專利名稱：一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬海水處理領(lǐng)域，涉及一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法，適合海洋油污廢水和污泥生物修復(fù)和生物處理。
背景技術(shù)：
石油是非常寶貴的燃料、潤(rùn)滑劑和化工原料。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的迅速發(fā)展，油類及其產(chǎn)品廣泛地用于國(guó)民經(jīng)濟(jì)的各個(gè)領(lǐng)域和人類的日常生活中，而且其使用量與日俱增。隨著世界對(duì)石油及其制品日益增長(zhǎng)的需求，在海上開采、運(yùn)輸、裝卸以及利用石油過程中溢油事故日益增多，使大量石油進(jìn)入水體、流入海洋。油類污染物質(zhì)已經(jīng)成為海洋的主要污染物之一。石油進(jìn)入海洋水體后，對(duì)水生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，使大量水生生物死亡，并對(duì)水資源、生物資源和養(yǎng)殖、旅游業(yè)帶來巨大損失[C. J . Camphuysen, M Heubeek. Marine oil pollution and beached bird surveys :thedevelopment of a sensitive monitoring h3stnnment 們.Environmental pollution. 2001，443-461]。目前，海洋石油污染治理己被列入“21世紀(jì)重大議程”，成為當(dāng)今環(huán)境工作者研究的熱點(diǎn)問題。目前海洋油污處理方法主要有物理方法，化學(xué)方法和生物方法。物理方法適用于較厚油層的回收處理，但其對(duì)于厚度小于0. 3cm的薄油層和乳化油效果較差，且受風(fēng)浪和石油性質(zhì)等因素的限制?；瘜W(xué)方法成本高，且容易造成二次污染。與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法相比，生物修復(fù)方法能夠更有效地清除海洋石油污染，對(duì)人和環(huán)境造成的影響小，它能夠使污染物最終分解為二氧化碳和水，而且生物修復(fù)過程迅速，費(fèi)用低，修復(fù)費(fèi)用僅為傳統(tǒng)物理、化學(xué)修復(fù)的 30%-50% [Hicksbn. Caplanja, Bioremediati =Anatural solution [J]. Pollution Engineering,1993,25(2) :30-33]。通過近些年的研究雖然已發(fā)現(xiàn)了大量的可降解石油微生物，但最大問題缺少穩(wěn)定和適應(yīng)性強(qiáng)的菌株，并且某一種類的微生物只能對(duì)特定的石油組分有降解作用。在目前的海洋石油降解菌群篩選中，主要存在著馴化時(shí)間長(zhǎng)，鹽度適應(yīng)不夠和篩選過程繁瑣等問題。 因此，針對(duì)海水的高鹽度，研究高效石油降解混合菌群對(duì)海洋油污的生物修復(fù)和生物處理具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
1.裝置設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一種用于模擬海灘溢油生物修復(fù)的裝置，由缸體、隔板、右溫度計(jì)、 左溫度計(jì)、造浪器、控溫裝置和照明裝置組成，缸體底部?jī)蛇呍O(shè)有右出水管口和左出水管口，并相應(yīng)設(shè)有右水閥和左水閥，在缸體中間設(shè)有一可卸載的隔板，將缸體分隔成左右2個(gè)空間，在缸體左右兩側(cè)分別安裝左溫度計(jì)和右溫度計(jì)，從外部可觀察到溫度計(jì)的讀數(shù)，缸體右側(cè)安裝有可卸載的人工造浪器，造浪器通過吸盤吸住缸體內(nèi)壁，控溫裝置也通過吸盤吸住缸體內(nèi)壁以固定，可卸載照明裝置安裝在缸體上部，人工造浪器和控溫裝置、照明裝置分
4別通過插頭連接外接電源。缸體材料選用透明的普通玻璃或有機(jī)材料。2.菌源樣品采集從靜水層中收集水樣，從油污泥表層中采集0. 5-1. Okg污泥樣， 分別置于無菌器皿中，在M小時(shí)內(nèi)進(jìn)行步驟(3 )富集培養(yǎng)或4°C下密封保存。3.菌群富集
取水樣IOml和污泥樣品0. 5g放于500ml —代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下進(jìn)行搖床富集培養(yǎng)一天時(shí)間，即獲得一代富集菌群培養(yǎng)液；
