專利名稱：Muc1蛋白核酸適配子、復合體、組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及MUCl蛋白核酸適配子、復合、組合物及其用途。
背景技術：
化療是治療腫瘤最主要的手段，尤其是對于晚期階段的轉移性腫瘤。但是，細胞毒藥物產生的副作用往往限制了化療的效果。細胞毒藥物最主要的問題是它們能同時損傷腫瘤細胞和正常組織，引起嚴重的副反應，限制了化療的強度和時程。因此，細胞毒藥物很難能夠清除體內的腫瘤細胞，進而導致了臨床上治療的失敗和患者預后的不良?；谶@一點，需要研發(fā)新的方法來降低化療藥物的毒性。靶向治療是實現(xiàn)這一目標的途徑之一。靶向治療是指靶向分子攜帶藥物特異性地到達腫瘤部位，使藥物更多的富集在腫瘤組織中，而在正常組織中的含量較少。由于藥物被特異性地帶到腫瘤部位，對腫瘤組織的殺傷增強而對正常組織殺傷較弱，從而有助于清除體內的腫瘤細胞，并大大降低毒副作用。靶向治療是有希望改善抗腫瘤化療療效的重要方向之一。已有文獻報道，核酸適配子作為靶向分子的納米載體攜帶順鉬在小鼠腫瘤模型中能夠顯著增強抗前列腺癌的效果(Dhar S，Gu FX, Langer R, Farokhzad 0C, Lippard SJ(2008)Targeted delivery of cisplatinto prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt (IV)prodrug-PLGA-PEGnanoparticles.Proc Natl Acad Sci USA 105:17356-17361.)。單克隆抗體和藥物共價連接已經用于腫瘤的靶向治療研究。其中，HER2抗體和一種化學藥物形成的復合體正在進行 III 期臨床試驗(Vogel CL, Burris HA, Limentani S, Borson R, O' ShaughnessyJ, etal.(2009)A phase II study of trastuzumab-DMl(T-DM1), a HER2antibody-drugconjugate(ADC), in patients(pts)with HER2+metastatic breast cancer (MBC):Finalresults.Journal of Clinical Oncology 27.)。
靶向藥物傳遞系統(tǒng)通常包括抗腫瘤藥物和靶向分子，靶向分子能夠和表達在腫瘤細胞表面的腫瘤標志物特異性的結合。一個理想的分子靶標最好是表達在腫瘤細胞膜表面，并且在腫瘤部位高表達而正常組織低表達或不表達。MUCl蛋白是一種廣泛的表達在多種腫瘤細胞膜上的糖蛋白，在大多數(shù)腺癌(乳腺癌、肺癌、結腸癌等)中高表達，表達量是正常組織的 10 倍以上(Taylor-Papadimitriou J, Burchell J, MilesDff, Dalziel M(1999)MUCland cancer.BBA-Mol Basis Dis 1455:301-313.)，因而是一個較為理想的靶標。MUCl蛋白由肽核心和糖鏈組成，肽核心是一段可變的重復序列，是具有免疫原性的部分，正常表達時，糖鏈的存在使肽核心隱蔽起來，失去免疫原性，腫瘤組織中異常表達時，由于糖鏈的丟失而使肽核心部分暴露了出來，成為治療的靶點?，F(xiàn)有技術中對MUCl蛋白的篩選也是應用這段多肽作為靶標，這可能是由于很難獲得整個MUCl蛋白。
靶向治療的實現(xiàn)還需要合適的靶向分子，理想的靶向分子是能夠和靶標特異性結合，親和力高，在體內免疫原性弱，穩(wěn)定性好。最近，一批新的靶向分子例如核酸適配子、短肽和小分子已經成為了新一代的靶向分子。核酸適配子(aptamer)是近幾十年發(fā)展起來的新型核苷酸配體分子，特異性強，親和力高，相比抗體有許多優(yōu)勢，例如易于大規(guī)模合成，價格便宜，易于體外修飾，體內低免疫原性，易于穿透腫瘤組織等。因此，核酸適配子越來越廣泛的作為靶向載體工具應用到腫瘤的靶向治療研究中。根據(jù)已有的報道，F(xiàn)erreira小組篩選到了一組MUCl蛋白的適配子，能夠選擇性的和MUCl陽性的腫瘤細胞結合，并且，篩選出來的適配子還可在體外選擇性的攜帶光動力治療劑到MUCl陽性腫瘤細胞(Ferreira CS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxicaptamers selectively enter and kill epitheIialcancer cells.Nucleic Acids Res37:866-876.)。
