專利名稱：一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(CAT)是一種蛋白類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它能促使 H2O2分解為分子氧和水而清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免受H2A的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。氧自由基的清除可以分為兩步第一步是作為有害物質(zhì)的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反應(yīng)，生成H2A ；第二步是H2O2在過氧化氫酶的作用下和氫離子反應(yīng)，最終將H2A降解成H2O和02。事實上，SOD、GSH、維生素E、CAT等是一個相互保護(hù)的防御群。當(dāng)自由基代謝出現(xiàn)紊亂時，抗氧化酶含量降低而引起機(jī)體受損。適當(dāng)補(bǔ)充外源性的抗氧化劑能提高機(jī)體的抗氧化能力，以免機(jī)體受到自由基的損傷。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)自由基與衰老、癌癥、肺心病、腎病等多種疾病有關(guān)，主要在幾個病理過程的啟動中起重要作用。機(jī)體主要通過去自由基酶(如S0D、CAT等)來清除體內(nèi)自由基，使機(jī)體免受自由基損傷。彭志英和蔣黎(19%)的研究表明過氧化氫酶正是能夠迅速分解H2A生成H2O和02，使超氧化物酶水解反應(yīng)順利進(jìn)行，同時使H2A不至于與02_在鐵鰲合物的作用下反應(yīng)生成0H—自由基，而防止自由基的損傷。去自由基酶在健康和疾病中的作用正在被人們關(guān)注，檢測該類酶對研究自由基代謝平衡、抗衰老及腫瘤發(fā)病機(jī)理，以及急性胰腺炎、肝炎、心血管疾病、各種貧血與Zieve綜合癥等的診斷與鑒別診斷具有重要意義(Southern and Powis, 1988; Cohen, 1989)。此外，過氧化氫酶還可充當(dāng)Hb和其它含巰基蛋白質(zhì)的保護(hù)劑。過氧化氫酶主要與細(xì)胞內(nèi)線粒體及過氧化物酶體結(jié)合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脫氫酶相偶聯(lián)并快速分解細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)H2O2，從而起到解毒、保護(hù)巰基酶和膜蛋白等作用(王坤等，1989)。從發(fā)現(xiàn)至今，對過氧化氫酶的研究已愈百年，對該酶的理論與應(yīng)用研究均有一定的深度。近幾年隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步及需求，過氧化氫酶獲得廣泛的應(yīng)用，其主要應(yīng)用領(lǐng)域主要有①在食品工業(yè)中的應(yīng)用；②在制漿造紙和紡織印染工業(yè)中的應(yīng)用；③在醫(yī)藥中的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，CAT的應(yīng)用已經(jīng)獲得進(jìn)展。如含有過氧化氫酶的滴眼液和隱形眼鏡護(hù)理液可以有效的去除晶狀體內(nèi)的H2O2，有效的預(yù)防和延緩白內(nèi)障的發(fā)生；補(bǔ)充過氧化氫酶可以有效的抑制刺激部位平滑肌細(xì)胞的異常增殖的現(xiàn)象；近年來，過氧化氫酶開始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該酶和過氧化氫，目的是增加表皮上層的細(xì)胞氧量。由于幾乎所有的疾病的發(fā)生和發(fā)展都與自由基的積累有關(guān)系，所以研究人員已經(jīng)在嘗試將過氧化氫酶用于動物活體細(xì)胞的功能研究，如血管上皮細(xì)胞，肌細(xì)胞，晶體細(xì)胞等，并取得了一定的進(jìn)展。一些蛋白質(zhì)能以非傳統(tǒng)的內(nèi)化方式跨膜進(jìn)入細(xì)胞，而且這些蛋白還能將更大的分子帶入到細(xì)胞內(nèi)部，甚至逾越血腦屏障。研究發(fā)現(xiàn)，這類蛋白都有共同特性的能介導(dǎo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)域——蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein transduction domain,PTD)0具有跨膜遞送活性的PTD蛋白核心序列(YGRKKRRQRRR)的多肽片段即被確定為TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，簡稱 PTD-TAT。PTD-TAT區(qū)段(protein transduction domain)能夠高效地將多種不同結(jié)合形式的大分子顆粒帶進(jìn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并不會導(dǎo)致攜帶物生物學(xué)活性的喪失。CAT現(xiàn)已經(jīng)成為一種療效廣泛的藥用酶，但仍有一些缺陷，如天然酶分子量大且難透過細(xì)胞膜、穩(wěn)定性較差、體內(nèi)半衰期短、且具有免疫原性、功能相對單一等，使其在臨床上的應(yīng)用仍有一定的困難，從而限制了其應(yīng)用。對于CAT-TAT融合蛋白研究有利于進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。通過使用該基因表達(dá)得到了 CAT-TAT蛋白，實現(xiàn)CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，獲得具有良好穩(wěn)定性的CAT-TAT產(chǎn)品，用于提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。