專利名稱：制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種用于快速制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
腺病毒的載體在基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，是目前基因治療中最常用的病毒載體之一。腺病毒的衣殼蛋白主要有三種，分別為Hexon，Penton kise和fiber。腺病毒侵染細胞的過程如下首先，腺病毒的衣殼蛋白Fiber中Knob結(jié)構(gòu)域與靶細胞表面的特異性的CAR受體結(jié)合，完成腺病毒對靶細胞的黏附過程；然后，腺病毒五鄰體蛋白Penton base的R⑶肽段與靶細胞表面ανβ3或α νβ 5整合素結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將病毒內(nèi)化至細胞后，病毒基因轉(zhuǎn)運至細胞核，進而進行病毒基因的轉(zhuǎn)錄和表達。六聯(lián)體蛋白(Hexon)是腺病毒衣殼蛋白中最為豐富的蛋白，其結(jié)構(gòu)暴露于腺病毒表面，是宿主免疫原性的主要靶點。腺病毒在腫瘤基因治療中有著廣泛的應(yīng)用，但是大多數(shù)腫瘤組織細胞表面CAR表達水平低、甚至不表達， 這嚴(yán)重影響了上述兩個步驟的進行，使腺病毒對靶細胞的感染效率大大降低。六聯(lián)體蛋白修飾后的腺病毒的載體，可以解決對靶細胞感染效率低的問題，但目前，已有的載體沒有能夠用于連接小肽的合適的酶切位點，沒有用于篩選的報告基因，并且構(gòu)建六聯(lián)體蛋白修飾后的腺病毒的載體的方法比較復(fù)雜，比如通過同源重組的方法進行修飾，這些構(gòu)建方法制備周期長，體外連接小肽的效率低，成本高，篩選陽性克隆的手段條件繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的ー個技術(shù)問題在于克服目前制備六聯(lián)體蛋白修飾后的腺病毒的載體的方法的缺點，提供一種制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體。本發(fā)明所要解決的另ー個技術(shù)問題在于提供一種簡單、快速的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建方法。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是在El區(qū)攜帯報告基因表達元件，將該表達元件插入Ad5腺病毒基因組352bp與33^bp之間；在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處分別引入兩個單一的酶切位點， 在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入一個用于篩選的表達元件；在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入小肽序列。本發(fā)明的攜帯的報告基因是綠色熒光蛋白、半乳糖苷酶基因、熒光素酶、紅色熒光蛋白中的任意ー種。本發(fā)明的在腺病毒六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5分別引入兩個單一的酶切位點是 BamHI、SfuI、SwaI 中任意兩種。本發(fā)明的在Ad5載體的兩個單一酶切位點之間插入ー個用于篩選的表達元件是用于藍白斑篩選的半乳糖苷酶基因表達元件，在細菌中表達的用于篩選的熒光蛋白表達元件、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素篩選基因中的任意ー種。本發(fā)明的在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入小肽序列是Tat PTD、 RGD、SIKVAV、NGR、RVG16、RVG29 中的任意ー種。上述的Tat PTD 的序列為GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCACAAGG, RGD 的序列為GATCTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCGG，SIKVAV 的序列為GATCTTGTGACTGCAGTATTAAAGTTGCAGTCTGTTTCTGCGG，NGR 的序列為 GATCTTGTGACTGCAACGGACGCTGTTTCTGCGG，RVG 16 的序列為GATCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACGG,RVG29 的序列為GATCTTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGTT。上述的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建方法由下述步驟組成1、構(gòu)建在El區(qū)攜帯報告基因表達框的腺病毒質(zhì)粒載體用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得報告基因，將該片段克隆到腺病毒El穿梭載體(載體為 NCBI 基因庫里已知的核酸序列，http //www, ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AF334399. 1) 中，獲得的陽性質(zhì)粒載體命名為pAd5CMV-R印orter-SV40pA-shuttle，將kal線性化的載體pAd5CMV-R印orter-SV40 pA-shuttle與ClaI線性化的載體pTG3602 (載體為已知的核酸序列，http://openwetware.org/wiki/PTG3602)共轉(zhuǎn)化 BJ5183 (購買自 Stratagene 公司)，堿裂解法提取質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序后獲得的腺病毒質(zhì)粒載體即為在El區(qū)攜帯 CMV-R印orter-SV40pA表達框的腺病毒質(zhì)粒載體，命名為pAd5CMV_R印orter。(2)構(gòu)建引入單ー酶切位點1的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游SOObp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入單ー酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列的上游SOObp的DNA片段，設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段；將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為引入單ー酶切位點1的腺病毒六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5序列上游800bp同源臂的質(zhì)粒載體，命名為pGEMT/Hexon HR up-single enzymel。(3)構(gòu)建引入單ー酶切位點2的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入單ー酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp的同源臂序列，設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段，將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒 DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，陽性克隆為引入單ー酶切位點2的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體，命名為pGEMT/Hexon HR down-single enzyme2。(4)構(gòu)建腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帯篩選基因的穿梭載體
