国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      梅毒螺旋體實時熒光定量pcr多靶檢測試劑盒及其制備的制作方法

      文檔序號:527893閱讀:280來源:國知局
      專利名稱:梅毒螺旋體實時熒光定量pcr多靶檢測試劑盒及其制備的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種試劑盒,尤其是涉及一種梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒及其制備方法。
      背景技術(shù)
      梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播疾病,其病原體是梅毒螺旋體,屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進入血液播散全身,使機體幾乎所有的組織及器官受累,臨床表現(xiàn)為全身性的,可分為不同臨床階段,包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言([1]WHO. GlcAal prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections :0verview and estimates[J]. Geneva :WH0, WHO/HIV/AIDS, 2001 :1-30.):“由于有高靈敏度檢測方法和高效的治療方案, 梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是,由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測方法和高效的治療方案,梅毒依然是嚴重危害人類健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問題。中國疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例,比2009年同期增長24. 50%。報告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位,居于性傳播疾病首位(中國疾控中心http://www.chinacdc.net.cn)。近年來,有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進的研究結(jié)果([2]BuchacZ,K.,Klausner, J. D., Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIV incidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, and Los Angeles,2004to 2005[J], Jaids-J Acq Imm Def,2008,47(2) :234-240. [3]Ghanem,K. G. ,Erbelding,E. J., Wiener, Z.S., et al. Serological response to syphilis treatment in HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitted diseases clinics[J]. SexTransm Infect, 2007,83 (2) :97-101.),使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無疑,人們對梅毒的防控過于樂觀,對梅毒的認識遠遠不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史,但治療失敗可見于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉,楊波,潘錫濤,等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2010,.20(10) =1491-1494)在對健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學調(diào)查中均發(fā)現(xiàn),這些人群存在一定比例的梅毒感染率,推測本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然,梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過去500 年任何國家和地區(qū)都未曾有過的速度在中國傳播,由于存在隱性感染以及無法統(tǒng)計的私人診所患者患病率,目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin,L.R. ,Fu, Ζ. G.,Dan,B.,Jing, et al. Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPN17 and TPN47[J].Diagn Micr Infec Dis,2010,68 (3) : 193—200· [6]Tucker JD,C. X., Peeling RW. Syphilis and social upheaval in china[J]. N Engl J Med,2010,362(18)1658-1661. [7] Chen,Ζ. Q.,Zhang,G. C.,Gong, X. D.,Lin, C.,Gao, χ.,Liang,G. J.,Chen, X. S.,and Cohen,M. S. Syphilis in china :Results of a national surveillance programme[J]. Lancet,2007, 369 :132-138. [8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of acolloidal gold-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specific IgM antibody in syphilis serofast reaction patients a serologic marker for the relapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease· 2011,70 :10-16)。實驗室檢查是診斷梅毒必不可少的方法,也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù),包括 暗視野顯微鏡檢查和血清學試驗。梅毒螺旋體感染早期,梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時,暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實驗室診斷方法,但敏感度較低,且易受肛門周圍非致病螺旋體的影響而產(chǎn)生假陽性。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養(yǎng),梅毒診斷與流行病學調(diào)查主要依賴于血清學試驗,包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測兩大類型。反應(yīng)素檢測對早期梅毒檢測靈敏度不高,而且生物假陽性率較高,是主要用于療效觀察的一項血清學指標([9]林麗蓉,但冰,付左根,等.潛在血源傳播患者梅毒血清學TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測.中國皮膚性病學雜志.2010,152 (05) :446-448)。梅毒特異性抗體檢測的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是,梅毒特異性抗體檢測仍然存在著靈敏度不足的缺陷,尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體,能證明梅毒螺旋體存在,那么這些棘手問題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官,少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎,因此,兔感染試驗被視為梅毒螺旋體檢測的最靈敏的方法。然而,兔感染試驗操作繁瑣,觀察時間要求3個月,甚至更長時間才能得到結(jié)果,臨床可操作性差。PCR擴增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴增模板,通過指數(shù)擴增實現(xiàn)了病原體的快速檢測,具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢。從理論上分析,通過優(yōu)化、改良PCR擴增技術(shù),其檢測的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗,而檢測時間僅僅需要2個小時([10]HAYP E,CLARKE J R,TAYLOR-ROBINSON D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patients with syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction[J]. Genitourin Med,1990,66(6) 428-32),有望成為解決這些棘手問題的最佳方法。.盡管國內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測試劑,但尚未有進入臨床應(yīng)用的有注冊文號PCR檢測試劑,而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴重的是,目前的PCR檢測試劑在研發(fā)過程中由于未經(jīng)嚴格的比對試驗,無一例外的存在靈敏度和特異性嚴重不足,其準確性不高,是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。多靶實時熒光定量PCR檢測技術(shù)([11]Erali M, Pounder JI, Woods GL. et al. Multi Plex single color PCR with ampIicon melting analysis for identification of Aspergillus speeies[J]· ClinChem,2006,52(7) :1443-1445)在同一反應(yīng)管中同時實現(xiàn)了對2個以上的靶基因的檢測,大大提高了檢測的靈敏度,同時避免了單基因突變造成的漏檢,很大程度上提高了梅毒檢測的準確性和靈敏度。