本發(fā)明首先提供了一種編碼過氧化氫酶的基因，該基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1 所示。其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。其次提供了一種載體，包含所述的編碼過氧化氫酶的基因。還提供了一種細(xì)胞，包含上述的載體。所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。本發(fā)明另外提供了一種編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，包括以下步驟從人肝臟細(xì)胞中分離提取總RNAJf mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)NCBI發(fā)表的人 CAT基因序列設(shè)計引物Pl和P2，分別含有MfeI和Viz^III酶切位點，用于大腸桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建；或設(shè)計引物P3和P4分別含有和I酶切位點，用于酵母質(zhì)粒的構(gòu)建；其中引物P2或P4含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因；制備好的雙鏈cDNA進(jìn)行亞克隆將所得目的基因進(jìn)行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到CAT-TAT基因。所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3, SEQ NO. 4, SEQ NO. 5, SEQ NO. 6 所不。本發(fā)明還提供了所述編碼過氧化氫酶的基因的應(yīng)用，所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以體外給藥的方式提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶活力。本發(fā)明詳述如下
本發(fā)明涉及從人肝臟細(xì)胞中克隆的CAT基因。本發(fā)明涉及從人肝臟細(xì)胞中克隆的CAT-TAT的編碼序列。實施方式之一，本發(fā)明提取人肝臟細(xì)胞L-02的總RNA，通過RT-PCR和PCR的方法克隆到編碼CAT的全長序列以及CAT-TAT融合基因。實施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ NO. 1所示的核酸序列， 稱之為CAT-TAT。實施方式之一中，所述編碼序列是SEQ NO. 1中的核苷酸1至1608bp所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述CAT-TAT編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源性信號肽序列。實施方式之一中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明CAT-TAT編碼序列經(jīng)MfeI和 Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切后與MfeI和歷/^ III雙酶切的pET21a(+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載 pET21a(+)-CAT-TAT0另一實施方式中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明CAT-TAT編碼序列經(jīng)機(jī)和Not\雙酶切后與Sft^I和Afoi I雙酶切的pPICTk載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體pPIC9k-CAT-TAT。本發(fā)明還制備包含本發(fā)明CAT-TAT編碼序列的細(xì)胞。實施方式之一中，所述細(xì)胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細(xì)胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表達(dá)或發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞，此類細(xì)胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實施方式之一中，選用大腸桿菌Rosetta2(DE;3)和畢赤酵母GS115構(gòu)建表達(dá)CAT-TAT的重組細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)CAT-TAT的方法，包括培養(yǎng)前述包含CAT-TAT編碼序列的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，還可以可行性地包括純化表達(dá)產(chǎn)物的步驟。實施方式之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明CAT-TAT編碼序列的酵母(例如畢赤酵母GS1K)發(fā)酵來生產(chǎn)CAT-TAT，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。本發(fā)明利用基因工程手段制備了能夠高效表達(dá)并分泌CAT-TAT融合蛋白，實現(xiàn)了 CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，并獲得了優(yōu)質(zhì)的CAT-TAT產(chǎn)品。本發(fā)明通過融合蛋白酶學(xué)性質(zhì)鑒定進(jìn)行了酶的最適作用溫度、最適作用PH值、金屬離子穩(wěn)定性等理化性質(zhì)的分析，證明本發(fā)明的CAT-TAT重組蛋白最適反應(yīng)溫度為40°C，最適反應(yīng)pH為6. 5 ；CAT-TAT融合蛋白通過體外給藥實驗，表明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域融合的CAT蛋白能明顯提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。