將合成的帶有EcoRl-Xbal-BamHl-SfuI-ClaI-HindIII 酶切位點的 DNA 序列，其 DNA序列如下AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA連入經(jīng)EcoRI 和 HindIII 雙酶切的 pUC19 質(zhì)粒載體(購買自NEB公司)，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為PUC19EHL。將Hexon HR up 片段從 pGEMT/Hexon HR up-single enzymel 載體上經(jīng) XbaI 和單一酶切位點1對應(yīng)的內(nèi)切酶雙酶切下來，經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳回收后連入經(jīng)相同酶雙酶切的pUC19EHL中，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為 psnuttle-Hexon-up HR,將Hexon HR down片段從pGEMT/Hexon HR down-singleenzyme2 載體上經(jīng)BamHI和ClaI雙酶切下來，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后連入經(jīng)相同酶雙酶切的 pshuttle-Hexon-up HR載體中，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Hexon-up-down HR ；將經(jīng)過單ー酶切位點1和2所對應(yīng)的內(nèi)切酶雙酶切的篩選表達元件連入經(jīng)過相同酶雙酶切的pshuttle-Hexon-up-down HR載體，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆為腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帯篩選基因的芽梭咸體，命名為 pshuttle-Hexon-screening gene。(5)構(gòu)建六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體將pshuttle-Hexon-screening gene 經(jīng) XbaI 和 ClaI 雙酶切，經(jīng) 1 %瓊脂糖凝膠電泳回收Hexon-screening gene片段后與經(jīng)BamHI線性化的pAd5CMV_R印orter共轉(zhuǎn)化 BJ5183感受態(tài)細胞，培養(yǎng)、篩選，經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆為六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，命名為pRGHMAd5。(6)六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建及病毒制備將合成的小肽的寡核苷酸退火后與經(jīng)單ー酶切位點1和2酶切處理后的pRGFMAd5 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩選，經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽修飾的腺病毒的載體，命名為pRGFMAd5-小肽，將pRGFMAd5-小肽載體經(jīng) PacI線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞，7_10天后獲得病毒原液，經(jīng)過擴増，通過CsCl梯度離心純化后獲得六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽遺傳修飾的腺病毒，命名為Ad5-Hexon-Smal 1-p印tide。采用本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體進行了感染A172細胞和CH0-K1細胞實驗，實驗結(jié)果表明，六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體可用于感染A172細胞和CH0-K1細胞，并明顯提高對這兩種細胞的感染效率。本發(fā)明構(gòu)建方法，能夠高效，快速的構(gòu)建外源小肽修飾六聯(lián)體蛋白的腺病毒的載體并且可以快速獲得完全修飾的病毒顆粒。


圖1是pUC19EHL載體結(jié)構(gòu)圖。圖 2 是 pshuttle-Hexo-up-down HR 載體結(jié)構(gòu)圖。圖 3 是 pshuttle-Hexon-LacZ 載體結(jié)構(gòu)圖。圖4是pRGFMAd5載體結(jié)構(gòu)圖。圖 5 是 pRGFMAd5_Tat PTD 載體結(jié)構(gòu)圖。圖6是pRGFMAd5_RGD載體結(jié)構(gòu)圖。圖7是實施例1構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體感染A172細胞的熒光照片。圖8是實施例1構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體感染 CHO-Kl細胞的熒光照片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例來對本發(fā)明做進ー步詳細說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。實施例1本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在El區(qū)攜帯綠色熒光蛋白(eGFP)報告基因，在腺病毒基因組352bp與33^bp之間插入CMV-eGFP-SV40pA表達元件，該表達元件序列如下AGCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATGGTACCGTTTAAACTCGAGGTCGACGGTATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGC。在Ad5腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處即六聯(lián)體蛋白高可變區(qū) 5 (HVR5)處，引入兩個單一的酶切位點BamHI及Sful。
在載體的BamHI與SfuI酶切位點之間插入ー個用于藍白斑篩選的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)表達元件，所插入的表達元件序列如下ATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTC ACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入Tat PTD序列，所插的Tat PTD序列如下GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCACAAGG上述的制備經(jīng)六聯(lián)體蛋白遺傳修飾的腺病毒的載體構(gòu)建方法步驟如下1、構(gòu)建在El區(qū)攜帶CMV-eGFP_SV40pA表達框的腺病毒質(zhì)粒載體用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得綠色熒光蛋白基因(eGFP)，將該基因克隆到腺病毒El穿梭載體中，獲得的陽性質(zhì)粒載體命名為pAd5CMV-eGFP-SV40pA-shuttle。將kal線性化的載體pAd5CMV-eGFP-SV40pA-shuttle與ClaI線性化的載體pTG3602共轉(zhuǎn)化BJ5183，經(jīng)酶切及測序后獲得的腺病毒質(zhì)粒載體即為在El區(qū)攜帯CMV-eGFP-SV40pA表達框的腺病毒質(zhì)粒載體,命名為pAd5CMV-eGFP。