專利名稱：用于檢測番茄黃化曲葉病毒的引物、TaqMan探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用分子生物學方法對病毒進行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實時熒光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技術(shù)對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物、TaqMan探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
番茄(Zj^o/^rsico/ esculentum Mill.)是世界上重要的蔬菜作物，其品種多，營養(yǎng)豐富，用途廣泛。病害的流行和逆境條件會限制番茄生產(chǎn)的發(fā)展。番茄黃化曲葉病毒病是制約番茄生產(chǎn)的重要病害之一，該病害引起番茄植株生長緩慢或停滯，開花結(jié)果困難，果型小等癥狀，致使番茄產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重降低，該病害是由雙生病毒科Wriifee )菜豆金色花葉病毒屬的番茄黃化曲葉病毒(Jomato yellow leaf curl virus, TYLCV)引起的，并通過煙粉虱Ofeffii1Sia to如ci)傳播，隨著煙粉虱在世界各地的擴展、農(nóng)業(yè)耕作制度的改變、貿(mào)易活動的迅速發(fā)展以及氣候的變化，番茄黃化曲葉病毒在世界范圍內(nèi)大面積爆發(fā)流行，目前已在中美洲、非洲、加勒比海地區(qū)、美國的加州和佛羅里達州、中東、 地中海地區(qū)、東南亞地區(qū)、墨西哥、印度、澳大利亞、日本及中國等眾多的地區(qū)和國家發(fā)生 (葉青靜，楊悅儉，王榮青，李志邈，阮美穎，周國治，姚祝平，番茄抗黃化曲葉病育種研究進展，中國農(nóng)業(yè)科學，2009,42 ) 1230-1242)。番茄黃化曲葉病毒的危害在全球范圍內(nèi)日益猖獗，為了控制這類病毒，對其進行檢測。常用的檢測方法有血清學方法、分子生物學方法和生物學檢測法。生物學檢測法是通過番茄表型癥狀來判斷是否感染發(fā)病，該方法受觀察的主觀性和癥狀產(chǎn)生的不確定性影響而具有一定的缺點。目前酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是應(yīng)用最廣泛的血清學檢測方法， 該方法抗血清制備需要時間較長，經(jīng)常存在假陽性反應(yīng)，并且很難檢測出早期的病毒感染。 而分子生物學方法在敏感性和檢測速度上明顯提高，而且可以進行定量。PCR技術(shù)具有特異性強、快速、準確等特點，在病原體檢測、疾病診斷、法醫(yī)學鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用，并且是分子生物學領(lǐng)域常規(guī)的方法和手段。PCR技術(shù)自1985年建立以來，不斷得到改進，1996年，美國Applied Biosystems公司推出了實時熒光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī) PCR 定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入引物對的同時加入特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針與模板特異性結(jié)合，其結(jié)合位點位于引物對之間，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程。實時熒光定量PCR技術(shù)具有更強的特異性、自動化程度高、無EB污染等特點，是快速分子診斷的發(fā)展趨勢。PCR技術(shù)為快速、準確地檢測番茄植株和介體煙粉虱體內(nèi)的TYLCV提供技術(shù)支持， 對快速檢測番茄黃化曲葉病毒暴發(fā)病情具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供用于對番茄黃化曲葉病毒(TYLCV )進行定性、定量檢測的引物。
本發(fā)明所提供的引物，其上游引物堿基序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物堿基序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。序列表中的SEQ ID NO :1由23個堿基組成，該序列為番茄黃化曲葉病毒 (TYLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第856-878位堿基的反向互補序列，SEQ ID NO 2由 18個堿基組成，該序列為TYLCV基因自5’端第756-773位堿基，擴增片段長度為12!3bp。由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。上述引物既適用于番茄黃化曲葉病毒的實時熒光定量PCR檢測，也可用于該病毒的常規(guī)PCR檢測，其檢測對象是TYLCV基因。用上述引物對待測樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物有123bp大小的條帶，則樣品中含有ITLCV。本發(fā)明還提供了用于對TYLCV進行定性、定量檢測的TaqMan探針。