圖1人源CAT-TAT在質(zhì)粒pET21a(+) (A)和pPIC9k (B)上的重組子結(jié)構(gòu)圖。圖2人源CAT和CAT-TAT在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE。圖3畢赤酵母表達(dá)人源CAT-TAT發(fā)酵過程中的酶活力。圖4畢赤酵母表達(dá)人源CAT-TAT發(fā)酵過程中樣品的SDS-PAGE。圖5畢赤酵母表達(dá)人源CAT-TAT的分子量。圖6畢赤酵母表達(dá)人源CAT-TAT的最適反應(yīng)pH。圖7畢赤酵母表達(dá)人源CAT-TAT的最適反應(yīng)溫度。圖8畢赤酵母表達(dá)人源CAT對對細(xì)胞內(nèi)CAT活性影響。
具體實施例方式以下根據(jù)具體的實施例充分說明本發(fā)明。 實施例實驗材料和試劑 1.菌株和載體
大腸桿菌 Rosetta2 (DE3)、JDH5 α 及表達(dá)載體 pET21a(+)購自 Novagen 公司；pMD_18T Vector購自Takara公司；畢赤酵母GS115及表達(dá)載體pPIC9k均購自hvitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。2.酶類及其他生化試劑
限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、蛋白質(zhì)Maker均購自i^ermentas (MBI)，CAT檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其他常規(guī)試劑為上海生工或進(jìn)口。3.培養(yǎng)基
使用的培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基，YPD，YPAD, BMDY, BMMY, MM, MD培養(yǎng)基均參照hvitrogen畢氏酵母操作手冊。4.本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中， 除非特殊說明，所有實驗操作均按照以下實驗手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分進(jìn)行，包括 [美]J.莎姆布魯克等，分子克隆實驗指南；趙永芳等，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)；朱檢等，生物化學(xué)實驗[M]。5.本發(fā)明中所有相關(guān)的酶活、酶活力、酶活性均是指CAT酶活性，均采用CAT檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，并按照其說明書中所述的方法進(jìn)行測定及計算。實施例1 CAT及CAT-TAT基因的克隆
(1)總RNA的分離提取
(2)cDNA第一鏈的合成
反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA 參照(First-straind cDNA Synthesis KIT)產(chǎn)品說明，在 20ul 體系中，加入 lug 總 RNA、lul Oligo dT18 (500ug/ml)和 foiase-free 水，在 70°C水浴溫育 IOmin后，立即置于冰浴冷卻；繼續(xù)向冷卻的管中加入4ul 5XBuffer、2ul 0. IM的DTT和 Iul IOmM的dNTPs，混勻后于42°C水浴保溫^iin ；再加入Iul (200U)反轉(zhuǎn)錄酶，42°C繼續(xù)保溫50min ；最后，置于70°C水浴保溫15min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，獲得第一鏈cDNA。實驗過程中設(shè)置不加RNA的陰性對照。(3) PCR獲取目的基因
根據(jù)NCBI發(fā)表的人CAT基因序列設(shè)計引物=PKSEQ NO. 3)和P2(SEQ NO. 4)，分別含有 MfeI 和歷'/ /ΙΠ酶切位點，用于 pET21(a+)質(zhì)粒的構(gòu)建；P3 (SEQ NO. 5)和 P4 (SEQ NO. 6)， 分別含有Sffi^I和Λ^ I酶切位點，用于pPICTk質(zhì)粒的構(gòu)建；P2和P4均含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。所述引物均由上海生工合成，引物序列如下
Pl :5， CATATG GCTGACAGCCGGGATCCCG 3，，
P2 :5， GGAAGCTTTCATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，； P3 :5’ TACGTAGCTGACAGCCGGGATCCCG 3’，
P4 :5， GCGGCCGCTTATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，。本實施例PCR程序為94°C預(yù)變性％iin;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 2min，循環(huán)擴(kuò)增30次；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因。得到產(chǎn)物P1-P2和產(chǎn)物P3-P4.