2、構(gòu)建引入BamHI酶切位點的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游SOObp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入BamHI酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游SOObp的DNA片段。設(shè)計引物的序列如下Pl:ATCTAGAATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGP2 :AGGATCCTGAGAAAAATTGCATTTCCACTTGA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 50秒，30個循環(huán)。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5 μ 1，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4μ 1，2XT4DNA快速連接酶緩沖液5μ 1J4 DNA快速連接酶0. 5 μ 1， 25°C反應(yīng)1個小時后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB 平板中。挑取菌落接種到含有100yg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后， 經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆。將所獲得陽性克隆為引入BamHI酶切位點的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游SOObp同源臂的質(zhì)粒載體，命名為 pGEMT/Hexon HR up-BamHI。3.構(gòu)建引入SfuI酶切位點的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入SfuI酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp的同源臂序列。設(shè)計引物的序列如下P3 :AGGATCCATATTCGAACCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAP4 :TATCGATGAAACATGCAGCAGAATAGTCCACAG聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分鐘20秒，30個循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體 0. 5μ 1，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4μ 1，2XT4DNA快速連接酶緩沖液5μ 1，T4DNA快速連接酶0. 5 μ 1，25°C反應(yīng)1個小時后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16 小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pGEMT/Hexon HR down-1。以pGEMT/Hexon HR down-1為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定點突變六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5下游同源臂序列中的BamHI位點。此對引物的序列如下P5 :AGACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATGGACGAGCCCAP6 :TGGGCTCGTCCATGGGATCGACCTCAAAAGTCATGTCT突變下游同源臂序列中的BamHI位點的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒， 980C 10秒55°C 5秒72°C 5分鐘20秒，30個循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與PGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5μ 1，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4μ 1，2XT4 DNA 快速連接酶緩沖液5μ 1，T4 DNA快速連接酶0. 5 μ 1，25°C反應(yīng)1個小時后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為引入SfuI酶切位點的腺病毒六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5序列的下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體，命名為pGEMT/Hexon HR down-Sful。4.構(gòu)建腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帯半乳糖苷酶篩選基因的穿梭載體將合成的帶有EcoRl-Xbal-BamHl-SfuI-ClaI-HindIII 酶切位點的 DNA 序列，其 DNA序列如下AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA連入經(jīng)EcoRI 和 HindIII 雙酶切的 pUC19 質(zhì)粒載體。連接條件是2μ1合成DNA片段，1μ110ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5μ1 pUC19載體，0. 5μ1 Τ4連接酶，6μ1三蒸水，16°C連接15小吋，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml 的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為PUC19EHL。載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。將Hexon HR up 片段從 pGEMT/Hexon HR up-BamHI 載體上經(jīng) XbaI 和 BamHI 雙酶切下來，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收后連入同樣經(jīng))(bal和BamH μ酶切過的pUC19EHL中。 連接條件是4 μ 1酶切純化片段，5μ 1 2ΧΤ4 DNA連接酶緩沖液，0. 5 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1 T4DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為 pshutt丄e-Hexon-up HR0將Hexon HR down 片段從 pGEMT/Hexon HR down-Sful 載體上經(jīng) BamHI 和 ClaI雙酶切下來，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后連入同樣經(jīng)BamHI和ClaI雙酶切的 pshuttle-Hexon-upHR載體中。連接條件是4 μ 1酶切純化片段，5 μ 1 2XT4DNA連接酶緩沖液，0. 5μ 1酶切載體，0. 5μ 1 T4DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒 DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Hexon-up-down HR，該載體的結(jié)構(gòu)如圖2所小。