細胞毒藥物是化療中最重要的成分，因此，研究MUCl的適配子能否直接攜帶細胞毒藥物到腫瘤細胞是非常重要的。至今為止，還沒有文獻報道過這項研究。細胞毒藥物是化療中最重要的成分，還沒有文獻報道過MUCl的適配子能否直接攜帶細胞毒藥物到腫瘤細胞。發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的在于獲取能高特異性地結合腫瘤細胞MUCl蛋白的核酸適配子并探尋其在制備腫瘤特異性靶向治療藥物中的用途。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種MUCl蛋白特異性結合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO:9所示，以及其保持與MUCl蛋白特異性結合能力的長度介于70-110、優(yōu)選75-100、更優(yōu)選80-90、最優(yōu)選86個核苷酸的變體，優(yōu)選地，所述變體具有如SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11所示的序列。
本發(fā)明的第二方面涉及一種復合體，其由如第一方面所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物結合而成或被共同包在納米粒中，優(yōu)選地，MUCl蛋白特異性結合核酸適配子的序列如SEQ IDN0:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示，且其中MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物的摩爾比例的范圍為0.001 1，優(yōu)選地，0.003 0.1，更優(yōu)選地，0.005 0.03。
優(yōu)選地，所述化療藥物選自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌，優(yōu)選地，所述化療藥物為阿霉素。
本發(fā)明的第三方面涉及一種組合物，其活性成分為上述第二方面所述的復合體。
本發(fā)明的第四方面涉及根據(jù)上述第一方面所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子作為化療藥物靶向 載體的用途，優(yōu)選地，所述化療藥物選自抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來曲唑、強的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼，更優(yōu)選地，所述化療藥物選自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、順鉬、吉西他濱、雷替曲塞、絲裂霉素、博萊霉素、長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿、卡鉬、他莫昔芬、來曲唑、強的松、吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼。
優(yōu)選地，所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物組成復合體或者被共同包在納米粒中。
本發(fā)明的第五方面涉及根據(jù)上述第二方面所述的復合體或根據(jù)第四方面所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中所述腫瘤為腺癌，優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結腸癌或肝癌。
優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物的劑型為口服劑、肌肉注射劑或靜脈注射劑。
本發(fā)明的第六方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和腫瘤顯影劑的組合物，優(yōu)選地，所述MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和腫瘤顯影劑形成復合體，優(yōu)選地，所述顯影劑是鐵磁性納米?；虬孙@影劑的納米粒，優(yōu)選地，所述組合物中含有一種或多種MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和/或腫瘤顯影劑。
本發(fā)明的第七方面涉及一種根據(jù)上述第六發(fā)明所述的組合物在制備腫瘤靶向造影劑中的用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為腺癌，更優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結腸癌或肝癌。
換言之，本發(fā)明利用SELEX 技術(Kim Y,Liu C,Tan W(2009)Aptamers generatedby Cell SELEX for biomarker discovery.BiomarkMed 3: 193-202.)篩選到一個和 MUCl蛋白特異性結合的核苷酸適配子(aptamer),并用該核苷酸適配子作為載體直接攜帶細胞毒藥物選擇性的到達MUCl陽性的腫瘤細胞中，因此，只要是MUCl呈陽性的腫瘤細胞均可以被本發(fā)明所述的核苷酸適配子所靶向，由于大多數(shù)的腺癌如乳腺癌、肺癌、結腸癌等均高表達MUCl蛋白，因此，本發(fā)明的核苷酸適配子可以靶向大多數(shù)的腺癌。