制備好的雙鏈cDNA P1-P2和P3-P4插入到載體系統(tǒng)pMD_18T vector上，分別將連接物轉(zhuǎn)入制備好的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂LB平板(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入anl LB培養(yǎng)基中(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)過夜；收集培養(yǎng)液，IOOOOrpm室溫離心Imin收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒 (上海生工)提取質(zhì)粒；質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶MfeI和歷/^III /SnaB I和Λ^ I進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測；挑取陽性克隆PMD-18T-CAT-TAT1和pMD_18T-CAT_TAT2用 M13F(5，CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，)和 M13R(5，AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3，)弓丨
6物進(jìn)行測序(上海英俊公司)，測序采用Sanger測序方法。pMD-18T-CAT-TATl 和 pMD-18T_CAT_TAT2 的測序結(jié)果是，CAT-TAT 的編碼序列共有 1608bp (SEQ ID NO. 1),編碼人源過氧化氫酶與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)TAT的融合蛋白(SEQ NO. 2)。其中第1606-1608位為終止密碼子TAA ；第1-1578位編碼不含信號肽的成熟人過氧化氫酶蛋白，共5 個氨基酸；與黑猩猩等來源的過氧化氫酶有較高的同源性；第1579-1606為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。
實施例2 CAT-TAT編碼基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將實施例1 - (4)中所得到的質(zhì)粒pMD-18T-CAT-TAT1經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切得到 CAT-TAT片段，與經(jīng)過MfeI和歷^iZIII雙酶切的pET21a(+)質(zhì)粒連接，將連接物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提質(zhì)粒鑒定(方法同實施例1)，得到重組質(zhì)粒 pET21a(+)-CAT-TAT (如圖 IA所示)。取Iul構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET21a(+)-CAT_TAT，加入到IOOul制備好的感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌ROSetta2(DE;3))中，涂LB平板(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入anl LB培養(yǎng)基中(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至50ml LB培養(yǎng)液中(含100ug/ml Amp) 培養(yǎng)1. 5-2h至OD600=O. 6，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度為2umol/ml), 30°C 250rpm再振蕩培養(yǎng) 3-3.證。取培養(yǎng)液IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體，再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體， 12000rpm離心lOmin，取沉淀用1/5體積pH6. 0，50mM的PBS懸浮菌體，進(jìn)行超聲波破碎，破碎條件為60%功率，間隔5s破碎lOmin，停止lOmin，再破碎lOmin。12000rpm離心，收集上清液分析CAT-TAT活力，并通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明CAT-TAT 的編碼基因所編碼的CAT-TAT可在大腸桿菌中表達(dá)，且有一定的CAT活性。(圖2)
實施例3 CAT-TAT編碼基因酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建
將實施例1-(4)中所得到的質(zhì)粒pMD-18T-CAT-TAT2，用I和AfoiI進(jìn)行酶切，酶切樣品經(jīng)核酸電泳檢測并用膠回收試劑盒(上海生工)回收目的基因。與黽SnaB I和徹《 雙酶切的PPirak質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶16°C水浴連接池，連接物轉(zhuǎn)入DH5 α (方法同實施例1)。 挑取抗性菌株培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)I和徹《進(jìn)行酶切，核酸電泳檢測，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-CAT-TAT (如圖IB所示)。以所得pPIC9k-CAT_TAT重組質(zhì)粒為模板，以CAT-TAT的特異性引物P3和P4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同實施例1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測可見一條約I600bp的條帶， 與目的片段的大小一致。并將該重組質(zhì)粒PPICTk-CAT-TAT行測序，測序引物為a-factor Primer 禾口 3' AOXl Primer。α -factor Primer :5’ TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ 3' AOXl Primer 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
