專利名稱：一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
哲羅鮭(Hucho taimen)為我國珍貴、冷水性魚類之一，主要分布在亞洲北部地區(qū)， 西至伏爾加河流域、東至伯朝拉河流域、南至黑龍江流域，北至勒拿河等流域。哲羅鮭大部分時間生活在水流湍急的溪水中，冬季在較深的水體如大江干流、湖泊中越冬，春季向溪流洄游產(chǎn)卵。由于繁殖期過度捕撈，使哲羅鮭補充群體數(shù)量大大減少，以及人為環(huán)境污染及生存環(huán)境條件破壞等原因，使哲羅鮭的自然資源量顯著下降。目前，黑龍江的哲羅鮭數(shù)量較過去顯著減少，在黑龍江省的漁獲物中幾乎不占比重。自2005年我國哲羅鮭人工繁殖和苗種馴化成功后，該魚因其生長速度快、易馴養(yǎng)、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，而被廣泛養(yǎng)殖，涉及到全國 20幾個省市縣。近些年，隨著哲羅鮭養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、由于種質(zhì)衰退和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因，一些冷水性魚類的暴發(fā)性疾病頻頻爆發(fā)，導(dǎo)致我國哲羅鮭等冷水性魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量銳減。目前，國內(nèi)外學(xué)者雖對哲羅鮭生態(tài)習(xí)性、生長繁殖、生化和遺傳等方面進行了大量的研究，但對其細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究還尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，按以下步驟進行一、斷頸處死哲羅鮭；二、 采集哲羅鮭魚體組織，將組織放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素的D-Hanks緩沖液中浸泡20秒，再用D-Hanks緩沖液沖洗3遍，得清洗后的組織；三、原代培養(yǎng)組織塊 將清洗后的組織剪碎至O. 8 I. 2mm3的塊狀，然后將剪碎的組織塊移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使組織塊均勻地平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入O. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置于19°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，并向細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入8mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，在19°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至組織塊長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的80% ;四、細(xì)胞的原代培養(yǎng)取O. 5mL步驟三得到的原代培養(yǎng)后的組織塊放入5mL胰蛋白酶消化液中， 在23°C下于50 IOOrpm的搖床上消化，每5分鐘收集4mL上層消化液，移入預(yù)先加入ImL 血清的離心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向組織塊中補加 4mL胰蛋白酶消化液，然后將收集到的消化液和血清混合物于lOOOr/min離心5min，取沉淀 A，向沉淀A中加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，得懸浮液，調(diào)整懸浮液的細(xì)胞濃度至IO5個/mL，接種 8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80% 90% ； 五、體細(xì)胞傳代培養(yǎng)然后消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)混合液體于IOOOr/ min離心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至 IX IO4 5X IO4個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80%，再次傳代，即完成哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)。冷水性魚類因其具有獨特的生長環(huán)境和代謝機制，其細(xì)胞培養(yǎng)一直以來是國內(nèi)外魚類細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難點。因此，為解決我國冷水性魚類病毒性疾病檢測和疫苗制備的迫切需要，本發(fā)明建立了哲羅鮭體細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，對促進我國冷水性魚類的漁業(yè)健康、 穩(wěn)定發(fā)展具有重要的實踐意義。本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。本發(fā)明方法可有效地增加細(xì)胞分裂次數(shù)，使得哲羅鮭體外細(xì)胞的實際分裂次數(shù)達(dá)到30次以上。


圖I為具體實施方式
i^一中培養(yǎng)鑒定的活細(xì)胞在可見光下的形態(tài)圖；圖2為具體實施方式
十一中培養(yǎng)鑒定的活細(xì)胞PI染色后熒光下的形態(tài)圖；圖3為具體實施方式
十一中培養(yǎng)鑒定的活細(xì)胞hoechst33342染色后突光下的形態(tài)圖；圖4為具體實施方式
^ 中的死細(xì)胞在可見光下的形態(tài)圖；圖5為具體實施方式
十一中培養(yǎng)鑒定的死細(xì)胞PI染色后熒光下的形態(tài)圖；圖6為具體實施方式
^ 中培養(yǎng)鑒定的死細(xì)胞hoechst33342染色后突光下的形態(tài)圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，按以下步驟進行一、 斷頸處死哲羅鮭；二、采集哲羅鮭魚體組織，將組織放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL 鏈霉素的D-Hanks緩沖液中浸泡20秒，再用D-Hanks緩沖液沖洗3遍，得清洗后的組織；三、 原代培養(yǎng)組織塊將清洗后的組織剪碎至O. 8 I. 2mm3的塊狀，然后將剪碎的組織塊移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使組織塊均勻地平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入O. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置于19°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，并向細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入8mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在19°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至組織塊長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的80%;四、細(xì)胞的原代培養(yǎng)取O. 5mL步驟三得到的原代培養(yǎng)后的組織塊放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于50 IOOrpm的搖床上消化，每5分鐘收集4mL上層消化液，移入預(yù)先加入ImL血清的離心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向組織塊中補加4mL胰蛋白酶消化液，然后將收集到的消化液和血清混合物于1000r/min 離心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，得懸浮液，調(diào)整懸浮液的細(xì)胞濃度至 IO5個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80% 90% ;五、體細(xì)胞傳代培養(yǎng)然后消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)混合液體于1000r/min離心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至IX IO4 5X IO4個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80%，再次傳代，即完成哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中斷頸處死哲羅鮭的具體方法為選擇體長為12 14cm的哲羅鮭，采用醫(yī)用尖頭鑷子插入哲羅鮭口中， 另一只手握住其魚體軀干部，采用背側(cè)移位斷頸處死。