將兩端酶切位點為BamHI和SfuI位點的β -半乳糖苷酶基因表達元件連入經(jīng)過 BamHI和SfuI雙酶切的pshuttle-Hexon_up-down HR載體，連接條件是4μ 1酶切純化片段，5μ1 2ズ1~40嫩連接酶緩沖液，0.5111酶切載體，0.5111 T4DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆為腺病毒六聯(lián)體蛋白遺傳修飾部位攜帯β -半乳糖苷酶篩選基因的穿梭載體，命名為pshuttle-Hexon-LacZ，該載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示。5、六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建將pshuttle-Hexon-LacZ經(jīng))(bal和ClaI雙酶切，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收 pshuttle-Hexon-LacZ后與經(jīng)BamHI線性化的pAd5CMV_eGFP共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板并加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal進行藍白斑篩選。經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆為六聯(lián)體蛋白遺傳修飾的腺病毒的載體，命名為pRGHMAd5，該腺病毒的載體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。6、六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建及病毒制備將合成的Tat PTD寡核苷酸退火后與經(jīng)BamHI及SfuI酶切處理后的pRGFMAd5連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1μ 1 10ΧΤ4連接酶緩沖液，2μ 1 pRGFMAd5載體， 0. 5 μ 1Τ4連接酶，4. 5μ 1三蒸水，16°C連接16小吋，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細胞， 并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素并加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過藍白篩選、酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為pRGFMAd5-Tat PTD0 該載體的結(jié)構(gòu)如圖5所示。將pRGFMAd5-Tat PTD載體經(jīng)I3acI線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞， 7-10天后獲得病毒原液，經(jīng)過擴增后，通過CsCl梯度純化后獲得六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體，命名為Ad5-Hexon-Tat PTD0實施例2本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下實施例1中在El區(qū)攜帯的綠色熒光蛋白報告基因，即在腺病毒基因組352bp與 33^bp之間插入CMV-eGFP-SV40pA表達元件中的綠色熒光蛋白報告基因用β -半乳糖苷酶基因替換。元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例3本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下實施例1中在El區(qū)攜帯綠色熒光蛋白報告基因，即在腺病毒基因組352bp與 3326bp之間插入CMV-eGFP-SV40pA表達元件中的綠色熒光蛋白報告基因用熒光素酶替換。 元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例4本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下
實施例1中在El區(qū)攜帯綠色熒光蛋白報告基因，即在腺病毒基因組352bp與 3326bp之間插入CMV-eGFP-SV40pA表達元件中的綠色熒光蛋白報告基因用紅色熒光蛋白替換。元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例5本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 4中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處引入兩個單一的酶切位點為BamHI和Swal，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例6本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 4中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處引入兩個單一的酶切位點為SfuI和Swal，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例7本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 6中，在載體的第19646bp處和第19685bp處兩個單ー的酶切位點酶切位點之間插入ー個在細菌中表達的用于篩選的熒光蛋白表達元件，所插入的表達元件序列如下ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。 其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)TatPTD遺傳修飾的腺病毒的載體。 實施例8
本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 6中，在載體的第19646bp處和第19685bp處兩個單ー的酶切位點酶切位點之間插入ー個在細菌中表達的用于篩選的卡那霉素表達元件，也可以是氨芐青霉素、氯霉素篩選基因中的任意一種，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例9本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)RGD遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 8中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5即在Ad5腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處的兩個單ー酶切位點之間最終插入的小肽為R⑶， 元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)RGD遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例10本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)SIKVAV遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 8中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處的兩個單ー酶切位點之間最終插入的小肽為 SIKVAV，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)SIKVAV遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例11本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)NGR遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 