專利名稱：一個(gè)靶向抑制羊痘病毒P32基因的siRNA序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)序列，以及這個(gè)序列的用途。確切講本專利涉及一種可抑制羊痘病毒的序列，以及這個(gè)序列的用途。
背景技術(shù)：
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(She印pox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發(fā)生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現(xiàn)丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變甚至死亡， 給世界養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其規(guī)定為法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。羊痘的預(yù)防和控制一直是研究的熱點(diǎn)。P32蛋白是羊痘病毒的囊膜蛋白，由319-3M個(gè)氨基酸組成，具有跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于C端287 307位氨基酸處。P32蛋白是從羊痘病毒感染細(xì)胞中分離得到的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為32kDa。此蛋白為目前世界各地分離、鑒定的CPV的各毒株所共有特異很強(qiáng)且含有重要的抗原決定簇，它能夠刺激豚鼠迅速產(chǎn)生抗CPV的中和抗體。P32蛋白是羊痘病毒基因組中研究背景相對(duì)最為清楚的蛋白，因此，如果干擾掉羊痘病毒的P32基因的表達(dá)，將會(huì)降低病毒的免疫原性，從而降低病毒的致病性。但目前世界上并沒有基于RNA干擾技術(shù)靶向羊痘病毒的研究的報(bào)道，也沒有RNA干擾方法在P32蛋白的研究的報(bào)道。因此 P32基因作為RNA干擾靶向的目的基因是一個(gè)較為理想的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明給出一個(gè)人工序列，實(shí)驗(yàn)中這一序列表現(xiàn)出對(duì)羊痘病毒P32基因具有抑制作用。本發(fā)明的序列為GUGCUCCUAUUAUACUAAU，在本發(fā)明中被命名為siRNA_P32。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的序列siRNA_P32可以抑制羊痘病毒P32基因的表達(dá)。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提示本發(fā)明的序列siRNA_P32可在制備抗羊痘病毒的疫苗中的應(yīng)用， 也可在制備抗羊痘病毒的藥物中的應(yīng)用。更進(jìn)一步，本發(fā)明的序列siRNA_P32可在培育具有抗羊痘病毒的羊品種中應(yīng)用。 例如敲除相關(guān)的基因以培育對(duì)羊痘病毒具有自然抵抗能力的羊的新品種。


圖1為空載體pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞對(duì)照熒光表達(dá)觀察圖，其中左圖和右圖分別為空載體表達(dá)后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場(chǎng)和明場(chǎng)下的表達(dá)情況。圖2為重組質(zhì)粒PEGFP-P32轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞對(duì)照熒光表達(dá)觀察，即P32基因真核表達(dá)載體構(gòu)建以后在BHK21細(xì)胞中表達(dá)的鑒定，其中左圖和右圖分別為pEGFP-P32表達(dá)后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場(chǎng)和明場(chǎng)下的表達(dá)情況，從圖2可看出pEGFP-P32在BHK21 細(xì)胞中得到了表達(dá)。
圖3為PEGFP-P32和陰性對(duì)照siRNA共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞熒光表達(dá)觀察，其中左圖和右圖分別為PEGFP-P32和siRNA陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場(chǎng)和明場(chǎng)下的表達(dá)情況。圖4為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BHK21細(xì)胞陰性對(duì)照熒光表達(dá)觀察，即空白對(duì)照?qǐng)D，其中左圖和右圖為什么也沒有轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場(chǎng)和明場(chǎng)下的表達(dá)情況。圖5為pEGFP-P32和siRNA_P32共轉(zhuǎn)染的BHK21熒光表達(dá)觀察，其中左圖和右圖分別為共轉(zhuǎn)染PEGFP-P32和siRNA-P32的BHK21細(xì)胞在在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場(chǎng)和明場(chǎng)下的表達(dá)情況。由上述圖中看出，跟對(duì)照相比，圖5所示的共轉(zhuǎn)染pEGFP-P32和siRNA_P32的組熒光明顯少于對(duì)照組的圖3，這說明siRNA-P32能夠抑制P32的表達(dá)。圖6為未轉(zhuǎn)染的陰性細(xì)胞對(duì)照組的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。圖7為只轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-Nl的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。圖8為重組質(zhì)粒pEGFP-P32和對(duì)照siRNA共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 結(jié)果轉(zhuǎn)染了 siRNA對(duì)照后，pEGFP-P32表達(dá)陽性細(xì)胞率為60%。圖9為重組質(zhì)粒pEGFP-P32和siRNA_P32共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果轉(zhuǎn)染了 siRNA-P32后，pEGFP-P32表達(dá)陽性細(xì)胞率為4. 2%。與陰性對(duì)照組相比， PEGFP-P32 表達(dá)下降了 93%。圖10為RT-PCR檢測(cè)共轉(zhuǎn)染pEGFP_P32與siRNA_P32的BHK21細(xì)胞的基因組。收集轉(zhuǎn)染后4 的細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增p32，在Tm為45°C 30s 條件下相同體系擴(kuò)增BHK21的β -actin。其中1泳道為轉(zhuǎn)染pEGFP_P32和對(duì)照siRNA的細(xì)胞RT-PCR ；2泳道為僅轉(zhuǎn)染pEGFP-P32的細(xì)胞RT-PCR ；3泳道為僅轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-Nl的細(xì)胞RT-PCR ；4泳道為共轉(zhuǎn)染pEGFP-P32和siRNA_P32的細(xì)胞RT-PCR ；5泳道為以水為模板 RT-PCR空白對(duì)照。Labworks分析系統(tǒng)上進(jìn)行圖象處理及灰度分析結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，對(duì)照siRNA-P32對(duì)P32蛋白抑制率為78. 4%0
