專利名稱：重要腸道致病病毒檢測(cè)基因芯片的制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及十種常見腸道致病病毒核酸檢測(cè)可視化基因芯片的制備和用途，屬基因芯片檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腸道病毒(enterovirus)是一大群通過糞-口途徑傳播，經(jīng)過消化道感染的病毒。 其感染雖然始于胃腸道，但很少引起這些部位的疾病。腸道病毒屬RNA病毒類的小RNA病毒科(picornaviridae),包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、致腸細(xì)胞病變?nèi)斯聝翰《?enterocytopathic human orphan virus, ECHO簡(jiǎn)稱?？刹《?及新型腸道病毒共71個(gè)血清型，腸道病毒屬病毒引起的傳染病。臨床表現(xiàn)輕者只有倦怠、乏力、低熱等，重者可全身感染，腦、脊髓、心、肝等重要器官受損，預(yù)后較差，并可遺留后遺癥或造成死亡。本類疾病分布于世界各地，在熱帶和亞熱帶全年都有，在溫帶夏季多見，在溫暖、潮濕、 衛(wèi)生條件差、人群擁擠的地區(qū)發(fā)病率高。腸道病毒引起的疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜而多樣化，同型病毒可引起不同的臨床綜合癥，而不同型別病毒又可引起相似的臨床表現(xiàn)。多數(shù)腸道病毒感染后不出現(xiàn)或只出現(xiàn)輕微癥狀，如發(fā)熱或上呼吸道感染等，但有些腸道病毒感染可引起明顯的臨床癥狀，且腸道病毒引起的臨床癥狀很少與腸道疾病有關(guān)。腸道病毒所致的疾病主要有(I)脊髓灰質(zhì)炎85% 的脊髓灰質(zhì)炎由脊髓灰質(zhì)炎病毒I型引起，偶有些由脊髓灰質(zhì)炎病毒2、3型引起。(2)無菌性腦膜炎、腦炎和輕癱幾乎所有的腸道病毒感染都與無菌性腦膜炎、腦炎和輕癱有關(guān)。腸道病毒性腦膜炎幾乎每年夏秋季均有發(fā)生。其中有些型別，如?？刹《?、11、18、19、腸道病毒71型等曾引起過暴發(fā)流行。(3)皰疹性咽峽炎主要由柯薩奇病毒A組引起，典型癥狀是在軟腭、腭垂周圍出現(xiàn)水皰性潰瘍損傷。(4)手足口病主要由柯薩奇病毒A組5、10、16 型和腸道病毒71型引起，可導(dǎo)致暴發(fā)感染。(5)肋肌痛主要由柯薩奇病毒B組1-5型引起，患者表現(xiàn)為突發(fā)性發(fā)熱和單側(cè)胸痛，有時(shí)擴(kuò)展為雙側(cè)胸痛或腹痛。(6)心肌炎和心包炎 主要由柯薩奇病毒B組1-5型引起，散發(fā)流行于成人和兒童，但對(duì)新生兒威脅最大，在嬰兒室可引起暴發(fā)流行。新生兒感染后，病毒可直接破壞心肌細(xì)胞，患兒出現(xiàn)發(fā)熱和突然的、不明原因的心力衰竭，死亡率高。(7)急性非細(xì)菌性胃腸炎輪狀病毒呈世界性分布。A組輪狀病毒感染最為常見，是引起6個(gè)月至2歲嬰幼兒嚴(yán)重胃腸炎的主要病原體，占病毒性胃腸炎的80%以上，是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因之一。年長(zhǎng)兒童和成人常呈無癥狀感染。輪狀病毒感染的傳染源是病人和無癥狀帶毒者。病人每克糞便中排出的病毒體可達(dá)IOltl個(gè)， 糞-口是主要的傳播途徑。病毒還可能通過呼吸道傳播，從有呼吸道癥狀兒童的呼吸道分泌物中曾檢出輪狀病毒的存在，在動(dòng)物中已證明氣溶膠可傳播病毒。B組輪狀病毒可在成人中產(chǎn)生暴發(fā)流行，但至今僅在我國(guó)有過報(bào)道。C組輪狀病毒對(duì)人的致病性類似A組，但發(fā)病率很低。及時(shí)準(zhǔn)確的甄別病毒型別是臨床診治和疾病監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的腸道病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括組織細(xì)胞培養(yǎng)法；血清學(xué)和直接檢測(cè)法(包括電鏡法)；間接、直接免疫熒光抗體法(IFA/DFA);酶免疫測(cè)定(EIA)、酶活性測(cè)定(神經(jīng)氨酸酶測(cè)定)；核酸擴(kuò)增法 (PCR)。病毒的分離培養(yǎng)與鑒定及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在病毒性疾病診斷中曾起著十分重要的作用。組織細(xì)胞培養(yǎng)仍然是發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術(shù)手段，是其他任何技術(shù)不可替代的。然而，這些技術(shù)都還存在一些無法彌補(bǔ)的缺陷，操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性差、診斷效率低等?？傊?，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法和目前應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床診斷的需要，醫(yī)生單憑自己的臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行病毒性疾病診斷的事是經(jīng)常發(fā)生的。據(jù)此，病毒性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)必須改革，要尋找和建立快速、特異、敏感和簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以適應(yīng)臨床工作的需要?；蛐酒夹g(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種用于基因分析的高新生物技術(shù)，廣泛用于臨床疾病的研究，特別是用于診斷一些微生物病原體的感染。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)其突出的特點(diǎn)是高通量、集成化、微型化、自動(dòng)化等。特別適合于對(duì)大量未知樣品進(jìn)行平行快速高通量的分析。病毒的基因組較簡(jiǎn)單，每種病毒只有一種核酸，但是病毒增殖速度極快，故病毒較其他微生物更具有遺傳不穩(wěn)定性，即變異性。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)專利報(bào)道的基因芯片技術(shù)用于檢測(cè)腸道病毒的方法比較少，多數(shù)報(bào)道僅針對(duì)腸道病毒屬中的一種或幾種。因此文獻(xiàn)中報(bào)道的方法不能充分利用基因芯片高通量檢測(cè)這一特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究包括顧大勇等人僅針對(duì)諾如病毒、輪狀病毒做了相關(guān)研究，史蕾等人針對(duì)諾如病毒的分型作了介紹。