本發(fā)明所提供的TaqMan探針，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO 3所示；所述探針是經(jīng)過熒光標記的，其5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。所述報告熒光基團可為FAM、VIC等，淬滅熒光基團可為TAMRA、MGB等。將序列表中SEQ ID NO 3的TaqMan探針命名為TaqManProbe，序列表中的SEQ ID NO 3由31個堿基組成，該序列為番茄黃化曲葉病毒(ITLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第824-邪4位堿基的反向互補序列，第832位的堿基為G ；同時，該序列為番茄黃化曲葉病毒(ITLCV-IL ；FR851297. 1)基因自5，端第擬4_邪4位堿基的反向互補序列，第832位的堿基為T。上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ ID NO 3的基礎(chǔ)上，在序列的5’端和/或3’端再添加、減少一個或多個堿基得到的序列。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測ITLCV的實時熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測TYLCV的實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括盒體和8 支PCR管，在5支PCR管中分別裝有dNTP，MgCl2, PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶和ddH20 ；其中，在另外3支PCR管中分別裝有檢測TYLCV的上游引物SEQ ID NO :1，下游引物SEQ ID NO :2，探針 SEQ ID NO :3。本發(fā)明提供了用于對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針，通過提取待測樣品的DNA，并結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達到準確定量待測樣品中TYLCV的目的。本發(fā)明的有益效果
1、本發(fā)明所提供的引物及探針可用于番茄黃化曲葉病毒的定性及定量分析，對判斷病毒在植物體內(nèi)定植規(guī)律、復制水平和用藥后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意義；
2、本發(fā)明將在番茄黃化曲葉病毒的大規(guī)模檢疫、流行病學調(diào)查及早期診斷方面發(fā)揮重要作用。


圖1為杭州地區(qū)(HZ)與海寧地區(qū)(HN)感染ITLCV樣品PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝
4膠電泳檢測結(jié)果。圖2為菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖3為陽性克隆質(zhì)粒pMDIS-T-ITLCV的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖4為不同稀釋濃度pMDIS-T-ITLCV標準品的實時熒光定量PCR擴增曲線。圖 5 為 07-020、07-025、07-(^6、07-027、07-040 和 07-0296 樣品的實時熒光定量 PCR擴增曲線。圖6為檢測TYLCV的實時熒光定量PCR標準曲線及待測樣品在標準曲線上的位
點ο
具體實施例方式通過以下實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但以下描述不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何意義上的限定。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物和探針由大連寶生物技術(shù)公司合成，所有序列測定工作均由上海生物技術(shù)有限公司完成。實施例1、(用于對TYLCV進行定性、定量檢測的弓丨物及TaqMan探針的設(shè)計) 根據(jù)GenBank中TYLCV的保守序列，設(shè)計擴增外殼蛋白(CP)序列的簡并引物TY1/F
與TY2/R，擴增長度為356bp，對其片段進行克隆、測序和分析，并在356bp序列內(nèi)部設(shè)計特異性的引物與探針。特異性的引物與探針序列如下
上游引物5，-CACCAATAACTGTAGCATGAAAT-3，(序列表中 SEQ ID NO :1)，退火溫度為 54. 5 0C ；
下游引物5，-GCCCAATGGATTTTGGAC-3，(序列表中 SEQ ID NO :2)，退火溫度為 3°C； 探針序列5，_ TCCTCATCACTTGAAACCTATCMCGCAAATC -3，(序列表中 SEQ ID N0:3)，退火溫度為65. 3°C。序列表中的SEQ ID NO :1由23個堿基組成，該序列為番茄黃化曲葉病毒 (TYLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第856-878位堿基的反向互補序列，SEQ ID NO 2由 18個堿基組成，該序列為ITLCV基因自5’端第756-773位堿基，擴增片段長度為12!3bp。將序列表中SEQ ID NO 3的TaqMan探針命名為TaqManProbe，序列表中的SEQ ID NO 3由31個堿基組成，該序列為番茄黃化曲葉病毒(ITLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第824-邪4位堿基的反向互補序列，第832位的堿基為G ；同時，該序列為番茄黃化曲葉病毒(ITLCV-IL ；FR851297. 1)基因自5，端第擬4_邪4位堿基的反向互補序列，第832位的堿基為T。 將上述TaqMan探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3端標記淬滅熒光基團TAMRA。實施例2、(用本發(fā)明的引物對TYLCV進行常規(guī)PCR檢測) 本例所述番茄材料