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解說1.序列的制備本發(fā)明設(shè)計(jì)的序列為GUGCUCCUAUUAUACUAAU。將設(shè)計(jì)好的序列發(fā)送至上海吉瑪生物工程有限公司進(jìn)行5’端修飾合成。2. pEGFP-P32表達(dá)載體的構(gòu)建使用TaKaRa公司DNA提取試劑盒從山羊痘病毒Vero細(xì)胞毒株中提取DNA，以提取純化的病毒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增上游引物為5' -GTCCTCGAGATGGCAGATA-3‘，下游引物5' -GCGGATCCAACTATATACGT-3 ‘，參見見文獻(xiàn)“.山羊痘病毒古浪株P(guān)32毒力蛋白的結(jié)構(gòu)模擬與分析”趙志荀，吳國(guó)華，顏新敏，崔力凡，李健，朱海霞，張強(qiáng).《中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)》，2010，40 (08) :771-777。PCR 反應(yīng)體系為=IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTPs4 μ L， 模板lyL，引物F、P各lyL，rTaq酶0. 5yL，補(bǔ)超純水至50yL。反應(yīng)條件為95°C 5min ； 94°C 45s, 54°C 45s, 72°C 45s，30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0經(jīng)反應(yīng)獲得的目的基因用膠回收試劑盒回收后，直接連入PM D18-T simple載體并轉(zhuǎn)化Dffia大腸桿菌。經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選白斑，小量制備質(zhì)粒，以Biol和BamHI酶切和PCR方法鑒定陽性克隆并送大連寶生物公司測(cè)序。用Biol、BamHI對(duì)陽性pMD18-T simple質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段。用T4DNA 連接酶連接到經(jīng)》iol、BamHI雙酶切、純化、回收的pEGFP-Nl大片段上并轉(zhuǎn)化入Dffia大腸桿菌中，涂布于含有50μ L/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板，置于37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選白斑，小量制備質(zhì)粒，以》iol和BamHI酶切和測(cè)序方法鑒定所構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 PEGFP-P32序列完全正確且讀碼框無錯(cuò)誤。3. pEGFP-P32 和 siRNA_P32 共轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞將鑒定好的pEGFP-P32菌落轉(zhuǎn)入IOOml大瓶培養(yǎng)，進(jìn)行中量質(zhì)粒提取(按說明操作)，再次經(jīng)酶切消化鑒定后測(cè)OD值，計(jì)算出濃度，備轉(zhuǎn)染用。按常規(guī)方法，將BHK21細(xì)胞以每孔0. 5X IO5個(gè)接種于M孔板，待單層細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 90%后，每孔按優(yōu)化好的質(zhì)粒DNA FuGENE HD Transfection Regent = 0.8yg 3μ1的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別培養(yǎng)M、48 和7 后，在熒光顯微鏡下直接檢測(cè)EGFP的表達(dá)。4.不同方法檢測(cè)siRNA_P32對(duì)P32的干擾效果4. 1熒光顯微鏡初步觀察SiRNA對(duì)P32的抑制效果Olympus熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。并隨機(jī)選擇視野拍照。結(jié)果可見圖 1，2，3。由圖l，2，3看出，跟對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)染pEGFP-P32和siRNA_P32的組熒光明顯少于對(duì)照組。說明siRNA-P32能夠抑制P32的表達(dá)。 4. 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾效果將轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞棄培養(yǎng)液，PBS液沖洗，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞， 40C 4000rpm離心5min，棄上清，加入PBS液，用吸管反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，室溫置30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白強(qiáng)度，由軟件分析出細(xì)胞熒光陽性率。未做任何轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果見圖4，5，6，7。與陰性對(duì)照組相比，pEGFP-P32表達(dá)下降了 93%。4. 3RT-PCR檢測(cè)干擾效果將共轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄，半定量PCR檢測(cè)P32蛋白mRNA水平， 并以β-actin基因作為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物分別取等量經(jīng)IOg 的瓊脂糖凝膠電泳分離。并在Labworks分析系統(tǒng)上進(jìn)行圖象處理及灰度分析。結(jié)果見圖8，與陰性對(duì)照組相比，對(duì)照 siRNA-P32對(duì)Ρ32蛋白抑制率為78. 4%0綜上可見，這里設(shè)計(jì)合成的siRNA_P32對(duì)P32蛋白具有明顯的抑制效果。
權(quán)利要求
1.一個(gè)靶向抑制羊痘病毒P32基因的siRNA序列siRNA-P32，其特征是siRNA_P32的序列為GUGCUCCUAUUAUACUAAU。
2.權(quán)利要求1所述的序列siRNA-P32在制備抗羊痘病毒的疫苗中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的序列siRNA-P32在制備抗羊痘病毒的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的序列siRNA-P32在培育具有抗羊痘病毒的羊品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一個(gè)可抑制羊痘病毒的siRNA序列，這個(gè)序列為GUGCUCCUAUUAUACUAAU。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提示本發(fā)明的這一序列可以抑制羊痘病毒P32基因的表達(dá)，可在制備抗羊痘病毒的疫苗中的應(yīng)用，也可在制備抗羊痘病毒的藥物中的應(yīng)用，更進(jìn)一步講，本發(fā)明的序列可在培育具有抗羊痘病毒的羊品種中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102337264SQ20111030909
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者吳國(guó)華, 崔立凡, 張強(qiáng), 才學(xué)鵬, 朱海霞, 李鍵, 趙志荀, 顏新敏, 高順平 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所