專利名稱：基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
核酸適配體(aptamer)是一類體外人工篩選出來的DNA或RNA寡核苷酸序列，可以高效、專一地識別其配體(A. D. Ellington, J. ff. Szostak, Nature 1990, 346,818-822)，在臨床診斷和疾病治療領(lǐng)域成為越來越重要的分子工具。核酸適配體是一系列單鏈核酸分子，能夠與特異靶分子相結(jié)合，特異性如同抗體一樣，對可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識別能力和高度的親和力。核酸適配體與靶分子相互作用的基礎(chǔ)是空間結(jié)構(gòu)的互補，在結(jié)合靶分子前后核酸適配體通常會有顯著的結(jié)構(gòu)變化這一特性廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、熒光、石英晶體微天平等信號檢測手段。近年來，基于核酸適配體的比色策略發(fā)展迅速，人們可以直 接用肉眼實現(xiàn)對靶分子的直接檢測。核酸適配體具有易于合成、化學(xué)穩(wěn)定性高和目標(biāo)分子范圍的特點。分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)因具有靈敏度高、特異結(jié)合性好、靶分子不用標(biāo)記無需分離等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和生物分析領(lǐng)域。分子信標(biāo)中最常用的淬滅基團(tuán)是DABSYL、TMARA等有機(jī)淬滅劑，這些淬滅劑可以有效淬滅大部分的熒光素，但是對于不同的熒光素的淬滅效率差異很大，對于長波長發(fā)射的熒光素例如Cy5，Texas Red等的淬滅效果就很差。納米金具有高的消光系數(shù)和較寬的光譜吸收特性，它比常規(guī)有機(jī)發(fā)光團(tuán)分子的消光系數(shù)高 3 5 個數(shù)量級(Jin, R. ; ffu, G. ; Li, Z. ; Mirkin, C. A. ; Schatz, G. C·，J. Am. Chem. Soc. 2003，1643-54)。納米金作為信號傳導(dǎo)載體在生物技術(shù)和納米技術(shù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。Fan等發(fā)現(xiàn)納米金可以淬滅聚荷陽離子的突光，Stern-Volmer常數(shù)可達(dá)10n/M，比小分子熒光淬滅劑提高了 9-10個數(shù)量級。近年來，納米金作為淬滅基團(tuán)在納米金一熒光素復(fù)合物體系中理論模型、淬滅效率以及實際應(yīng)用的研究越來越多。將納米金應(yīng)用到分子信標(biāo)中，與常規(guī)淬滅基團(tuán)DABCYL相比，納米金可以在可見到近紅外的波長范圍內(nèi)，有效淬滅各種熒光染料，而且金顆粒在較低的離子強度條件下吸收效果較好，所以用納米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中分子信標(biāo)在檢測長波長發(fā)射時靈敏度和特異性降低等問題，提供一種基于納米金和適配體的小分子探針。本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種基于納米金和適配體的小分子探針的制備方法。
本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種包括基于納米金和適配體的小分子探針的試劑盒。本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，在第一個方面，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是基于納米金和適配體的小分子探針，包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，其特征在于，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。優(yōu)選的，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6_10個長度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補雜交。 優(yōu)選的，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，所述組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段為3種，與其互補雜交的適配體為3種。優(yōu)選的，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，包括但不限為-R0X，-FAM或-Cy5。優(yōu)選的，所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離控制在2-3納米。巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基(-SH)修飾且在該末端有6-10個長度的胸腺嘧啶T作為間隔，標(biāo)記有熒光基團(tuán)的核酸適配體與所述巰基修飾DNA片段的間隔部分之外的堿基互補雜交，通過間隔的堿基數(shù)目控制所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離。優(yōu)選的，所述小分子探針，包括至少下列一對熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段
與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示AA:5’ -AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 PA: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’
與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示AK:5’ --TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補的 DNA 片段如 SEQ ID No. 5 所示 PK: 5’ -CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’