將在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷,以及獻血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用,有著目前常用的血清學檢測不可比擬的優(yōu)勢,將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗證試驗,具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會、經(jīng)濟價值。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒及其制備方法。所述梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA 聚合酶(Tag酶)瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標準品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒;所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2 清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱;所述標準品瓶設(shè)有6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒瓶, 所述5個靶基因為poIA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個梅毒高特異性基因;所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽性質(zhì)控品瓶;所述6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒瓶、PCR反應(yīng)液瓶、含收集管的離心柱、陰性質(zhì)控品瓶、陽性質(zhì)控品瓶、Tag酶瓶、蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶和第2清洗緩沖液均布在外包裝盒內(nèi)。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品,陽性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA 的樣品。所述6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒的濃度可分別為1. 0 X 102copies/mL, 1. OX 103copies/mL、l. 0 X 104copies/mL、1· 0 X 105copies/mL、1· 0 X 106copies/mL 禾口 1. OX 107copies/mL,共 6 個濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs和5對引物探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有3' -5' DNA聚合酶活性、5' -3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶;所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期> 45min 的高溫聚合酶。所述梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法,包括以下步驟1)靶基因篩選,具體方法如下從基因庫(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體靶基因,包括polA基因、TPN47基因、tmpA 基因、TpF-I基因和bmp基因5個梅毒特異性基因,5對梅毒高特異性基因探針和引物的設(shè)計采用PCR引物探針設(shè)計軟件primer premier 5. 0,Oligo 6. 0、TM Utility vl. 3,Clustal X等設(shè)計軟件輔助完成,然后通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進行同源性比對以保證其特異性,合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM ΤΑ)溶解,使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定后,保存;2)多靶基因標準品質(zhì)粒的構(gòu)建,具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板,采用步驟1)中的5個靶基因的引物,進行PCR擴增,具體過程如下將擴增產(chǎn)物經(jīng)過回收及純化后,在微量離心管中配制DNA溶液,后加入5 μ L等量的Solution I,16°C反應(yīng)30min,與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中,冰中放置30min,42°C加熱4 后,再在冰中放置lmin, 加入LB培養(yǎng)基,37°C震蕩培養(yǎng)60min后,在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落,挑選白色菌落,進行增殖培養(yǎng),提取質(zhì)粒并對其進行PCR,Xab I和Ml I雙酶切及測序鑒定后,將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行單酶切線性化處理,再用紫外分光光度計定量并_20°C保存作為Real-time PCR的標準品;3)多靶基因檢測試劑標準曲線制作,其具體方法如下包含靶基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌,提取質(zhì)粒, 取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色,純度=A260A280,濃度= A260X 50 X 2 X 100 X 1(Γ6X 6. 02 X IO23/ (2806 X 324. 5X2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度,進行梯度稀釋,以每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應(yīng),確定線性范圍;4)制備PCR反應(yīng)液,其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs,5對引物探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液;5)制備耐熱DNA聚合酶,其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液IOOml經(jīng)5000r/min,4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液,4°C,5000r/min,離心5min,細菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中,加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_5mg/ml,37°C水浴 20min ;加入5ml緩沖液II,75°C水浴45min, 4°C, 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達30%,4°C,1500r/min離心lOmin,沉淀溶于Iml緩沖液III中,并對緩沖液III在4°C 條件下透析,每他換液1次共4次,離心除去不溶物后,-20°C凍存;6)建立樣品處理方法,其具體方法如下使用梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本,采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ;7)制備質(zhì)控品,其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認為陰性的臨床標本;制備陽性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認為陽性的臨床標本經(jīng)稀釋獲得陽性質(zhì)控品;8)制備梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,將DNA提取試劑、耐熱DNA 聚合酶(Tag酶)、PCR反應(yīng)液、標準品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒。在步驟1)中,所述5對梅毒高特異性基因探針和引物的序列如下所示;
      權(quán)利要求
      1.梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,其特征在于設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標準品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒;所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱;所述標準品瓶設(shè)有6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒瓶,所述 5個靶基因為polA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個梅毒高特異性基因;所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽性質(zhì)控品瓶;所述6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒瓶、PCR反應(yīng)液瓶、含收集管的離心柱、陰性質(zhì)控品瓶、陽性質(zhì)控品瓶、Tag酶瓶、蛋白酶 K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶和第2清洗緩沖液均布在外包裝盒內(nèi)。
      2.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,其特征在于所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品,陽性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。