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二所述哲羅鮭魚體組織為肝臟、腎臟、鰭緣或吻端。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二中采集哲羅鮭魚體組織的具體方法為采用碘酒擦拭哲羅鮭魚體表一次，然后將哲羅鮭浸泡于體積濃度為75%的乙醇溶液中30秒，取出后用滅菌紗布吸干魚體表面，取全部或部分組織。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟三中第二次在19°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)期間，每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟三、步驟四和步驟五中所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素和質(zhì)量濃度為 20%的胎牛血清的B2培養(yǎng)基。其它與具體實施方式
一至五之一相同。本實施方式所述B2培養(yǎng)基可替換為M199培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或者 F12培養(yǎng)基。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟四中所述胰蛋白酶消化液為含有質(zhì)量濃度O. 25%的胰蛋白酶的D-Hanks緩沖液。其它與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟四中置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)期間每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。其它與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟五中置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)期間每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。其它與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟五中消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞的方法為用D-Hanks緩沖液將細(xì)胞豐度達(dá)到80% 90%的細(xì)胞培養(yǎng)瓶沖洗2遍后，加入ImL O. 25%胰蛋白酶-O. 01 % EDTA消化液，5分鐘后加入ImL血清終止消化。其它與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，按以下步驟進行 一、斷頸處死哲羅鮭；二、采集哲羅鮭魚體肝臟組織，將肝臟組織放入含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的D-Hanks緩沖液中浸泡20秒，再用D-Hanks緩沖液沖洗3遍，得清洗后的肝臟組織；三、原代培養(yǎng)組織塊將清洗后的肝臟組織用醫(yī)用滅菌剪刀剪碎至O. 8
I.2mm3的塊狀，然后將剪碎的肝臟組織塊移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使肝臟組織塊均勻地平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入O. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置于19°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，并向細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入8mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在19°C 的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至肝臟組織塊長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的80% ;四、細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取O. 5mL步驟三得到的原代培養(yǎng)后的肝臟組織塊放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于 50rpm的搖床上消化，每5分鐘收集4mL上層消化液，移入預(yù)先加入ImL血清的離心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向肝臟組織塊中補加4mL胰蛋白酶消化液，然后將收集到的消化液和血清混合物于1000r/min離心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，得懸浮液，調(diào)整懸浮液的細(xì)胞濃度至IO5個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80% ;五、體細(xì)胞傳代培養(yǎng)然后消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)混合液體于1000r/min離心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至I X IO4 5 X IO4個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80%，再次傳代，即完成哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)。對本實施方式方法培養(yǎng)得到的肝臟細(xì)胞進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，具體方法為1、將所培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞連同培養(yǎng)瓶在800倍微分干涉顯微鏡下觀察，依據(jù)細(xì)胞的形狀和大小區(qū)別細(xì)胞類型，將肝臟細(xì)胞為類成纖維型和類上皮細(xì)胞型以及其它細(xì)胞型。2、在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素和質(zhì)量濃度為20%的胎牛血清的B2培養(yǎng)基)內(nèi)加入I μ g/mL的Hoechst 33342和O. 5 μ g/mL的PI染色15分鐘，用D-Hanks緩沖液洗兩遍，再加入新細(xì)胞培養(yǎng)液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素和質(zhì)量濃度為20% 的胎牛血清的B2培養(yǎng)基)，在800倍500nm熒光顯微鏡下觀察，觀察肝細(xì)胞核質(zhì)比例、染色質(zhì)和核仁大小及生長狀態(tài)。其中，細(xì)胞核藍(lán)染色，細(xì)胞質(zhì)無色的為正常細(xì)胞，其細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例適當(dāng)，而且生長狀態(tài)良好；細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)紅色的為死亡細(xì)胞；細(xì)胞核高度藍(lán)染，伴有核仁分解，細(xì)胞質(zhì)無色的為凋亡細(xì)胞。本實驗培養(yǎng)鑒定的活細(xì)胞形態(tài)如圖1-3所示，圖I為可見光下的形態(tài)；圖2為PI染色后熒光下的形態(tài)，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，圖2中僅有一個細(xì)胞是死細(xì)胞， 見圖2中右上角亮點；圖3為hoechst33342染色后熒光下的形態(tài)，所有細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。本實驗培養(yǎng)鑒定的死細(xì)胞形態(tài)如圖4-6所示，圖4為可見光下的形態(tài)，圖5為PI染色后熒光下的形態(tài)，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，圖中僅有一個細(xì)胞是死細(xì)胞，圖6 為hoechst33342染色后熒光下的形態(tài)，所有細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光。