S卩，本發(fā)明選取了 MUCl蛋白肽核心中最具有免疫原性的部分，用它篩選到了新的MUCl的核酸適配子，并在體外評估了它攜帶細胞毒藥物的能力。具體來說，本發(fā)明用MUCl的核心抗原肽為靶標篩選到了一個新的核酸適配子MA3，序列如SEQ ID NO:9所示。該篩選出來的適配子具有86個堿基長度，能形成更復雜的二級結構，親和系數(shù)為38nM。
流式細胞分析儀驗證了該適配子和血漿中的白蛋白(BSA)具有很弱的交叉反應，靶標特異性較好。本發(fā)明還挑選了已發(fā)表的MUCl適配子中親和力最高的一個 S2.2 (Ferreira CS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxic aptamers selectively enter and kiIlepithelial cancer cells.Nucleic Acids Res 37:866-876.；Ferreira CSM, Matthews CS, Missailidis S(2006)DNA Aptamers That Bind to MUClTumour Marker:Design and Characterization of MUC1-BindingSingle-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.),將其和MA3在結合BSA方面進行了比較。實驗結果表明，MA3和S2.2和靶標多肽都有比較高的結合力，但是MA3和BSA的結合要明顯弱于S2.2。相對于S2.2,MA3和BSA的交叉反應很弱，能夠選擇性的結合MUCl多肽。
流式細胞分析儀驗證了該適配子和MUCl多肽具有較強的結合力，和MUCl陽性細胞具有較高的結合力而和MUCl陰性細胞具有很弱的結合力。
利用dox能嵌入到雙鏈DNA中的特性，制備了適配子-dox靶向載藥復合體。通過對阿霉素熒光光譜值的測定，確定阿霉素確實能夠嵌入到該適配子中。通過共聚焦顯微鏡和流式細胞分析儀檢測了 Dox和適配子-dox靶向載藥復合體與MUCl陽性和陰性腫瘤細胞的結合力。結果顯示，游離Dox在兩種細胞中的攝入都較高，沒有表現(xiàn)出選擇性，可能是因為游離Dox在不同細胞中的攝入機制是一樣的。相反，適配子-dox復合體在MUCl陽性細胞中的攝入明顯高于在MUC l陰性細胞中的攝入，能夠區(qū)別靶向細胞和非靶向細胞。共聚焦顯微鏡顯示游離dox主要集中在細胞的細胞核內，而適配子-dox則存在于細胞核和細胞質中，這可能是游離dox和適配子-dox復合體被細胞攝入的不同機制造成的，游離的dox是通過細胞膜的擴散進入到細胞內，嵌入到細胞核內雙鏈DNA中，沒有細胞選擇性。而當嵌入到適配子中后，DNA的極性成分阻斷了 dox進入細胞膜。適配子-dox復合體進入細胞很可能是由于適配子和A549細胞表面的MUCl蛋白結合，通過受體介導的內吞作用進入細胞質。由于H印G2細胞缺乏表面的受體蛋白，因而造成復合體不能進入細胞內，Dox在細胞的攝入降低。發(fā)現(xiàn)適配子-dox復合體能夠選擇性的被MUCl陽性腫瘤細胞攝入，而在MUCl陰性細胞H印G2中攝入量明顯減少。MTS試驗也證實了上面的細胞攝入Dox實驗的結果。當然，本發(fā)明選擇dox來進行適配子靶向載藥復合體的實驗僅是出于便于定量和動態(tài)監(jiān)測二者結合及攝入的目的，并非意味著本發(fā)明所述的適配子必須要依靠化療藥物能插入到DNA雙鏈中的特性。與此相反，本發(fā)明所述的適配子可以與化療藥物如抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來曲唑、強的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼進行復合使用，實現(xiàn)特異性靶向MUCl陽性細胞的目的。
細胞增殖實驗結 果表明，對MUCl陽性細胞，載藥復合體引起的細胞毒作用和游離dox相似:然而，對于MUCl陰性細胞，載藥復合體引起的細胞毒作用低于游離dox(p< 0.01)。這些數(shù)據(jù)再一次說明適配子-dox能選擇性地攜帶dox到MUCl陽性的腫瘤細胞。從而降低dox對不表達MUCl蛋白的正常細胞的毒副作用。細胞毒藥物能同時損傷腫瘤細胞和正常細胞，從而引起毒副作用，嚴重限制了化療的效果和應用。由于本發(fā)明的上述實驗說明適配子-dox復合體能夠區(qū)分靶向和非靶向細胞，而且MUCl蛋白在大多數(shù)腺癌表面高表達，因此MA3可以作為靶向分子在對多種惡性腫瘤的靶向治療方面找到潛在的應用價值。
本發(fā)明還研究了上述序列的變體的MUCl蛋白的特異性結合能力，所述變體通過在上述序列的兩端或一段添加部分核苷酸或者改變所述序列中的部分核苷酸而獲得，所述變體保持或基本保持與SEQ IDNO:9相同的二級結構，從而保持了其與MUCl蛋白特異性結合的能力。上述核苷酸序列二級結構的預測方法是本領域技術人員所熟知的，另外本發(fā)明的上述內容中也具體公開了適配子與MUCl蛋白特異性結合的方法，本領域技術人員可以據(jù)此容易地獲得這樣的變體。這樣的變體的例子如下述序列:
5' -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO: 10)，和
5， -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO:11)，它們與MUCl蛋白的結合能力也較強(數(shù)據(jù)略)。
另外，本發(fā)明的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子還可以和腫瘤顯影劑聯(lián)合使用，實現(xiàn)對具體腫瘤的靶向顯影，從而為更精確地確定腫瘤的分期、轉移、定位提供可以視覺化的判斷方式。


圖1:流式細胞分析儀檢測SELEX篩選進程。
圖2:流式細胞分析儀檢測適配子MA3的靶標特異性。(a)適配子和靶標多肽的結合。(b)適配子和BSA的結合。(c) S2.2和靶標多肽的結合。(d) S2.2和BSA的結合。
圖3: (a)適配子MA3和靶標多肽的親和力的檢測。(b)流式細胞分析儀檢測適配子和26-AA多肽的結合，黑色部分是隨機對照。
圖4:流式細胞分析儀檢測適配子MA3和MUCl陽性細胞特異性結合。(a)MUCl+細胞 A549。(b) MUCl+細胞 MCH7。(c)MUCr 細胞 H印G2。(d)MUCr 細胞 L02。
圖5:熒光光譜分析不同摩爾比的適配子MA3和阿霉素的混合后阿霉素熒光光譜值的變化。
從上到下摩爾比依次為:0,0.001,0.003,0.005,0.01,0.03,0.1，I。
圖6:上圖a-d:共聚焦顯微鏡檢測游離阿霉素和適配子-dox復合體在A549細胞和H印G2細胞中的攝入。下圖:流式細胞分析儀測定游離阿霉素(黑線)和適配子-dox復合體(灰線)在A549細胞(e)和H印G2細胞中(f)的攝入。
圖7:MTS法測定適配子MA3、dox和適配子_dox復合體對HepG2細胞的殺傷。
圖8:MTS法測定適配子MA3、dox和適配子_dox復合體對A549細胞的殺傷。
具體實施方式
下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領域技術人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。
實施例
實施例1
一、材料和方法
試劑
單鏈寡核苷酸由Invitrogen公司合成。多肽購買于北京賽百盛公司。牛血清白蛋白購買自天津灝洋生物科技有限公司。單分散磁珠，鏈酶親和素包被磁珠購買自普洛麥格公司。EDC購買自Sigma公司。
細胞系
人肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF7、人肝癌細胞H印G2、人正常肝細胞L02均購自中國醫(yī)學科學院細胞 中心。細胞培養(yǎng)在含有10% FBS、常規(guī)濃度青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中(廠家:北京盈信陽光生物技術有限公司，貨號:07-021，商品名:DMEM高糖培養(yǎng)基)。細胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有試驗所用細胞均是處于對數(shù)生長期的細胞。
靶標和磁珠的連接
用于篩選的靶標為9個氨基酸長度的多肽l(p印tidel)，序列為APDTRPAPG(SEQID NO:1)，其來自MUCl蛋白的高免疫原性的VNTR區(qū)域。多肽用含I % DMSO的雙蒸水溶解。2ug多肽和5\105磁珠混合，在40禮EDC水溶液中室溫反應2h，PBS洗5次，最后重懸于PBS中，于4°C保存。用相同的方法處理BSA以及含有29個氨基酸殘基的GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (SEQ ID NO:2)的多肽 2 (p印tide2)和磁珠的連接。
DNA文庫的構建
起始隨機文庫為含有86個堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫，中間為40個隨機序列，兩邊為固定的引物Pl序列:5’ AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC(N40)CACAGACACACTACACACGCACA3’ (SEQ ID NO:3) ,FITC 修飾的引物 P2 (5，-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’ (SEQ ID NO:4))和生物素修飾的引物P3 (5’-B_TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’ (SEQ ID NO:5))用于PCR擴增雙標記的雙鏈DNA分子(dsDNA)。上述反應產生的dsDNA和鏈霉素包被的磁珠共反應lOmin，PBS洗3遍，然后加入0.1M NaOH變性5min，將FITC標記的ssDNA和生物素標記的ssDNA分開。分離出的帶有FITC的單鏈被分離出來用于流式檢測和下一輪的篩選。