      3.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,其特征在于所述6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒的濃度分別為1. OX 102copies/mL、l. OX 103copies/mL、 1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL 和 1.0X 107copies/mL,共 6 個濃度。
      4.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,其特征在于所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs和5對引物探針組成的混合物。
      5.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,其特征在于所述耐熱DNA聚合酶具有3' -5' DNA聚合酶活性、5' -3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶;所述耐熱DNA聚合酶是半衰期> 45min的高溫聚合酶。
      6.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法,其特征在于包括以下步驟1)靶基因篩選,具體方法如下從基因庫(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體靶基因,包括POlA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個梅毒特異性基因,5對梅毒高特異性基因探針和引物的設(shè)計采用 PCR 引物探針設(shè)計軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· 0、TM Utility vl. 3, Clustal X等設(shè)計軟件輔助完成,然后通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進行同源性比對以保證其特異性,合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM ΤΑ)溶解,使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定后,保存;2)多靶基因標準品質(zhì)粒的構(gòu)建,具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板,采用步驟1)中的5個靶基因的引物,進行PCR擴增,具體過程如下將擴增產(chǎn)物經(jīng)過回收及純化后,在微量離心管中配制DNA溶液,后加入5 μ L等量的Solution I,16°C反應(yīng)30min,與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中,冰中放置30min,42°C加熱4 后,再在冰中放置lmin,加入LB 培養(yǎng)基,37°C震蕩培養(yǎng)60min后,在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落,挑選白色菌落,進行增殖培養(yǎng),提取質(zhì)粒并對其進行PCR,Xab I和Ml I雙酶切及測序鑒定后,將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行單酶切線性化處理,再用紫外分光光度計定量并-20°C 保存作為Real-time PCR的標準品;3)多靶基因檢測試劑標準曲線制作,其具體方法如下包含靶基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌,提取質(zhì)粒,取 10μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm,280nm比色,純度=A260A280,濃度= A260X 50 X 2 X 100 X 1(Γ6X 6. 02 X IO23/ (2806 X 324. 5X2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度,進行梯度稀釋,以每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應(yīng),確定線性范圍;4)制備PCR反應(yīng)液,其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs,5對引物探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液;5)制備耐熱DNA聚合酶,其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代- β -D半乳糖苷進行誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液IOOml 經(jīng)5000r/min,4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液,4°C,5000r/min,離心5min,細菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中,加入溶菌酶使?jié)舛冗_5mg/ml,37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液 II,75 °C 水浴 45min,4°C,15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達 30% A°C, 1500r/ min離心lOmin,沉淀溶于Iml緩沖液III中,并對緩沖液III在4°C條件下透析,每Mi換液 1次共4次,離心除去不溶物后,-20°C凍存;6)建立樣品處理方法,其具體方法如下使用梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本,采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA;7)制備質(zhì)控品,其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認為陰性的臨床標本;制備陽性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認為陽性的臨床標本經(jīng)稀釋獲得陽性質(zhì)控品;8)制備梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒,將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標準品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒。
      7.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法,其特征在于在步驟1)中,所述5對梅毒高特異性基因探針和引物的序列如下所示;
      8.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法,其特征在于在步驟幻中,所述梯度稀釋選1. OX 102copies/mL、l. OX 103copies/mL、 1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL、1.0X 107copies/mL 6 個濃度作標準品。
      9.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法,其特征在于在步驟4)中,所述PCR緩沖液為pH= 5. 0 10. 0之間的穩(wěn)定緩沖對,所述pH最好為7. 0 9. 0 ;引物的濃度最好為25ρπι01/μ L,熒光探針的濃度最好為20ρπιΟ1/μ L,dNTPs 的濃度最好為2mmol/L ;鎂離子的濃度最好為15 20mmol/L。
      10.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒的制備方法, 其特征在于在步驟5)中,所述緩沖液I為50mmol/Ltris-HCl,50mmol/L Glucose, Immo 1/ LEDTA,pH8. 0 ;所述緩沖液 II 為 5mmol/L Tris2HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0. 5% Tween 20,0. 5% NP 40 ;所述緩沖液 III 為 50ml mol/LTris2HCl, lOmmol/LKCl, lmmol/L DTT,0. 5% PMSF,50%甘油;在步驟6)中,所述樣本可包括組織、全血、分泌物臨床標本;所述分泌物可包括皮膚、 生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物;在步驟8)中,Tag酶的用量可為8 10U/反應(yīng)。
      全文摘要
      梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒及其制備,涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標準品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒;所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱;所述標準品瓶設(shè)有6個含5個靶基因的標準品質(zhì)粒瓶;所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因,再構(gòu)建多靶基因標準品質(zhì)粒,制作多靶基因檢測試劑標準曲線后,先后制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶,建立樣品處理方法后,制備質(zhì)控品,最后完成梅毒螺旋體實時熒光定量PCR多靶檢測試劑盒。
      文檔編號C12R1/01GK102251052SQ20111023249
      公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
      發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 張長弓, 方贊熙, 楊天賜, 林麗蓉, 黃松潔 申請人:廈門大學附屬中山醫(yī)院
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1