測序結(jié)果與SEQ NO. 1 一致，表明CAT-TAT在pPICTk中插入位點、方向、序列和閱讀框均正確，即pPIC9k-CAT-TAT表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。實施例4畢赤酵母發(fā)酵制備重組CAT-TAT
大量提取實施例3的重組質(zhì)粒pPIC9k-CAT-TAT約5ug，用Sal I酶切，得到線性化的 pPIC9k-CAT-TAT 質(zhì)粒。
提取畢赤酵母GS115單菌落于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌密度達(dá)到 OD600=L 3。取Iml的該菌液于1. 5ml無菌離心管中冰浴IOmin后，于1500g，4°C離心機(jī)離心 5min ；棄上清，加入Iml冰浴的無菌水，輕輕將細(xì)胞懸起，后置1500g，4°C離心機(jī)離心5min ； 重復(fù)一次；棄上清，加入Iml冰浴的SorbitaKl M)，輕輕將細(xì)胞懸起，后置1500g，4°C離心機(jī)離心5min ；重復(fù)兩次；棄上清，加入100 ul冰Sorbital (1 M)。將上述細(xì)胞轉(zhuǎn)入0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯中，加入線性化的pPICTk-CAT-TAT質(zhì)粒，混勻，置于冰上5min，用電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad MicroPulser )進(jìn)行電擊(電擊電壓2. OkV;時間常數(shù) 5. 8ms)，電擊后迅速加入Iml Sorbital (1 M)，混勻取菌液200ul涂布RD板，30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3-4天，長出his+重組子。挑出長出來的單菌落，于YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，按0D_=1. O轉(zhuǎn)接于小搖瓶(IOml BMMY培養(yǎng)基)，以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)AOX基因表達(dá)，每Mhr取樣，取樣同時補(bǔ)加甲醇至終濃度1%.誘導(dǎo)168hr樣品離心，取上清，測定CAT活性，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析， 結(jié)果分別如圖3和圖4所示。發(fā)酵達(dá)72hr時，樣品的CAT活性最高達(dá)到^OU/ml，相應(yīng)菌密度達(dá)到0D6(i(i=35.這說明重組CAT-TAT融合蛋白在畢氏酵母中得到了表達(dá)和積累。實施例5重組CAT-TAT的純化
將實施例4所制備的發(fā)酵培養(yǎng)液IOOOOrpm離心IOmin去除菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至50%，13000rpm離心15min，取沉淀， 用緩沖液(Tris-HCl，pH8.0，50mM)重新溶解。將以上溶解后的樣品，經(jīng)13000rpm離心15min，取上清上脫鹽柱冊-558(01.6\100011)，先用501111 Tris-HCl緩沖液pH8. 0平衡柱子，然后上樣，流速為 1. 0 ml/min，用部分收集器收集樣品，然后對收集的樣品測定CAT活性，并進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。取上述的目的蛋白峰樣品，用于SuperQ 650C陰離子交換色譜，先用50mM pH8. 0， Tris-HCl緩沖液平衡柱子，然后樣品上樣，再用平衡液沖平，流速為lml/min。待沖平后，再用相同緩沖液配置的0-lmol/L NaCl梯度洗脫5個柱體積，分布收集樣品，測定CAT活性， 并進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。取離子交換色譜后的目的蛋白峰樣品，上Tsk-G3000SW凝膠過濾柱。先用50mM PH8.0, Tris-HCl平衡柱子，然后上樣，流速為1.0 ml/min，用部分收集器收集樣品，然后對收集的樣品測定CAT活性，并進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。SDS-PAGE結(jié)果(圖5)表明，重組人源CAT-TAT融合蛋白經(jīng)純化后，以達(dá)到電泳純， 其分子量約為66kDa。CAT活性從粗酶液的^OU/mg提高到純酶的6400U/mg，純化倍數(shù)為 34. 9 倍。實施例6重組CAT-TAT的酶學(xué)性質(zhì)分析