體外篩選過程
200pm隨機ssDNA文庫在Hank’ s溶液中95°C變性5min,冰浴IOmin,為了降低非特異性的結合，在Hank’ s溶液中加入0.lmg/ml鮭精DNA和lmg/ml的BSA，作為結合緩沖液。然后，隨機文庫和2ug靶標多肽在200ul結合緩沖液中于37V反應30min，用結合緩沖液洗3次，以結合了 ssDNA的磁珠為模板，用標記有FITC和生物素的引物擴增dsDNA，擴增條件為:94°C 40s, 65°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10m，25個循環(huán)。雙鏈產物經磁珠分離后得到富集的單鏈文庫，用于下一輪篩選。4輪篩選后，用沒有修飾的引物P4:
5’ -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’ (SEQ ID NO:6)和 P5:
5’ -TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’ (SEQ ID NO:7)擴增 dsDNA，TA 克隆，測序。
流式細胞分析
用流式細胞儀檢測篩選的進程，方法:FITC標記的單鏈文庫和靶標多肽包被的磁珠在含有10% FBS的結合緩沖液中于37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式細胞分析儀檢測，未篩選的隨機文庫作為對照；
為了檢測適配子和靶標的特異性結合，將FITC標記的適配子在200ul結合緩沖液中分別和BSA或29-AA的多肽包被的磁珠于37°C反應30min，PBS洗兩遍，用流式細胞儀分析；
為了檢測適配子和細胞的結合，分別刮取5X IO5的A549、MCF7、！fepG2和L02細胞，將其和FITC標記的適配子在200ul結合緩沖液中于37°C反應30min，PBS洗兩遍，用流式細胞儀分析
Kd值的測定:靶標多肽包被的磁珠和FITC標記的不同濃度的適配子在200ul結合緩沖液中于37°C反應30min，PBS洗兩遍，流式細胞儀檢測平均熒光強度，未篩選的隨機文庫作為陰性對照用于非特異性的結合，適配子和靶標結合的平均熒光強度減去隨機文庫非特異性結合的平均熒光強度，根據(jù)公式Y = B max X/(Kd+X) (Y:平均熒光強度，X:所用的aptamer的濃度，B是一個常數(shù)，max是最大值的意思)計算適配子和祀標結合的Kd值。
熒光光譜分析阿霉素嵌入到適配子中
適配子預先于95°C孵育5min,冰浴IOmin,取不同量的適配子和3nm阿霉素混勻，適配子和阿霉素的摩爾比例依次為:0.001,0.003,0.005,0.01,0.03,0.1和I。在黑色96孔板中靜置lh，測量阿霉素的熒光光譜值。Dox的激發(fā)光譜為480nm。發(fā)射光譜為520_700nm。
細胞攝入實驗
共聚焦顯微鏡檢測:制備A549和HepG2的細胞爬片，1.5uM dox和適配子-dox (適配子和阿霉素的復合體)分別和兩種細胞于37°C反應2h，用PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定lOmin, PBS洗3遍，封片，熒光共聚焦顯微鏡檢測。
流式細胞儀檢測:刮取A549和H印G細胞，PBS洗兩遍，1.5uM dox和適配子_dox分別和兩種細胞于37°C反應4h，PBS洗兩遍，流式儀檢測。
細胞增殖實驗
3uM適配子、dox和適配子-dox分別和A549和H印G2細胞于37°C孵育4h，PBS洗兩遍，MTS法檢測細胞的增殖。
二、結果
1、適配子的篩選和特點
DMUCl蛋白的細胞外肽骨架由空間結構穩(wěn)定一致的可變數(shù)目的重復序列組成，基本的重復序列含有20個氨基酸(TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS(SEQ ID NO:8)。其中，肽段APDTRPAPG(SEQ ID NO:1)是重復序列中暴露在外的最具有免疫原性的部分，在以往的研究中，被作為祀標用于MUCl的適配子的篩選(Ferreira CSM, Matthews CS, MissailidisS(2006)DNA Aptamers ThatBind to MUCl Tumour Marker:Design and Characterizationof MUCl-Binding Single-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.)。在本研究中，也選了這段多肽作為靶標來篩選MUCl蛋白的適配子。在篩選過程中，將多肽在EDC的作用下共價連接到UF磁珠(天津倍思樂色譜技術開發(fā)中心，目錄號:3392)表面，任何與熒光標記的ssDNA文庫孵育，每輪篩選后，用流式細胞分析儀檢測篩選文庫的富集情況。