熒光檢測(cè)法是基因芯片的常規(guī)檢測(cè)方法，即將熒光色素化合物直接或間接標(biāo)記在待檢核酸上，產(chǎn)生的熒光信號(hào)采用激光共聚焦掃描檢測(cè)。該方法的缺點(diǎn)熒光信號(hào)易飽和， 易淬滅；存在自發(fā)熒光現(xiàn)象；而且最大缺點(diǎn)是檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴，體積笨重，從而嚴(yán)重限制了基因芯片的推廣應(yīng)用，尤其是在中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)以及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的推廣應(yīng)用。開發(fā)成本低廉、 檢測(cè)方便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的基因芯片檢測(cè)新技術(shù)勢(shì)在必行。金標(biāo)銀染技術(shù)(GLSS)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了熒光檢測(cè)法的不足，使基因芯片可視化檢測(cè)成為可能。該技術(shù)的原理是首先用納米金標(biāo)記待檢的PCR產(chǎn)物，然后在體系中引入銀離子。 小尺寸效應(yīng)使納米金具有很強(qiáng)的催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而這些銀顆粒又可以進(jìn)一步催化還原周圍的銀離子。這種級(jí)聯(lián)瀑布催化作用使得銀顆粒越聚越多，緊緊包裹納米金顆粒積聚成團(tuán)狀銀殼，形成肉眼可見的黑色顆粒，肉眼即可觀測(cè)?；诮饦?biāo)銀染的原理的可視化檢測(cè)技術(shù)能夠大幅降低生物芯片的檢測(cè)成本，但是單步金標(biāo)銀染的檢測(cè)靈敏度還不能滿足分子檢測(cè)領(lǐng)域的更高要求，進(jìn)一步提高可視化的靈敏度，使可視化檢測(cè)能夠完全代替熒光檢測(cè)，對(duì)于生物芯片技術(shù)的推廣應(yīng)用具有重要意義。 TSA(tyramine siganal amplification,酪胺信號(hào)放大技術(shù))是一種基于辣根過氧化物酶 (horseradishperoxidase, HRP)催化的生物信號(hào)放大技術(shù)，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信號(hào)放大分子酪胺是一個(gè)酚基化合物，可以作為HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量連接半抗原的酪胺分子沉積，這些半抗原主要是生物素、熒光素等小分子物質(zhì)。1992年,Adams將應(yīng)用Biotin-Tyramine的TSA系統(tǒng)首先引入免疫組化,用于抗原或抗體的檢測(cè)?，F(xiàn)在，TSA技術(shù)在免疫印跡、ELISA分析以及原位雜交等諸多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。本研究采用不對(duì)稱RT-PCR結(jié)合可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)研發(fā)了常見腸道致病病毒核酸檢測(cè)可視化基因芯片，可對(duì)目前較常見的腸道致病病毒進(jìn)行甄別，該芯片法敏感性
5好，特異性高，適合于多種腸道病毒的快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)常見腸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，該芯片依托可視化芯片檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的可視化，能同時(shí)檢測(cè)十種腸道致病病毒，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、 ?？刹《?0型、輪狀病毒，從而實(shí)現(xiàn)高通量、特異、敏感、快速檢測(cè)常見腸道致病病毒的目的。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明開發(fā)了常見腸道致病病毒核酸檢測(cè)可視化基因芯片， 其制備方法如下I.步驟一制備特異引物經(jīng)過比對(duì)各腸道病毒基因組，選擇病毒的特異、保守片段作為檢測(cè)靶基因，在保證各病毒靶基因特異性擴(kuò)增的前提下兼顧其靈敏度，故將5對(duì)腸道致病病毒引物進(jìn)行分管組合，經(jīng)優(yōu)化最終確定了 3管多重RT-PCR體系。優(yōu)選的5對(duì)腸道致病病毒引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增靶病毒種類和分管組合情況，如表I所示表I腸道致病病毒引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增靶病毒種類和分管組合情況
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)常見腸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，其制備方法包括I)步驟一制備5對(duì)腸道致病病毒引物，分別放入3管RT-PCR體系中，序列如表I所示表I引物序列
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因芯片，其特征還在于用于脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、輪狀病毒的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重要腸道致病病毒檢測(cè)基因芯片，其制備方法包括制備特異引物，制備病毒特異性探針，制備寡核苷酸芯片，建立RT-PCR體系，建立雜交體系，制備可視化檢測(cè)試劑及建立顯色方法。利用本發(fā)明制備的基因芯片可同時(shí)甄別10種常見腸道致病病毒，包括包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、?？刹《?0型、輪狀病毒，為常見腸道致病病毒高通量、快速檢測(cè)提供一種新的解決方案，可為腸道致病病毒的監(jiān)測(cè)、臨床診斷及治療提供指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102586476SQ20121001547
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者劉志紅, 劉琪琦, 張敏麗, 彭賢慧, 朱坤, 王升啟, 陳蘇紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司