8中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處的兩個單ー酶切位點之間最終插入的小肽為 NGR，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)NGR遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例12本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)RVG16遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 8中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處的兩個單ー酶切位點之間最終插入的小肽為 RVG16，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)RVG16遺傳修飾的腺病毒的載體。實施例13本實施例制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)RVG^遺傳修飾的腺病毒的載體如下在以上的實施例1 8中，在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5 腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處的兩個單ー酶切位點之間最終插入的小肽為 RVG29，元件的其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同，構(gòu)建成六聯(lián)體蛋白經(jīng)RVG^遺傳修飾的腺病毒的載體。
為了驗證采用本發(fā)明構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體的有益效果， 發(fā)明人采用本發(fā)明實施例1構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體進行實驗，實驗情況如下1、六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體感染A172細胞接種A172細胞于對孔板，每孔IxlO5個細胞，將Ad5-Hexon_Tat PTD腺病毒的載體和對照腺病毒的載體Ad-eGFP分別感染A172細胞，腺病毒的載體感染濃度均為ΙΟΟΟνρ/ cell，實驗結(jié)果見圖7，在圖7中，左側(cè)照片為腺病毒的載體Ad-eGFP感染A172細胞的熒光照片，右側(cè)照片為腺病毒的載體Ad5-HeX0n-Tat PTD感染A172細胞的熒光照片。由圖 7可見，左邊熒光細胞數(shù)少，說明對照腺病毒的載體Ad5-eGFP對A172細胞系的感染效率低，右邊照片與左邊照片相比，熒光細胞數(shù)增多，說明當(dāng)六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾后， Ad5-Hexon-Tat PTD腺病毒的載體對A172細胞的感染效率顯著提高。2、六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體感染CHO-Kl細胞接種CHO-Kl細胞于對孔板，每孔IxlO5個細胞，將Ad5-Hexon_Tat PTD腺病毒的載體和對照腺病毒的載體Ad-eGFP分別感染CHO-Kl細胞，腺病毒的載體感染濃度均為 ΙΟΟΟνρ/celL·實驗結(jié)果見圖8，在圖8中，左側(cè)照片為腺病毒的載體Ad-eGFP感染CH0-K1 細胞的熒光照片，右側(cè)照片為腺病毒的載體Ad5-HeX0n-Tat PTD感染CH0-K1細胞的熒光照片。由圖8可見，左邊熒光細胞數(shù)少，說明對照腺病毒的載體Ad5-eGFP對CH0-K1細胞系的感染效率低，右邊照片與左邊照片相比，熒光細胞數(shù)增多，說明當(dāng)六聯(lián)體蛋白經(jīng)TatPTD遺傳修飾后，Ad5-Hexon-Tat PTD腺病毒的載體對CH0-K1細胞的感染效率顯著提高。上述實驗1和2說明，構(gòu)建的六聯(lián)體蛋白經(jīng)Tat PTD遺傳修飾的腺病毒的載體可用于感染A172細胞和CH0-K1細胞，并明顯提高對這兩種細胞的感染效率。
權(quán)利要求
1.一種制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，其特征在于在El區(qū)攜帯報告基因表達元件，將該表達元件插入Ad5腺病毒基因組352bp與33^bp之間；在Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5即在Ad5腺病毒基因組第19646bp處和第19685bp處引入兩個單ー的酶切位點，在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入一個用于篩選的表達元件；在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入小肽序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，其特征在于 所說的攜帯的報告基因是綠色熒光蛋白、半乳糖苷酶基因、熒光素酶、紅色熒光蛋白中的任意ー種。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，其特征在于 所說的在腺病毒六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5分別引入兩個單一的酶切位點是是BamHI、SfuI、 SwaI中任意兩種。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，其特征在于 在Ad5載體的兩個單一酶切位點之間插入ー個用于篩選的表達元件是用于藍白斑篩選的 β-半乳糖苷酶基因表達元件，在細菌中表達的用于篩選的熒光蛋白表達元件、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素篩選基因中的任意ー種。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，其特征在于 所說的在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入的小肽序列是Tat PTD、RGD、SIKVAV、 NGR.RVG16.RVG29 中的任意ー種；上述的 Tat PTD 的序列為GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCACAAGG, RGD 的序列為GATCTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCGG，SIKVAV 的序列為GATCTTGTGACTGCAGTATTAAAGTTGCAGTCTGTTTCTGCGG，NGR 的序列為 GATCTTGTGACTGCAACGGACGCTGTTTCTGCGG，RVG 16 的序列為GATCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACGG,RVG29 的序列為GATCTTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGTT。