4輪篩選后，和隨機文庫相比，所篩文庫和靶標多肽結合的熒光強度有了顯著的提高(圖1)，說明所篩文庫中富集到了一些和靶標多肽結合的適配子。將所篩文庫的DNA進行克隆，測序，進一步檢測每個克隆和多肽的結合情況，從50個克隆中篩選出了一個和多肽結合最強的適配子(MA3)，其 DNA —級序列為 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3’ (SEQ ID NO:9)。另外，本發(fā)明還研究了上述序列的變體的MUC l蛋白的特異性結合能力，所述變體通過在上述序列的兩端或一段添加部分核苷酸或者改變所述序列中的部分核苷酸而獲得，所述變體保持或基本保持與SEQID NO:9相同的二級結構，從而保持了其與MUCl蛋白特異性結合的能力。上述核苷酸序列二級結構的預測方法是本領域技術人員所熟知的，另外本發(fā)明的上述內容中也具體公開了適配子與MUCl蛋白特異性結合的方法，本領域技術人員可以據(jù)此容易地獲得這樣的變體。這樣的變體的例子如下述序列:
5' -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO: 10)，和
5， -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO:11)，它們與MUCl蛋白的結合能力也較強(數(shù)據(jù)略)。
2)特異性是評價適配子的一個重要指標，為了驗證篩選出來的適配子是否具備一定的靶標特異性，檢測了其與其他蛋白的結合情況。因為白蛋白是血液中含量最豐富的蛋白，因此檢測了適配子與牛血清白蛋白(BSA)的結合。BSA共價連接到UF磁珠表面，和標記有FITC的適配子反應，流式細胞儀檢測結合情況。隨機庫DNA (合成的隨機模板鏈)作為隨機對照。流式結果顯示，MA3和BSA反應后的熒光強度和隨機對照一致(圖2b)，而MA3和靶標多肽反應后的熒光強度顯著高于隨機對照(圖2a)，說明MA3和BSA有很弱的交叉反應。同時也用相同的方法將MA3和S2.2在這一方面做了比較，S2.2是文獻報道的MUCl核酸適配子中親和力最高的一個(Ferreira CSM, Matthews CS, MissailidisS (2006)DNA Aptamers That Bind to MUCl Tumour Marker:Design and Characterizationof MUCl-Binding Single-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.FerreiraCS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxic aptamersselectiveIyenter and kill epithelial cancer celIs.Nucleic Acids Res 37:866-876.)。結果顯示，S2.2在結合靶標多肽的同時，也和BSA具有一定的結合(圖2c和圖2d)，說明MA3和BSA的交叉反應弱于S2.2。
3)MA3顯示了比較好的靶標特異性，然后用流式細胞儀測定了它和靶標多肽結合的親和力。不同濃度的FITC標記的MA3和靶標多肽包被的磁珠孵育，流式細胞儀檢測平均熒光強度，用非線性回歸分析測得MA3和靶標多肽的Kd值為38.3±0.6nM(圖3a)。
4)為了進一步驗證適配子和MUCl結構結合的可能性，合成了含有整個基本重復序列序列的由29個氨基酸組成的多肽(GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (SEQ ID NO:2))。將多肽連接到磁珠表面，和標記有FITC的適配子反應，隨機庫DNA作為隨機對照，流式結果顯示適配子和29肽反應后的熒光強度仍然顯著高于隨機對照(圖3b)，這表明以9肽為靶標所篩選到的適配子和含有整個基本重復序列的多肽也有較高的結合。因為MUCl蛋白的細胞外結構由不同數(shù)目的基本重復序列組成，因此所篩的適配子和MUCl陽性細胞表面的MUCl結構的結合可能性較大。
5)為了評估MA3能否和表達MUCl的腫瘤細胞結合，選取高表達MUCl的腫瘤細胞系MCF7和A549以及不表達MUCl的腫瘤細胞系H印G2和正常肝上皮細胞系L02，分別和標記有FITC的MA3孵育，流式細胞儀檢測細胞熒光強度的變化。隨機庫DNA作為隨機對照。結果顯示，MA3和MCF7、A549細胞孵育后的熒光強度明顯高于隨機對照(圖4a和圖4b)，而和H印G2、L02細胞反應后的熒光強度和隨機對照一致(圖4c圖4d)。上述實驗結果表明MA3和MUCl陽性的腫瘤細胞結合強，和MUCl陰性細胞結合弱，MA3能夠識別表達MUCl蛋白的腫瘤細胞表面的MUCl結構。
