專利名稱：白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌雜種的鑒定方法，具體涉及白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法。
背景技術(shù)：
白靈菇是白靈側(cè)耳的商品名稱，又名翅鮑菇、白靈芝菇、克什米爾神菇等，其分布與新疆阿魏(/^rWa sinkiangensin K. M. Shen)的分布密切相關(guān)，僅分布在我國(guó)新疆的阿爾泰、托里、木壘、塔城等地有新疆阿魏生長(zhǎng)的荒灘，分布海拔高度在720—1000m，其基因資源有限。杏鮑菇iPleurotus eiyngii (DC. :Fr.) Qu6l)發(fā)生于傘形花科刺芹屬，刺芹枯死的植株上，在我國(guó)新疆、青海、四川西部有自然分布，基因資源較白靈菇豐富。白靈菇和杏鮑菇不僅有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，口感風(fēng)味好，而且還有很高的藥用價(jià)值， 市場(chǎng)前景廣闊。但白靈菇的組織致密性、口感、朵形顏色優(yōu)于杏鮑菇，而風(fēng)味、生長(zhǎng)周期、生物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)管理?xiàng)l件劣于杏鮑菇，因此，可以應(yīng)用生物技術(shù)將兩者的基因融合在一起， 從而獲得具有白靈菇與杏鮑菇特性的雜交種，篩選出優(yōu)良的雜交種，增加市場(chǎng)上白靈菇的品種，促進(jìn)白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了快速篩選白靈菇與杏鮑菇的雜交種，有必要探索鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真?zhèn)巍?br>
發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，為有效鑒定白靈菇與杏鮑菇雜交種的真?zhèn)翁峁┍憬莸姆椒?，進(jìn)而在白靈菇與杏鮑菇的雜種中篩選出優(yōu)良的雜交種，從而縮短白靈菇的育種進(jìn)程。 。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；其特征在于
1、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生在8 12μ L ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份為 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；
2、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取Eco0109I酶的酶切產(chǎn)物15μ L，與3 μ L上樣緩沖液混勻， 點(diǎn)樣于1. 的瓊脂糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經(jīng)電泳檢測(cè)，在一個(gè)泳道上只有同時(shí)出現(xiàn)分子量為675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記；所述上樣緩沖液0. 溴酚藍(lán)，40%蔗糖。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
1、檢測(cè)時(shí)間短該檢測(cè)所需時(shí)間短，一般只需要10 15天，比通過(guò)出菇獲得子實(shí)體形態(tài)鑒定至少省40天以上。2、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好本發(fā)明以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，是區(qū)分物種的本質(zhì)表現(xiàn)所在，而DNA序列中的保守序列更是穩(wěn)定，是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的分子標(biāo)記， 不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開(kāi)發(fā)的鑒定技術(shù)準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好。3、專一性強(qiáng)本發(fā)明充分利用酶的專一性和高效性，且本發(fā)明使用的酶對(duì)白靈菇和杏鮑菇的雜種具有特異性，產(chǎn)生特異識(shí)別性的標(biāo)記片段，非此雜種得不到這種效果。4、容易判斷本發(fā)明的判斷依據(jù)是在瓊脂糖電泳上出現(xiàn)的特異DNA標(biāo)記條帶，DNA 標(biāo)記條帶少、清晰，一目了然。


圖1為Eco0109I酶的酶切電泳圖；其中，M 3為泳道編號(hào)；左側(cè)的數(shù)字和右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量。圖1中，1 3泳道分子量為678bp，440 bp和237 bp的DNA 標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟
1、白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合 選取優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的白靈菇菌株和杏鮑菇菌株作為雜交親本；
白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體制備用PDA斜面培養(yǎng)基活化白靈菇單孢菌株，轉(zhuǎn)接于含 IOOmL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養(yǎng)6 7d，用移液槍取5 7 mL培養(yǎng)液于含IOOmL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中，25°C靜置培養(yǎng)6 7d，挑取 0. 3 0. 6g幼嫩菌絲放入5mL離心管內(nèi)，5000r/min離心lOmin，倒棄離心出來(lái)的液體，在 5mL離心管內(nèi)加入300ul溶壁酶酶液，置觀 30°C水浴鍋中酶解2 2.證，用塞有棉花的注射器過(guò)濾酶解液，得到白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體；
杏鮑菇雙核菌株原生質(zhì)體制備用PDA斜面培養(yǎng)基活化杏鮑菇雙核菌株，余下步驟同白靈菇單孢菌株原生質(zhì)體制備；
將制備好的白靈菇單孢菌株的原生質(zhì)體倒入直徑為90mm的平皿在距紫外燈15cm處照射20min，把制備好的杏鮑菇雙核菌株的原生質(zhì)體于50°C水浴20min;把白靈菇單孢菌株和杏鮑菇雙核菌株的原生質(zhì)體以體積比為1 1的比例混合，再將混合液與融合劑以體積比為1 1的比例混合，30°C水浴15min，加入7-8倍體積的0. 6mol/L甘露醇稀釋，取其IOOul 涂布在再生培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)7-10d，挑起再生菌落由步驟2繼續(xù)培養(yǎng)；所述白靈菇菌株和杏鮑菇菌株均從市場(chǎng)上購(gòu)得；
2、菌絲培養(yǎng)和收集
(1)將步驟1獲得的再生菌株轉(zhuǎn)接含IOOmLPDA液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中；
(2)放置在25°C搖床上，轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10 d ；
(3)用紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；
(4)稱取0.5 1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。
3、CTAB法提取基因組DNA
(1)取步驟2(4)保存?zhèn)溆玫木z0. 5 1. 3g放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7mL的離心管；
(2)加2.5 mL 65°C預(yù)熱的抽提液，同時(shí)加入50 μ L巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀；
(3)65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩1次；