將實施例5所制備的CAT-TAT純?nèi)诤系鞍自诓煌膒H下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適PH。所用緩沖液的pH范圍為5. 0-9.0 (pH4. 0-6.0范圍內(nèi)采用50mM Gly-HCl緩沖液， pH6. 5-9. 0采用50mM Tris-HCl緩沖液)。CAT-TAT純?nèi)诤系鞍自诓煌膒H的緩沖液中， 37°C下測定pH的適性結(jié)果，表明人源CAT-TAT融合蛋白從pH5. 0至6. 5酶活力迅速升高， 在中偏酸性的PH具有較高的酶活，在pH為6. 5是酶活力達(dá)到最高(100%)，pH在6. 5-9. 0 之間酶活力緩慢降低，在PH9. 0時仍能保持70%以上的酶活力(圖6)。
最適反應(yīng)溫度的測定在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)緩沖體系及不同溫度下、 20 V、25 °C、30 V、；35 °C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V >65°C 進(jìn)行酶促反應(yīng)。熱穩(wěn)定性研究為在不同溫度下處理60min，再進(jìn)行酶活性測定。酶促反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖7)表明， CAT-TAT過氧化氫酶融合蛋白在4-25° C之間相對酶活平緩，從30-40° C之間相對酶活迅速上升，之后又開始迅速下降，65°C時僅保留不到20%的酶活力，最適反應(yīng)溫度為45-55°C。在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)緩沖液中加入終濃度為ImM的金屬鹽溶液和抑制劑 (Ca2\Mn2\Zn2\Al3\Pb2\Fe3\Fe2\Mg2\K\ Cu2+、Hg+、2-Mercaptoethanol、EDTA)，在 40°C 的水浴中保溫30min后，在37°C下測定殘留的CAT活性。由表1可知，Mn2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+ 等對CAT-TAT融合蛋白的過氧化氫酶活力有一定的促進(jìn)作用；Al3+、2-MerCaptoethanol、 EDTA等對CAT-TAT融合蛋白的過氧化氫酶活力有明顯的抑制作用。
表1金屬離子及其他抑制劑對CAT-TAT酶活性的影響
權(quán)利要求
1.一種編碼過氧化氫酶的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼過氧化氫酶的基因，其特征在于其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.一種載體，包含權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因。
4.一種細(xì)胞，包含權(quán)利要求3所述的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
6.一種如權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，其特征在于從人肝臟細(xì)胞中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)NCBI發(fā)表的人CAT基因序列設(shè)計引物Pl和P2，分別含有MfeI和Viz^III酶切位點，用于大腸桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建；或設(shè)計引物P3和P4分別含有和I酶切位點，用于酵母質(zhì)粒的構(gòu)建；其中引物P2或P4含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因；制備好的雙鏈cDNA進(jìn)行亞克隆將所得目的基因進(jìn)行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到CAT-TAT基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，其特征在于所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3、SEQ NO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 6 所示。
8.—種如權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因的應(yīng)用，其特征在于所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以體外給藥的方式提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶活力。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的一種編碼過氧化氫酶的基因，該基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示。本發(fā)明從人肝臟細(xì)胞中克隆的CAT-TAT的編碼序列。首先提取人肝臟細(xì)胞L-02的總RNA，通過RT-PCR和PCR的方法克隆到編碼CAT的全長序列以及CAT-TAT融合基因。通過使用該基因表達(dá)得到了CAT-TAT蛋白，實現(xiàn)CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，獲得具有良好穩(wěn)定性的CAT-TAT產(chǎn)品，用于提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。
文檔編號C12N15/63GK102559714SQ20121002146
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者劉樹滔, 李仁寬, 饒平凡 申請人:福州大學(xué)