經(jīng)過第一步的富集培養(yǎng)后，按照一代富集菌群培養(yǎng)液二代富集培養(yǎng)基=1:10的比例， 將一代富集菌群培養(yǎng)液添加到二代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)一天， 至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，即獲得二代富集菌群培養(yǎng)液；
然后取二代富集菌群培養(yǎng)液，按照二代富集菌群培養(yǎng)液三代富集培養(yǎng)基=1:10的比例添加到三代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)，至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，至此富集完畢，得到三代富集菌群培養(yǎng)液。其中一代富集培養(yǎng)基組成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)5 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 溫度25 °C。
二代富集培養(yǎng)基組成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)10 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 溫度25 °C。
三代富集培養(yǎng)基組成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)20 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 溫度25V。
5
(4)菌群馴化
將步驟(3)得到的三代富集培養(yǎng)菌群培養(yǎng)液按照體積比為1:100的比例加到盛有含油量質(zhì)量體積比1%的油污廢水的模擬裝置右側(cè)的油污廢水中，同時(shí)按照濃度比生化需氧量 尿素磷酸二氫鉀=100:5:1將尿素和磷酸二氫鉀混合，溫度25°C，進(jìn)行馴化處理，連續(xù)換水三次后，缸體底部即為馴化好的微生物菌群。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法在海洋油污事故地區(qū)的油污生物降解中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法是一種，經(jīng)濟(jì)，高效的海洋油污降解微生物的篩選及馴化方法， 菌群在馴化后可快速適應(yīng)油污環(huán)境、生態(tài)安全，無污染。本技術(shù)菌群篩選快速，適應(yīng)高鹽度， 適用于海洋油污的原位修復(fù)。本發(fā)明的特點(diǎn)主要有1.經(jīng)濟(jì)，成本低菌源取自污染區(qū)及附近，同時(shí)無需大型設(shè)備投資和試劑費(fèi)用，成本低，利于推廣。2.效率高篩選出的菌群比單株石油降解菌株效果好，菌群內(nèi)部各菌株協(xié)同作用，高效降解油污。3.快速適應(yīng)一般篩選出的菌群1-2天就可迅速在污染區(qū)快速繁殖，且由于本身菌群適應(yīng)一定鹽度，所以可以更快的應(yīng)用于海洋油污事故。本發(fā)明快速，經(jīng)濟(jì)，高效，環(huán)保，是海洋油污微生物篩選馴化方法的理想選擇。


圖1是使用本發(fā)明方法進(jìn)行菌群馴化的模擬裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明使用狀態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為通過本方法篩選出的菌群一、菌群二與單菌3XG-1，L2, 1中 XS, 2XS-2, 3XS-1, 2中XD-16株單菌降解率的比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1
參見圖1，一種模擬海灘溢油生物修復(fù)的裝置，主要由缸體11、隔板3、右溫度計(jì)4、左溫度計(jì)5、造浪器6、控溫裝置7和照明裝置8組成，缸體11底部?jī)蛇呍O(shè)有右出水管口 1和左出水管口 9，并相應(yīng)設(shè)有右水閥2和左水閥10，在缸體中間設(shè)有一可卸載的隔板3，將缸體 11分隔成左右2個(gè)空間，在缸體左右兩側(cè)分別安裝左溫度計(jì)5和右溫度計(jì)4，從外部可觀察到溫度計(jì)的讀數(shù)，缸體11右側(cè)安裝有可卸載的VP-201人工造浪器6，造浪器6通過吸盤吸住缸體內(nèi)壁，HT-75W控溫裝置7也通過吸盤吸住缸體內(nèi)壁以固定。在缸體上部安裝對(duì)可卸載照明裝置8，人工造浪器6和控溫裝置7、照明裝置8分別通過插頭連接外接電源。缸體 11材料選用透明的普通玻璃或有機(jī)材料。實(shí)施例2 (1)菌源樣品獲得