與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示AC:5’一AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補的DNA片段如SEQ ID No. 6 所示 PC: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3，；
上述的三種適配體的5’端連接有-R0X，-FAM或-Cy5熒光基因中的一種，且各個適配體的熒光基因各不相同。在第二個方面，本發(fā)明提供了基于納米金和核酸適配體的小分子探針的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟
(1)準(zhǔn)備與核酸適配體互補的巰基修飾的DNA片段及納米金顆粒，還加入了為核酸適配體I. 5-2. 5倍摩爾濃度的10個胸腺嘧啶T，通過金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段；
(2)準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體，將等摩爾量的核酸適配體與步驟(I)制備的納米金-DNA片段混合得到所述基于納米金和核酸適配體的小分子探針。優(yōu)選的，在第二個方面的制備方法，所述步驟(I)為將一定量的巰基修飾的DNA和納米金混合，得到納米金-DNA片段，過夜后加入一定濃度的PBS，離心去掉未組裝到納米金表面的DNA片段。優(yōu)選的，在第二個方面的制備方法，步驟(2)加入的胸腺嘧啶T為核酸適配體2倍摩爾濃度的胸腺嘧啶。優(yōu)選的，在第二個方面的制備方法，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，在第二個方面的制備方法，在最終的納米金-DNA片段混合溶液中，巰基修飾的DNA : 10個胸腺嘧啶T :納米金的濃度為1:2: 10000。在第三個方面，本發(fā)明提供了一種包括基于納米金和適配體的小分子探針的試劑 盒，所述試劑盒，包括納米金顆粒，還包括組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。優(yōu)選的，在第三個方面的試劑盒，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個長度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補雜交。優(yōu)選的，在第三個方面的試劑盒，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，在第三個方面的試劑盒，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，包括但不限為-R0X，-FAM或-Cy5。優(yōu)選的，在第三個方面的試劑盒，包括至少下列一對熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段
與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ -R0X-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’
與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ak: 5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA片段如SEQ IDNo. 5 所示 Pk: 5，-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’
與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示Ae:5’ _Cy5_AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。在第四個方面，本發(fā)明提供了基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法，其特征在于，將所述小分子探針加入待測溶液，室溫放置1-24小時然后測量熒光信號的變化。優(yōu)選的，在第四個方面的使用方法，所述待測溶液還加入了待測小分子類似物。為了驗證該方法的特異性，即該探針能夠特異性檢測靶分子，而其類似物分子不會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，所以在實驗過程中加入了小分子的類似物，比如腺苷A的類似物，腺苷G，T，C。鉀離子K+的類似物L(fēng)i+，Na+。可卡因的類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)。本專利申請中的術(shù)語“適配體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，指的是能夠與特定的靶分子結(jié)合的單鏈核酸，包括DNA或RNA。本發(fā)明使用的核酸適配體5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)。本發(fā)明中，三條適配體aptamer鏈用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，與納米金表面組裝的互補DNA雜交，一起構(gòu)成納米金多色探針。未檢測反應(yīng)前，由于適配體熒光基團(tuán)靠近納米金表面，其熒光被納米金淬滅，信號水平很低。當(dāng)存在其中可與其中一種適配體特異性結(jié)合的小分子時，適配體就與小分子結(jié)合，并離開納米金表面，因此，納米金的淬滅作用不發(fā)揮作用，該適配體釋放強烈的熒光信號。本專利申請中的術(shù)語“熒光基團(tuán)”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，能夠標(biāo)記到DNA上的熒光基團(tuán)都可以，但是三種不同的熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射峰位置需要相差50 nm以上，避免發(fā)射光譜的疊加。修飾好的熒光基團(tuán)的核酸適配體可以從生物公司購買，但在熒光基團(tuán)的選擇上要求各個核酸適配體熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長不能有重疊。因此也不宜采用磷