說明本方法培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。對本實施方式方法培養(yǎng)得到的肝臟細(xì)胞進行細(xì)菌、真菌檢測，具體方法為將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)48h的細(xì)胞培養(yǎng)液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素和質(zhì)量濃度為20%的胎牛血清的B2培養(yǎng)基)以0. 5mL接種到IOmL大豆胰蛋白胨培養(yǎng)基(奧博星生物)和IOmL 麥芽汁培養(yǎng)液(奧博星生物)中，各2只，分別置于37°C和26°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周，另外設(shè)立陽性對照組和陰性對照組，陽性對照組將枯草芽孢桿菌186 (購自廣州市微生物研究所)和白假絲酵母菌(為白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2. 2086，購自廣州市微生物研究所)分別接種到大豆胰蛋白胨和麥芽汁培養(yǎng)液中，各2只，分別置于37°C和26°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周；陰性對照組將大豆胰蛋白胨和麥芽汁培養(yǎng)液各2只，分別置于37°C和26°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。兩周以后，陰性對照組4只培養(yǎng)基肉眼觀察無明顯變化，陽性對照組4只培養(yǎng)基肉眼觀察均出現(xiàn)渾濁為實驗有效。此時實驗組4支試管的任何一支如果出現(xiàn)混濁，說明感染細(xì)菌。如果實驗組4支試管均無明顯變化則可以確定沒有感染細(xì)菌。實驗結(jié)果陰性對照組4只培養(yǎng)基肉眼觀察無明顯變化，陽性對照組4只培養(yǎng)基肉眼觀察均出現(xiàn)渾濁，證明實驗有效。實驗組4支試管均無明顯變化，可以確定沒有感染細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，按以下步驟進行一、斷頸處死哲羅鮭；二、采集哲羅鮭魚體組織，將組織放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素的D-Hanks緩沖液中浸泡20秒，再用D-Hanks緩沖液沖洗3遍，得清洗后的組織；三、原代培養(yǎng)組織塊將清洗后的組織剪碎至O. 8 I. 2mm3的塊狀，然后將剪碎的組織塊移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使組織塊均勻地平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入O. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置于19°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，并向細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入8mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在19°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至組織塊長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的80%;四、細(xì)胞的原代培養(yǎng)取O. 5mL步驟三得到的原代培養(yǎng)后的組織塊放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于50 IOOrpm的搖床上消化，每5分鐘收集4mL 上層消化液，移入預(yù)先加入ImL血清的離心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向組織塊中補加4mL胰蛋白酶消化液，然后將收集到的消化液和血清混合物于1000r/min離心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，得懸浮液，調(diào)整懸浮液的細(xì)胞濃度至IO5個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80% 90% ;五、體細(xì)胞傳代培養(yǎng)然后消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)混合液體于1000r/min離心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至I X IO4 5 X IO4個/mL，接種8mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到80%，再次傳代，即完成哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟一中斷頸處死哲羅鮭的具體方法為選擇體長為12 14cm的哲羅鮭，采用醫(yī)用尖頭鑷子插入哲羅鮭口中，另一只手握住其魚體軀干部，采用背側(cè)移位斷頸處死。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟二所述哲羅鮭魚體組織為肝臟、腎臟、鰭緣或吻端。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟二中采集哲羅鮭魚體組織的具體方法為采用碘酒擦拭哲羅鮭魚體表一次，然后將哲羅鮭浸泡于體積濃度為75%的乙醇溶液中30秒，取出后用滅菌紗布吸干魚體表面，取全部或部分組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三中第二次在19°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)期間，每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三、步驟四和步驟五中所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素和質(zhì)量濃度為20% 的胎牛血清的B2培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟四中所述胰蛋白酶消化液為含有質(zhì)量濃度0. 25%的胰蛋白酶的D-Hanks緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟四中置于 19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)期間每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟五中置于 19°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)期間每48小時更換細(xì)胞培養(yǎng)液一次。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于步驟五中消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞的方法為用D-Hanks緩沖液將細(xì)胞豐度達(dá)到80% 90%的細(xì)胞培養(yǎng)瓶沖洗2遍后，加入ImL 0. 25%胰蛋白酶-0. 01 % EDTA消化液，5分鐘后加入ImL血清終止消化。
全文摘要
一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，涉及一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。方法一、斷頸處死哲羅鮭；二、采集哲羅鮭魚體組織；三、原代培養(yǎng)組織塊；四、細(xì)胞的原代培養(yǎng)；五、體細(xì)胞傳代培養(yǎng)，即完成哲羅鮭體細(xì)胞體外培養(yǎng)。本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。本發(fā)明方法可有效地增加細(xì)胞分裂次數(shù)，使得哲羅鮭體外細(xì)胞的實際分裂次數(shù)達(dá)到30次以上。
文檔編號C12N5/071GK102604887SQ20121007853
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者劉紅柏, 盧彤巖, 李紹戊, 王荻, 趙吉偉, 郭振華 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所