杭州和海寧地區(qū)感染TYLCV的番茄植株。檢測方法按以下步驟進行
1、基因組DNA的提取取番茄感病植株的葉片0.1克，加液氮研磨成粉末，按常規(guī)CTAB 法提取DNA后，分別保存，備用；
2、PCR擴增在各PCR管中分別加入步驟(1)提取的各樣品DNA20 ng后，再依次加入上下游引物各0. 2 μ M，dNTP 0. 25 mM, MgCl2 2. 0 mM, 1倍的PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶 1 單位,加 ddH20 至 2(^1^后，按？0 反應(yīng)程序941預變性31^11，941 30 seconds，56 59°C退火 30 seconds, 72°C 30 seconds，40 個循環(huán)進行擴增，72°C延伸 lOmin，產(chǎn)物 4°C保存；所述檢測TYLCV的上游引物序列為SEQ ID NO :1，下游引物序列為SEQ ID NO 2 ；
3、PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析各樣品分別取擴增產(chǎn)物10μ L和由0. 25%溴酚蘭加 40%蔗糖配制而成的上樣緩沖液2μ L，混勻，將混合物在1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離， 至溴酚蘭到達凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察、照相；
4、TYLCV的檢測根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，分析判斷被檢測樣品(見圖1)杭州和海寧地區(qū)感染TYLCV植株均擴增出123bp條帶，與預期結(jié)果相符，表明本發(fā)明的引物可用于TYLCV的常規(guī)PCR檢測。實施例3、(用本發(fā)明的引物及TaqMan探針進行TYLCV的實時熒光定量PCR檢測) 本例所述番茄材料
接種 TYLCV 40 天的番茄材料 07-020,07-025,07-026,07-027,07-040 和 07_0四。按以下步驟進行
1、基因組DNA的提取取接種ITLCV 40天的番茄植株葉片0. 1克，加液氮研磨成粉末， 按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用。2、實時熒光定量PCR標準品的制備
(1)TYLCV的PCR擴增產(chǎn)物回收
取實施例2獲得的檢測樣品PCR擴增產(chǎn)物100 μ L，對其進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下12!3bp的目的片段，然后用膠回收試劑盒對該片段進行回收和純化；
(2)連接
將步驟(1)回收的12!3bp的目的片段與PMD18-T載體進行連接，連接體系及條件為回收產(chǎn)物 5 μ L，10 χ T4 DNA 連接酶緩沖液 2 μ L，pMD18_T 載體 1 μ L (TaKaRa), 5U · μ T4 DNA 連接酶 IyL (Promega)，加 ddH20 至 10 μ L，混勻，4°C 過夜；
(3)轉(zhuǎn)化
取200 μ L用CaCl2法制備的DH5 α感受態(tài)細胞，加入到步驟(2)的連接產(chǎn)物中，輕輕混勻，冰上放置30min，然后42°C熱激90 seconds，迅速置冰上3-5min，加入ImL LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，37°C振蕩培養(yǎng)lh，3000rpm離心％iin，棄去約800 μ L上清，用剩余上清懸浮沉淀，并將菌液涂布于 LB 平板上(含 100μ g · mL Amp, 40 μ L X-gal, 4μ L IPTG ),37 °C 振蕩培養(yǎng)16-1 ；
(4)菌落PCR檢測
隨機挑取在LB平板上長出的白斑進行菌落PCR擴增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例2中的常規(guī)PCR所用相同。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴增產(chǎn)物10 μ L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果所有的PCR擴增均擴出12!3bp的目的條帶；
(5)提取陽性克隆的質(zhì)粒
挑取步驟(4)經(jīng)初步鑒定的陽性單克隆，將其接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)12-1 !，然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pMD18-T-ITLCV。 取提取的質(zhì)粒PMD18-T-TYLCV 3 μ L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示，質(zhì)粒PMD18-T-TYLCV的條帶大小約為2. 81Λ，與預期結(jié)果相符；
(6)測序