光基團(tuán)。本專利申請中的術(shù)語“巰基修飾DNA片段”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，就是在實驗采用的DNA片段的末端標(biāo)記有巰基。本發(fā)明中的探針設(shè)計，先將幾種不同序列巰基修飾的DNA片段(單鏈)組裝在納米金顆粒上，這幾條DNA片段單鏈可以分別與其特定需要的適配體(aptamer)互補雜交。且適配體鏈用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，與納米金表面組裝的互補DNA雜交，一起構(gòu)成納米金多色探針。由于熒光基團(tuán)靠近納米金表面，其信號很低，只要存在其中一種小分子時，aptamer遠(yuǎn)離納米金表面，釋放強烈熒光信號
相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是
I.本發(fā)明的小分子探針具有相對較高的檢測靈敏度，納米金具有極高的淬滅能力，而且金顆粒在較低的離子強度條件下吸收效果較好，所以用納米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。特異性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高，有效減少了假陽性結(jié)果。由于本發(fā)明采用適配體技術(shù)，因而能保持結(jié)果的正確，大大降低了假陽性結(jié)果出現(xiàn)的幾率，使得本發(fā)明適宜實際推廣。本發(fā)明的方法可以利用未經(jīng)精度提純的待測樣品直接檢測而仍舊能保持實用的靈敏度和特異性，不會出現(xiàn)適配體與靶分子(MAM mRNA)和其他非特異核酸序列互相干擾的情況。操作簡單，檢測時間短。由于本發(fā)明小分子探針的檢測方法實際上只需要將小分子探針和帶檢測的樣品簡單混合放置后，然后測量熒光信號的變化。除去檢測步驟，其他步驟操作簡單、方便，耗時短，無需復(fù)雜儀器及特別技巧，尤其是該方法可以利用未經(jīng)精度提純的待測樣品直接檢測這樣極大地方便了檢測操作，節(jié)省了試劑使用并加快了檢測進(jìn)程，可以推廣進(jìn)行實際的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。檢測分子種類多，本發(fā)明的納米金(AuNPs)探針，探針結(jié)合適配體技術(shù)，該探針將熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及其巰基修飾的互補序列共組裝到納米金表面，可以在均相體系中檢測多種小分子，該策略為快速檢測多種小分子提供一種潛在的方法。產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，儲存條件要求不高。適配體比蛋白抗體更穩(wěn)定,不易變性,容易長時間保存，這造成產(chǎn)品的有效期將大大延長。



下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述
圖I為基于納米金和適配體的小分子探針的設(shè)計以及檢測原理示意圖。
圖2A為本發(fā)明小分子探針對腺苷A檢測結(jié)果及空白對照；圖2B為本發(fā)明小分子探針對腺苷A及類似物腺苷(T，G, C)檢測的信號對比。圖3A為本發(fā)明小分子探針對鉀離子K+檢測結(jié)果及空白對照；圖38為本發(fā)明小分子探針對鉀離子K+及類似物離子(Li，Na)檢測的信號對比。
圖4A為本發(fā)明小分子探針對可卡因cocaine檢測結(jié)果及空白對照；圖4B為本發(fā)明小分子探針對可卡因及類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)檢測的信號對比。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。以下將以舉例形式進(jìn)行說明，如有未詳盡之處，可以參見常用的實驗手冊，如《分子克隆實驗手冊》以及所用試劑和儀器的廠商說明書。其中，所有化學(xué)試劑均采用分析級，實驗用水經(jīng)Milli-XQ過濾，各試劑均和材料可以商用渠道獲得，腺嘌呤(Α)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)購自sigma公司，熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體以及互補DNA片段購自大連TKARA公司，各種金屬離子購自國藥集團(tuán)，納米金由本實驗室合成。
實施例實施例I納米金-DNA片段的制備
1.I準(zhǔn)備納米金顆粒
納米金的合成，高濃度納米金為檸檬酸還原法制備后用離心法濃縮制得(Hurst, S.J. ; Lytton-Jean, A. K. ; Mirkin, C. A. , Anal Chem 2006, 8313-8. )。4 保存，使用時根據(jù)具體需要進(jìn)行稀釋或濃縮，合成的納米金為13納米。準(zhǔn)備三條分別與腺苷、鉀離子以及可卡因適配體互補的巰基修飾的DNA片段，直接從商業(yè)渠道獲得。通過金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段
將三條分別與腺苷、鉀離子以及可卡因的適配體互補的巰基修飾的DNA以及有利于DNA雜交的巰基修飾的10個T構(gòu)成的DNA (SH-TlO)和10 nM的納米金混合，核酸體DNA終濃度為I μ M，而SH-TlO的終濃度為2 μ Μ。過夜后加入濃度為O. I M的PBS，pH值為7. 4，采用12000 rpm速度，在4度下離心3次，每次用O. I M的PBS懸浮，去掉未組裝到納米金表面的DNA。實施例2熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體及納米金和核酸適配體的小分子探針的制備
2.I準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺苷、鉀離子以及可卡因適配體，直接從商業(yè)渠道獲得。能夠標(biāo)記到DNA上的熒光基團(tuán)都可以，但是三種不同的熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射峰位置需要相差50 nm以上，避免發(fā)射光譜的疊加。將熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺苷、鉀離子以及可卡因的適配體按等摩爾量與實施例I中組裝好DNA片段的納米金溶液混合，在室溫下放置一夜。適配體與上述DNA片段雜交。離心去掉多余的適配體，得到需要的小分子探針。實施例3使用本發(fā)明的基于納米金和適配體的小分子探針的檢測取實施例2中制備好的小分子探針，同時加入10 mM的A、100 mM KCl和I mM可卡因，室溫放置I小時，空白對照是等量的去離子水，然后用相應(yīng)波長激發(fā)測量其熒光信號。為了考察該探針的特異性，實驗過程中同時加入各種檢測物的類似物，例如腺苷A的類似物T、C、G，K+的類似物L(fēng)i+、Na+以及可卡因的類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)，各自濃度與其類似物相同，如圖2- 4所示，可以看到，該探針的選擇性非常好。上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求