水樣采集采用無菌藍(lán)口瓶靜水層中收集水樣約500ml，污泥樣采集是從油污泥表層采集約0. 5-1. Okg置于無菌器皿中，所有樣品均應(yīng)該在Mh內(nèi)進(jìn)行富集培養(yǎng)或4°C下密封保存。研究發(fā)現(xiàn)，海洋油污發(fā)生地及周邊以前發(fā)生過海洋油污事故的地區(qū)降解油污菌種資源豐富，這些菌種承擔(dān)著消除海洋油污的重任。本發(fā)明的菌源篩選樣品來自舟山碼頭清洗船舶后產(chǎn)生的油污廢水和污泥，這些廢棄物含鹽度大，上層漂浮一層浮油。(2)菌群富集
取水樣IOml和污泥樣品0. 5g放于500ml —代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下進(jìn)行搖床富集培養(yǎng)約一天時(shí)間，即可獲得一代富集菌群培養(yǎng)液；
經(jīng)過第一步的富集培養(yǎng)后，按照一代富集菌群培養(yǎng)液二代富集培養(yǎng)基=1:10的比例， 將一代富集液添加到二代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)約一天，至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，即可獲得二代富集菌群培養(yǎng)液；
然后取二代富集菌群培養(yǎng)液按照上述1 10的比例添加到三代富集培養(yǎng)基中，在25°C， 140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)，至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，至此富集完畢，得到三代富集菌群培養(yǎng)液。所述一代富集培養(yǎng)組成如下
Yeast extract1 g/L
Peptone5 g/L
尿素1.6 g/L
8 g/L 5 g/L 1 L
7. 0 士 0. 5，
K2HPO4
油污(原油柴油=1:5) 海水 PH
溫度25°C。所述二代富集培養(yǎng)基組成如下 Yeast extract1 g/L Peptone 5 g/L 尿素 1.6 g/L K2HPO4 8 g/L 油污(原油柴油=1:5) 10 g/L 海水 1 L
pH7.0 士 0· 5
溫度25 °C。所述三代富集培養(yǎng)基組成如下
Yeast extract1g/LPeptone5g/L尿素1.6 g/K2HPO4 g/L油污(原油柴油=1:5)20g/L海水1L
pH7.0 士 0.5
溫度25 °C。
(3)菌群馴化
參見圖2，使用時(shí)，在缸體11由隔板3隔成的左側(cè)空間底部鋪滿普通沙土，高度為缸體
7U高度的一半，然后在其上部填充含油量約為1%質(zhì)量比的含油沙土，使得夾角α為30°， 用來模擬含油海灘。由進(jìn)水管口 1進(jìn)海水至最高水位二4小時(shí)不間斷開動(dòng)造浪器6，以模擬海浪，通過控溫裝置7調(diào)溫度至25°C，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)右溫度計(jì)4和左溫度計(jì)5的溫度變化。 每12小時(shí)開動(dòng)照明裝置8，模擬光照。同時(shí)通過控制出水閥門9，使水位在12小時(shí)左右降至最低水位，模擬海水漲潮退潮，每12個(gè)小時(shí)進(jìn)一次海水。 將步驟(2)得到的三代富集培養(yǎng)菌群培養(yǎng)液按照體積比1:100的比例加到盛有含油量質(zhì)量體積比1%的油污廢水的模擬裝置右側(cè)的油污廢水中，同時(shí)按照濃度比生化需氧量(COD):尿素磷酸二氫鉀=100 5 1將尿素和磷酸二氫鉀營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合，控制溫度25°C， 進(jìn)行馴化處理。連續(xù)換水三次，缸體11右側(cè)底部即為馴化好的微生物菌群。篩選好的菌群直接撒至海洋油污事故地區(qū)(溢油現(xiàn)場(chǎng))水面上的油污生物降解，進(jìn)行生物修復(fù)。表1為現(xiàn)場(chǎng)菌種培養(yǎng)后降解率比較。圖3是通過本方法篩選出的菌群一、菌群二與單菌3XG-1，L2，1 中XS, 2XS-2, 3XS-1, 2中XD-16株單菌降解率的比較。
表權(quán)利要求