將攜帶有PMD18-T-ITLCV的重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果pMD18-T_ITLCV所攜帶擴增片段具有序列表中SEQ ID NO 4的核苷酸序列，表明pMD18-T-ITLCV所攜帶的12!3bp的擴增片段與TYLCV基因中的序列完全一致，構(gòu)建的質(zhì)粒序列是正確的；
(7)pMD18-T-TYLCV 的濃度測定
取pMD18-T-ITLCV原液10 μ L，稀釋至100 μ L無菌重蒸水中，用紫外分光光度計測的 OD260 值為 0. 3616，1 μ L pMD18-T_TYLCV 原液的含 5. 86 X IO11 個拷貝。3、用TaqMan探針對ITLCV進行實時熒光定量PCR檢測 (1)繪制標準曲線
將PMD18-T-TYLCV原液按 10 χ 系列稀釋為 5. 86 χ IO3,5. 86 χ 104、5. 86 χ IO5,5. 86 χ 106、5.86 χ io7個拷貝進行實時熒光定量PCR檢測，20μ L反應(yīng)體系含20 mmol -L"1 Mg2 + 的 10XPCR 緩沖液 2 μ L，IOmmol .171 dNTPs 0. 4μ L, 10 mmol .171 上、下游引物各 0. 5 μ L， 2 U ·μ —的 Taq 酶 0· 2 μ L，10 mmol .171 TaqMan 探針 0· 4 μ L，DNA 1 μ L，力口 ddH20 至總體積為 20 μ L0 反應(yīng)條件94 °C預變性 5 min，94 "C 30 seconds, 59 "C 50 seconds, 40 個循環(huán)，熒光信號的收集及數(shù)據(jù)的采集定在59°C。結(jié)果各個稀釋濃度的pMDIS-T-TYLCV均能產(chǎn)生熒光信號，Ct值分別為33. 46 ,30. 56,27. 86,24. 00,20. 31，擴增曲線見圖4，定量數(shù)據(jù)見表1，由擴增曲線得到的標準曲線斜率為-3.觀6，標準曲線見圖6 (Y=-3. 286Χ+46. 19)；表1不同稀釋濃度pMD18-T-ITLCV以及接種ITLCV材料的實時熒光定量PCR
權(quán)利要求
1.用于對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物，其特征在于該引物的上游引物堿基序列如SEQ ID NO 1所示或者如序列表中SEQ ID NO 1所示序列的衍生序列，下游引物堿基序列如SEQ ID NO 2所示或者如SEQ ID NO 2所示序列的衍生序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的弓I物序列。
3.用于對番茄黃化曲葉病毒進行實時熒光定量PCR檢測的TaqMan探針，其特征在于 該探針的DNA序列如SEQ ID NO 3所示或者如SEQ ID NO 3所示DNA序列的衍生序列； 所述探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于對番茄黃化曲葉病毒進行實時熒光定量PCR檢測的 TaqMan探針，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID NO 3的基礎(chǔ)上，在序列的5’端和/ 或3’端添加一個或多個堿基得到的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于對番茄黃化曲葉病毒進行實時熒光定量PCR檢測的 TaqMan探針，其特征在于所述報告熒光基團為FAM或VIC，淬滅熒光基團為TAMRA或MGB。
6.檢測番茄黃化曲葉病毒的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權(quán)利要求1所述的用于對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物和權(quán)利要求3所述的用于對番茄黃化曲葉病毒進行實時熒光定量PCR檢測的TaqMan探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及用分子生物學方法對病毒進行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實時熒光定量PCR技術(shù)對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物、TaqMan探針和試劑盒。該引物的上游引物堿基序列如SEQ ID NO1所示，下游引物堿基序列如SEQ ID NO2所示。探針的DNA序列如SEQ ID NO3所示，探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。試劑盒包括上述的引物和探針。本發(fā)明所提供的引物及探針可用于番茄黃化曲葉病毒的定性及定量分析，對判斷病毒在植物體內(nèi)定植規(guī)律、復制水平和用藥后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意義。將在番茄黃化曲葉病毒的大規(guī)模檢疫、流行病學調(diào)查及早期診斷方面發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/11GK102417934SQ201110305910
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者萬紅建, 葉青靜, 周國治, 姚祝平, 李志邈, 楊悅儉, 王榮青, 阮美穎 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院