6.一種權(quán)利要求1制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建方法，其特征在于它是由下述步驟組成(1)構(gòu)建在El區(qū)攜帯報告基因表達框的腺病毒質(zhì)粒載體用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得報告基因，將該片段克隆到腺病毒El穿梭載體中，獲得的陽性質(zhì)粒載體命名為pAd5CMV-R印orter-SV40pA-shuttle，將ScaI線性化的載體 pAd5CMV-Reporter-SV40pA-shuttle 與 ClaI 線性化的載體 pTG3602 共轉(zhuǎn)化 BJ5183,經(jīng)酶切及測序后獲得的腺病毒質(zhì)粒載體即為在El區(qū)攜帯CMV-R印orter-SV40pA表達框的腺病毒質(zhì)粒載體，命名為pAd5CMV-R印orter ；(2)構(gòu)建引入單ー酶切位點1的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游SOObp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入單ー酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列的上游SOObp的DNA片段，設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段；將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為引入單ー酶切位點1的腺病毒六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5序列上游 800bp 同源臂的質(zhì)粒載體，命名為 pGEMT/Hexon HR up-single enzyme 1 ；(3)構(gòu)建引入單ー酶切位點2的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體以腺病毒基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增獲得引入單ー酶切位點的六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp的同源臂序列，設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段， 將回收的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA， 通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，陽性克隆為引入單ー酶切位點2的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體，命名為pGEMT/Hexon HR down-single enzyme2 ；(4)構(gòu)建腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帯篩選基因的穿梭載體將合成的帶有EcoRl-Xbal-BamHl-SfuI-ClaI-HindIII酶切位點的DNA序列，其DNA序列如下AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA 連入經(jīng) EcoRI 和 HindIII 雙酶切的 pUC19 質(zhì)粒載體，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為PUC19EHL ；將 Hexon HR up 片段從 pGEMT/Hexon HR up-single enzymel 載體上經(jīng) XbaI 和單ー 酶切位點1對應(yīng)的內(nèi)切酶雙酶切下來，經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳回收后連入經(jīng)相同酶雙酶切的pUC19EHL中，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆，命名為 ρ shut 11 e-Hexon-up HR,將 rfexon HR aown 片段從 pGEMT/Hexon HR down-singleenzyme2 載體上經(jīng)BamHI和ClaI雙酶切下來，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后連入經(jīng)相同酶雙酶切的 pshuttle-Hexon-up HR載體中，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Hexon-up-down HR ；將經(jīng)過單ー酶切位點1和2所對應(yīng)的內(nèi)切酶雙酶切的篩選表達元件連入經(jīng)過相同酶雙酶切的pshuttle-Hexon-up-down HR載體，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆為腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帯篩選基因的芽梭咸體，命名為 pshuttle-Hexon-screening gene ；(5)構(gòu)建六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體將pshuttle-Hexon-screening gene經(jīng)XbaI和ClaI雙酶切，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收Hexon-screening gene片段后與經(jīng)BamHI線性化的pAd5CMV_R印orter共轉(zhuǎn)化Bj5183 感受態(tài)細胞，培養(yǎng)、篩選，經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆為六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，命名為pRGHMAd5 ；(6)六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建及病毒制備將合成的小肽的寡核苷酸退火后與經(jīng)單ー酶切位點1和2酶切處理后的pRGFMAd5連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩選，經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽修飾的腺病毒的載體，命名為pRGFMAd5-小肽，將pRGFMAd5-小肽載體經(jīng)I^acI 線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞，7-10天后獲得病毒原液，經(jīng)過擴増，通過CsCl梯度離心純化后獲得六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽遺傳修飾的腺病毒，命名為Ad5-Hexon-Small-p印tide。
全文摘要
一種制備六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體，在E1區(qū)插入報告基因表達元件；Ad5腺病毒基因組六聯(lián)體蛋白的高可變區(qū)5引入兩個單一的酶切位點、酶切位點之間插入一個篩選表達元件；在Ad5載體引入的兩個單一酶切位點之間插入小肽序列。構(gòu)建方法為構(gòu)建在E1區(qū)攜帶報告基因表達框的腺病毒質(zhì)粒載體、引入單一酶切位點1的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列上游800bp同源臂的質(zhì)粒載體、引入單一酶切位點2的腺病毒六聯(lián)體蛋白高可變區(qū)5序列下游2300bp同源臂的質(zhì)粒載體、腺病毒六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾部位攜帶篩選基因的穿梭載體、構(gòu)建六聯(lián)體蛋白經(jīng)遺傳修飾的腺病毒的載體、六聯(lián)體蛋白經(jīng)小肽修飾的腺病毒的載體的構(gòu)建及病毒制備。
文檔編號C12N15/66GK102559758SQ201110427860
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者夏海濱, 邸炳艷, 鄭曉晶 申請人:陜西師范大學(xué)