1.基于納米金和適配體的小分子探針，包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，其特征在于，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個長度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離控制在2-3納米。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有各不相同的熒光基團(tuán)，為-ROX，-FAM或 _Cy5。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段為3種，與其互補雜交的適配體為3種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述小分子探針，包括至少下列一對熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段 與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ - AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’ 與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ακ:5’ -TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補的 DNA 片段如 SEQ ID No. 5 所示 Pk: 5’ -CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’ 與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示A。: 5’- AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’ ； 上述的三種適配體的5’端連接有-ROX，-FAM或-Cy5熒光基因中的一種，且各個適配體的熒光基因各不相同。
8.制備權(quán)利要求1-7所述的基于納米金和核酸適配體的小分子探針的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)準(zhǔn)備與核酸適配體互補的巰基修飾的DNA片段及納米金顆粒，還加入了為核酸適配體I. 5-2. 5倍摩爾濃度的10個胸腺嘧啶T，通過金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段； (2)準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體，將等摩爾量的核酸適配體與步驟(I)制備的納米金-DNA片段混合得到所述基于納米金和核酸適配體的小分子探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)為將一定量的巰基修飾的DNA和納米金混合，得到納米金-DNA片段，過夜后加入一定濃度的PBS，離心去掉未組裝到納米金表面的DNA片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)加入的胸腺嘧啶T為核酸適配體2倍摩爾濃度的胸腺嘧啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在最終的納米金-DNA片段混合溶液中，巰基修飾的DNA : 10個胸腺嘧啶T :納米金的濃度為1:2: 10000。
13.一種基于納米金和適配體的小分子探針的試劑盒，所述試劑盒，包括納米金顆粒，還包括組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個長度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的突光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補雜交。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，為-ROX，-FAM或-Cy5。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，包括至少下列一對熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段 與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ -ROX-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’ 與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ak: 5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補的DNA片段如SEQ IDNo. 5 所示 Pk: 5，-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’ 與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示Ae:5’ _Cy5_AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。
18.基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法，其特征在于，將所述小分子探針加入待測溶液，室溫放置1-24小時然后測量熒光信號的變化。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法，本發(fā)明的小分子探針包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。本發(fā)明的小分子探針檢測時間短，操作簡單，特異性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高，有效減少了假陽性結(jié)果。由于本發(fā)明采用適配體技術(shù)，具有相對較高的檢測靈敏度，而且能同時檢測多種分子。
文檔編號C12N15/11GK102676508SQ20121011811
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者宋世平, 樊春海, 黃慶 申請人:華森新科(蘇州)納米技術(shù)有限公司