2、阿霉素(dox)是很重要的一種治療腫瘤的化療藥物，為了驗證篩選出來的適配子能夠選擇性的攜帶藥物到達腫瘤細胞，我們制備了不同配比濃度的適配子-dox復合體(Bagalkot V, Farokhzad 0C, Langer R, Jon S (2006)An aptamer-doxorubicin physicalconjugate as a novel targeted drug-delivery platform.Angew Chem Int Ed Engl 45:8149-8152.)，熒光光譜分析表明阿霉素嵌入到適配子中(圖5)。單純的dox是通過細胞膜的被動擴散進入細胞內，不能區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞，毒副作用比較大。由于適配子能夠和表達MUCl陽性的腫瘤細胞特異性結合，適配子-dox載藥復合體應該也有可能被表達MUCl的腫瘤細胞特異性的攝取。為了驗證上述假設，通過共聚焦顯微鏡檢測了適配子-dox在MUCl陽性和陰性腫瘤細胞中的攝入。設立Dox和適配子-dox組，分別和MUCl陽性的A549以及MUCl陰性的!fepG2細胞孵育，共聚焦顯微鏡觀察細胞內dox的含量。結果顯示，游離dox在兩種細胞內都有強的熒光，含量都很高，對兩種細胞的攝入沒有選擇性(圖6a和圖6b)。與此相反，適配子-dox組中，A549細胞中熒光強度明顯強于IfepG2細胞(圖6c和圖6d)。這表明適配子-dox在HepG2細胞中的攝入明顯低于游離dox。上述實驗結果表明，適配子-dox在MUCl陽性的腫瘤細胞中的攝入多，在MUCl陰 性的腫瘤細胞中的攝入少，適配子-dox能夠被MUCl陽性的腫瘤細胞選擇性地攝取。
為了更進一步證明適配子-Dox是否被MUCl陽性的腫瘤細胞選擇性地攝取，將游離Dox和適配子-dox復合體分別和A549、HepG2孵育，用流式細胞儀檢測其熒光強度的變化，流式結果顯示:對于MUCl陽性細胞A549，游離Dox組和適配子-dox復合體組的熒光強度一致，沒有變化(圖6e)。而對于MUCl陰性細胞H印G2，適配子-dox組的熒光強度明顯低于游離Dox (圖6f)。上述實驗再次說明了適配子-dox在MUCl陽性的腫瘤細胞中的攝入多，在MUCl陰性細胞中的攝入少，能夠被MUCl陽性的腫瘤細胞選擇性地攝取?？偟膩碚f，共聚焦顯微鏡試驗和流式細胞儀試驗說明MA3可以作為一個載體工具靶向性地攜帶Dox到MUCl陽性的腫瘤細胞。
4)因為適配子-Dox被MUCl陰性細胞選擇性的攝取減弱，因此有可能造成對MUCl陰性細胞的毒性作用減弱。為了驗證上述假設，設立適配子組、Dox組和適配子-dox組，分別與A549細胞、！fepG2細胞孵育，MTS法檢測細胞的增殖情況。對于MUCl陰性的H印G2細胞，dox組細胞的存活率為68.71%，而適配子-dox組細胞存活率為83.28%，顯示適配子-dox對H印G2細胞的殺傷顯著低于游離Dox (P < 0.01)(圖7)。然而，對于MUCl陽性的A549細胞，Dox組中細胞的存活率為78.09%，適配子_dox組中的存活率為72.68%，顯示適配子-dox對MUCl陽性的A549細胞的殺傷作用和游離的dox沒有顯著差別(圖8)。上述實驗結果表明適配子-dox能夠減弱Dox對MUCl陰性細胞的毒性，而對MUCl陽性細胞的殺傷作用沒有變化。另外，單純適配子組中，A549細胞和HepG2細胞的存活率都接近100%，顯示適配子對兩種細胞沒有毒性。
申請人也做了 MA3和其他主要類型的化療藥物結合形成復合體及驗證該復合體生物活性的實驗，其實驗流程與上述實施例1中的流程相似，結果表明主要的化療藥物類型，如抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來曲唑、強的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼均可以有效地與本發(fā)明的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子結合成為復合體，實現(xiàn)靶向抗腫瘤的效果。
雖然本發(fā)明在上 述具體實施方案中示例性地列出了實施本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，本領域技術人員公知，本領域技術人員可以在不背離本發(fā)明的精神的情況下，對本發(fā)明做出大量的修改、修飾。這樣的修改和修飾也落在本發(fā)明的范圍之內。例如，本發(fā)明的適配子可以和非化療藥物類型的物質結合形成復合體，并進而用于特定展示或成像MUCl蛋白陽性的腫瘤細胞及其定位、代謝。本發(fā)明的適配子在與化療藥物或非化療藥物組合使用時，既可以處于結合的狀態(tài)，也可以處于簡單混合(非結合)的狀態(tài)。同時，本領域技術人員公知，雖然本發(fā)明僅列出了 MUCl蛋白特異性核酸適配子的具體序列，但該序列的部分堿基可以被去除、替換或者額外的部分堿基(如1-10個，加于一端或兩端)被加到該序列而仍然保持其與MUCl蛋白的特異性結合能力，這樣的序列也包括在本發(fā)明的范圍之內。同時，本發(fā)明的適配子和/或適配子-化療藥物復合體可以與其他的適配子和/或適配子-化療藥物聯(lián)合使用，從而達到同時治療多種腫瘤的目的。
權利要求