1. 一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn) (I )裝置設(shè)計(jì)裝置由缸體(11)、隔板(3)、右溫度計(jì)(4)、左溫度計(jì)(5)、造浪器(6)、控溫裝置(7)和照明裝置(8)組成，缸體(11)底部?jī)蛇呍O(shè)有右出水管口(1)和左出水管口(9)， 并相應(yīng)設(shè)有右水閥(2 )和左水閥(10 )，在缸體中間設(shè)有一可卸載的隔板(3 )，將缸體(11)分隔成左右2個(gè)空間，在缸體兩側(cè)分別安裝左溫度計(jì)(5)和右溫度計(jì)(4)，缸體(11)右側(cè)安裝有可卸載的人工造浪器(6)和控溫裝置(7)，造浪器(6)和控溫裝置(7)通過吸盤吸住缸體內(nèi)壁，照明裝置(8)安裝在缸體上部，人工造浪器(6)、控溫裝置(7)和照明裝置(8)分別通過插頭連接外接電源；(II)菌源樣品采集從靜水層中收集水樣，從油污泥表層中采集0.5-1. Okg污泥樣，分別置于無菌器皿中，在M小時(shí)內(nèi)進(jìn)行步驟(3)富集培養(yǎng)或4°C下密封保存；(III)菌群富集取水樣IOml和污泥樣品0. 5g放于500ml —代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下進(jìn)行搖床富集培養(yǎng)一天時(shí)間，即獲得一代富集菌群培養(yǎng)液；經(jīng)過第一步的富集培養(yǎng)后，按照一代富集菌群培養(yǎng)液二代富集培養(yǎng)基=1:10的比例， 將一代富集菌群培養(yǎng)液添加到二代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)一天， 至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，即獲得二代富集菌群培養(yǎng)液；然后取二代富集菌群培養(yǎng)液，按照二代富集菌群培養(yǎng)液三代富集培養(yǎng)基=1:10的比例添加到三代富集培養(yǎng)基中，在25°C，140rpm下繼續(xù)富集培養(yǎng)，至油水混合現(xiàn)象出現(xiàn)，至此富集完畢，得到三代富集菌群培養(yǎng)液；其中一代富集培養(yǎng)基組成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污5 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5溫度25 °C ；ニ代富集培養(yǎng)基組成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污10 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5溫度25 °C ；三代富集培養(yǎng)基組成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污20 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5溫度25 °C ； (IV)菌群馴化將步驟(3)得到的三代富集培養(yǎng)菌群培養(yǎng)液按照體積比為1:100的比例加到盛有含油量質(zhì)量體積比1%的油污廢水的模擬裝置右側(cè)的油污廢水中，同時(shí)按照濃度比生化需氧量 尿素磷酸二氫鉀=100:5:1將尿素和磷酸二氫鉀混合，溫度25°C，進(jìn)行馴化處理，連續(xù)換水三次后，缸體(11)底部即為馴化好的微生物菌群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法，其特征在于， 步驟(I )所述缸體(11)材料選用透明的普通玻璃或有機(jī)材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法在海灘溢油生物修復(fù)和馴化石油降解菌群中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種海洋油污微生物菌群的篩選和馴化方法，通過海洋油污發(fā)生地區(qū)獲得菌源樣品，而后經(jīng)過一代，二代，三代富集培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液，通過篩選富集，并經(jīng)過一代，二代，三代富集培養(yǎng)獲得富集培養(yǎng)液，再利用設(shè)計(jì)的裝置，添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行馴化處理后獲得得到馴化微生物菌群，篩選好的菌群可用于海洋油污事故地區(qū)的油污生物降解。可在海灘溢油生物修復(fù)和馴化石油降解菌群中的應(yīng)用。本發(fā)明方法具有快速，經(jīng)濟(jì)，高效，環(huán)保的特點(diǎn)，可以更快的應(yīng)用于海洋油污事故，是海洋油污微生物篩選馴化方法的理想選擇。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102433260SQ20111032451
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者張文武, 楊志堅(jiān), 肖金星, 鄭剛 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)舟山海洋研究中心