(4)加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)；
(5)8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7mL 管；
(6)加1/5體積65°C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻；
(7)10000r/min, 4°C離心 lOmin，取上清；
(8)加入2.5 mL 65°C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih ；
(9)12000r/min, 4°C離心IOmin后，去除上清液；
(10)用0.5mL TE溶液或無(wú)菌水溶解沉淀IOmin ；
(11)加入0.25mL飽和酚和0. 25mL氯仿異戊醇，混勻；
(12)12000r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積在4°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻；
(13)放置-20°C冰箱Ih或過(guò)夜；
(14)12000 r/min，4°C離心 10 min，棄上清；
(15)自然風(fēng)干沉淀，用30μ L TE溶液或無(wú)菌去離子水溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?、ITS-PCR 擴(kuò)增
ITS-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 μ L IOXPCR buffer, 2 μ L 濃度為 2. 5 m mol/L 的 dNTP, 1 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS1, ITSl 序列為 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，，1 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 ITS4, ITS4 序列為 5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',Ο. 3 μ L 酶活為 5 U/uL 的 iTaq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20。ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸1 min, 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。5、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生
10 μ L ITS-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer, 1 μ L Eco0109I 酶， 7μ L ddH20，37°C水浴 4h。6、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
取Eco0109I酶的酶切產(chǎn)物15 yL，與3 μ L上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.洲的瓊脂糖凝膠上，同時(shí)使用DL 2000的DNA MARK作為片段大小的參照，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/ cm電壓下電泳60—90 min，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。電泳圖如圖1所示，1 3泳道顯示的分子量為678bp，440 bp和237 bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種菌株的標(biāo)志。我們利用本發(fā)明的方法，在數(shù)百個(gè)參加鑒定的菌株中，鑒定出白靈菇與杏鮑菇雜交菌株132個(gè)，最后篩選得到3個(gè)優(yōu)良的白靈菇與杏鮑菇雜交菌株。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)
1、溶壁酶酶液0.6mol/L甘露醇，洲溶壁酶；
2、融合劑0.6mol/L 甘露醇，25% PEG, 1 OOnmo 1/L CaCl2 ；3、再生培養(yǎng)基20%馬鈴薯，2%葡萄糖，2%瓊脂，0.6mol/L甘露醇；
4、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl, pH 8. 0;
5、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
6、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
7、TE緩沖液10 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
8、0·5XTBE :44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA;
9、上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán)，40%蔗糖；
10、EB10 mg/mL 溴化乙錠；
IUPCR擴(kuò)增試劑及酶均購(gòu)自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下
Sff-CJ-IFB型單人水平垂直兩用凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；
滅菌鍋上海三申；
HYG-A全溫?fù)u瓶柜太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)室；
冷凍離心機(jī)Sigma 3K30 ；
PCR 擴(kuò)增儀Eppendorf AG22331 Hamburg ；
掌型離心機(jī)江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機(jī)；
SDC-6節(jié)能型智能恒溫槽寧波新芝生物科技股份有限公司；
凝膠成像系統(tǒng)TAN0N-2008。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1. 一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；其特征在于(1)特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生在8 12μ L ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份為 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；(2)酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取Eco0109I酶的酶切產(chǎn)物15μ L，與3 μ L上樣緩沖液混勻， 點(diǎn)樣于1. 的瓊脂糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經(jīng)電泳檢測(cè)，在一個(gè)泳道上只有同時(shí)出現(xiàn)分子量為675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記；所述上樣緩沖液0. 1%溴酚藍(lán)，40%蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，包括白靈菇與杏鮑菇親本菌株選擇、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果，在一個(gè)泳道上只有同時(shí)出現(xiàn)分子量為675～685bp、435～445bp和235～245bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇與杏鮑菇雜交種的標(biāo)記；本發(fā)明的白靈菇與杏鮑菇雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102312012SQ20111030604
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者劉新銳, 吳小平, 徐美玲, 朱堅(jiān), 江玉姬, 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)