1.一種MUCl蛋白特異性結合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO:9所示，以及其保持與MUCl蛋白特異性結合能力的長度介于70-110、優(yōu)選75-100、更優(yōu)選80-90、最優(yōu)選86個核苷酸的變體，優(yōu)選地，所述變體具有如SEQ ID N0:10或SEQ ID ΝΟ:11所示的序列。
2.一種復合體，其由如權利要求1所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物結合而成或被共同包在納米粒中，優(yōu)選地，MUCl蛋白特異性結合核酸適配子的序列如SEQID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11所示，且其中MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物的摩爾比例的范圍為0.001 I，優(yōu)選地，0.003 0.1，更優(yōu)選地，0.005 0.03。
3.根據(jù)權利要求2所述的復合體，其特征在于所述化療藥物選自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌，優(yōu)選地，所述化療藥物為阿霉素。
4.一種組合物，其活性成分為根據(jù)權利要求2或3所述的復合體。
5.根據(jù)權利要求1所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子作為化療藥物靶向載體的用途，優(yōu)選地，所述化療藥物選自抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來曲唑、強的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼，更優(yōu)選地，所述化療藥物選自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、順鉬、吉西他濱、雷替曲塞、絲裂霉素、博萊霉素、長春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿、卡鉬、他莫昔芬、來曲唑、強的松、吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼。
6.根據(jù)權利要求5所述的用途，其特征在于所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物組成復合體或者被共同包在納米粒中。
7.根據(jù)權利要求2或3所述的復合體或根據(jù)權利要求4所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中所述腫瘤為腺癌，優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結腸癌或肝癌。
8.根據(jù)權利要求7所述的用途，其特征在于所述抗腫瘤藥物的劑型為口服劑、肌肉注射劑或靜脈注射劑。
9.一種根據(jù)權利要求1所述的MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和腫瘤顯影劑的組合物，優(yōu)選地，所述MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和腫瘤顯影劑形成復合體，優(yōu)選地，所述顯影劑是鐵磁性納米粒或包裹了顯影劑的納米粒，優(yōu)選地，所述組合物中含有一種或多種MUCl蛋白特異性結合核酸適配子和/或腫瘤顯影劑。
10.一種根據(jù)權利要求9所述的組合物在制備腫瘤靶向造影劑中的用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為腺癌，更優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結腸癌或肝癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及MUC1蛋白核酸適配子、復合體、組合物及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種MUC1蛋白特異性結合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO9所示。本發(fā)明還涉及由所述的MUC1蛋白特異性結合核酸適配子和化療藥物結合而成或被共同包在納米粒中而形成的復合體、包含所述復合體的組合物及所述核酸適配子、復合體和組合物的抗腫瘤用途及腫瘤靶向造影用途。
文檔編號C12N15/115GK103160513SQ201110425169
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權日2011年12月16日
發(fā)明者楊先達, 胡燕 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所