，控制溫度為4°C放置過夜后過濾，得到的清液即為提取液；(3)分級鹽析、酶原沉淀在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，用I. 5倍重量的冰水溶解沉淀，加入O. 5倍重量的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至5，在25°C下保溫靜置48h，過濾收集濾液，再補(bǔ)充硫酸銨至70 %飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解胰蛋白酶粗品用10倍體積的去離子水溶解，使用的胰蛋白酶為高純度的胰蛋白酶，活性> 3300u/mg，調(diào)節(jié)pH到8. O,在每升溶解液中加入5mg高純胰蛋白酶，控制溫度為4°C酶解48h，酶解后的溶液離心得到酶解液，根據(jù)中國藥典2010年版第二部的相應(yīng)方法測定酶解液中胰蛋白酶的效價，進(jìn)行質(zhì)量跟蹤；(5)親和層析分離純化將親和層析介質(zhì)裝柱,親和層析介質(zhì)以GE Health凝膠介質(zhì)為基礎(chǔ)，接上慈燕蛋白酶抑制劑作為配基而得，慈燕蛋白酶抑制劑的加入為10mg/ml凝膠介質(zhì)，用O. IM Tris-Hcl, pH8. O緩沖液作為平衡液進(jìn)行平衡，平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD28tl值小于O. 1，然后用
O.lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl，pH2. 2緩沖液洗脫，流速為50cm/h，收集洗脫峰；(6)超濾濃縮除菌采用超濾膜對收集的洗脫峰進(jìn)行濃縮，超濾膜的截流分子量為10000，將濃縮液通過O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品采用真空冷凍干燥技術(shù)，將過濾除菌后得到的酶液直接冷凍干燥，冷凍溫度為_40°C以下，即得到高純度胰蛋白酶成品，成品取樣，參照中國藥典2010年版第二部的要求，進(jìn)行全項測定。實(shí)施例4采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，包括以下步驟(I)生產(chǎn)用原料將新鮮的牛胰或豬胰進(jìn)行冷凍保存，得到冷凍原料；(2)原料粉碎、提取蛋白用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿狀，加入三倍體積預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，控制溫度為4°C攪拌提取5h，放置過夜，次日將提取液進(jìn)行固液分離，在清液中加入試劑級的硫酸銨至30%飽和度，并加入硅藻土助濾，控制溫度為4°C放置過夜后過濾，得到的清液即為提取液；(3)分級鹽析、酶原沉淀在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，用I. 5倍重量的冰水溶解沉淀，加入O. 5倍重量的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至5，在25°C下保溫靜置48h，過濾收集濾液，再補(bǔ)充硫酸銨至70 %飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解胰蛋白酶粗品用10倍體積的去離子水溶解,使用的胰蛋白酶為高純度的胰蛋白酶，活性> 3300u/mg，調(diào)節(jié)pH到8. O,在每升溶解液中加入5mg高純胰蛋白酶，控制溫度為4°C酶解48h，酶解后的溶液離心得到酶解液，根據(jù)中國藥典2010年版第二部的相應(yīng)方法測定酶解液中胰蛋白酶的效價，進(jìn)行質(zhì)量跟蹤；(5)親和層析分離純化將親和層析介質(zhì)裝柱,親和層析介質(zhì)以GE Health凝膠介質(zhì)為基礎(chǔ)，接上慈燕蛋白酶抑制劑作為配基而得，慈燕蛋白酶抑制劑的加入為10mg/ml凝膠介質(zhì)，用O. IM Tris-Hcl, pH8. O緩沖液作為平衡液進(jìn)行平衡，平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD28tl值小于O. 1，然后用
O.lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl，pH2. 2緩沖液洗脫，流速為50cm/h，收集洗脫峰；(6)超濾濃縮除菌采用超濾膜對收集的洗脫峰進(jìn)行濃縮，超濾膜的截流分子量為10000，將濃縮液通過O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品采用真空冷凍干燥技術(shù)，將過濾除菌后得到的酶液直接冷凍干燥，冷凍溫度為_40°C以下，即得到高純度胰蛋白酶成品，成品取樣，參照中國藥典2010年版第二部的要求，進(jìn)行全項測定。
權(quán)利要求
1.采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)獲取生產(chǎn)用原料將新鮮的牛胰或豬胰進(jìn)行冷凍保存，得到冷凍原料；(2)原料粉碎、提取蛋白用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿狀，加入三倍體積預(yù)冷的O. 25N硫酸溶液，控制溫度為4°C攪拌提取3-5h，放置過夜，次日將提取液進(jìn)行固液分離，在清液中加入硫酸銨至30%飽和度，并加入硅藻土助濾，控制溫度為4°C放置過夜后過濾，得到的清液即為提取液；(3)分級鹽析、酶原沉淀在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，用I. 5倍重量的冰水溶解沉淀，加入O. 5倍重量的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至5，在25°C下保溫靜置48h，過濾收集濾液，再補(bǔ)充硫酸銨至70%飽和度，控制溫度為4°C放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解胰蛋白酶粗品用10倍體積的去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高純胰蛋白酶，控制溫度為4°C酶解48h，酶解后的溶液離心得到酶解液；(5)親和層析分離純化將親和層析介質(zhì)裝柱，用O.IM Tris-Hcl，pH8. O緩沖液作為平衡液進(jìn)行平衡，平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD28tl值小于O. 1，然后用O. lmol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2. 2緩沖液洗脫，流速為50cm/h,收集洗脫峰；(6)超濾濃縮除菌采用超濾膜對收集的洗脫峰進(jìn)行濃縮，將濃縮液通過O.22 μ m的濾膜過濾除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品采用真空冷凍干燥技術(shù)，將過濾除菌后得到的酶液直接冷凍干燥，即得到高純度胰蛋白酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的固液分離采用的裝置為機(jī)電一體化箱式板框過濾設(shè)備。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的硫酸銨為試劑級硫酸銨。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的酶解使用的胰蛋白酶為高純度的胰蛋白酶,活性> 3300u/mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的親和層析介質(zhì)以GE Health凝膠介質(zhì)為基礎(chǔ)，接上慈菇蛋白酶抑制劑作為配基而得，使用的層析緩沖液為O. IM Tris-Hcl，pH8. O緩沖液，使用的洗脫液為O. Imol/L 甲酸-O. 05mol/L KCl，ρΗ2· 2 緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的慈燕蛋白酶抑制劑的加入為10mg/ml凝膠介質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步驟￠)中所述的超濾膜的截流分子量為10000。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(7)中所述的真空冷凍干燥中酶液的冷凍溫度為_40°C以下。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用親和層析法生產(chǎn)高純度胰蛋白酶的方法，包括生產(chǎn)用原料獲取，原料粉碎、提取蛋白，分級鹽析、酶原沉淀，粗品酶解，親和層析分離純化，超濾濃縮除菌，真空冷凍干燥得到成品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明體現(xiàn)出了親和層析法生產(chǎn)胰蛋白酶的優(yōu)越性，有利于工藝的簡化和質(zhì)量的可控，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，以較高的收率得到純度很高的產(chǎn)品(＞3000單位/毫克)，大大提高了產(chǎn)品的市場競爭力。
文檔編號C12N9/76GK102911926SQ20111022311
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者葉昀, 林克, 王洪森, 朱吉源 申請人:上海林葉生物科技有限公司