專利名稱：一種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域，具體是ー種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法。(ニ)現(xiàn)有技術酪酸菌即丁酸梭菌(Clostridium butyrium )是歸屬于梭菌屬的革蘭陽性厭氧芽胞桿菌，存在于土壤、動物和人體的腸道中，同雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及糞鏈球菌一祥，是調節(jié)人體及動物體腸道微生態(tài)平衡的有益菌。酪酸菌最顯著的生物特性是能與雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌共生，并促進其發(fā)育，特別是它能產生促進雙歧桿菌發(fā)育的因子。與雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌不同的是，由于酪酸菌具有芽抱，因而對外界環(huán)境有較強的抵抗力，把它加熱至90°C 10分鐘、100°C 5分鐘不會失活，在PH I. 0-5.O的環(huán)境中仍能存活，在PH 4. 0-9. 8的環(huán)境中能適合其發(fā)育生長，其固體活菌制劑在室溫、干燥情況下保存具有良好的穩(wěn)定性，保存2年以上，未見活菌顯著減少。酪酸菌制劑是目前國內微生態(tài)領域開發(fā)的又一新產品。酪酸菌是ー種厭氧的芽胞桿菌，由于它具有芽胞，因而具有高活性、高穩(wěn)定性，同時它又是對常用抗生素具有耐受性的腸道正常菌群，可糾正腸道內的菌群紊亂，調節(jié)腸道微生態(tài)平衡，是ー種集乳酸菌和芽胞桿菌優(yōu)點于一身的活菌制劑，在臨床和實際應用方面有其獨到之處。隨著酪酸菌新生物制品四類新藥的研制成功，酪酸菌的ー些生物特性和藥理作用，受到國內研究者的普遍關注。將酪酸菌的培養(yǎng)液分離、鑒別，發(fā)現(xiàn)它含有葡萄糖、麥芽糖等6種糖，丁酸、乳酸和醋酸等有機酸，蛋白質分解酶等經透析仍不會減弱效力的蛋白質。其中以低聚糖具有最強的雙歧桿菌増殖促進作用，是促進雙歧桿菌發(fā)育的因子。酪酸菌培養(yǎng)液中小分子的有機酸可抑制常見致病菌的生長、定植。國內的許多研究報告已證實酪酸菌對大腸埃希菌、沙門菌等常見腸道致病菌具有拮抗作用。酪酸菌及其制劑主要應用于以下幾個方面
I、作為藥物使用
能夠治療腸菌群紊亂、腹瀉、腸炎，預防腸癌。另外酪酸菌也可作為腸炎、肝病、化放療造成的免疫力下降、菌群失調的良好輔助治療藥物。2、作為獸藥使用
酪酸菌可用以治療動物腸道感染和腸功能異常。酪酸菌可增加動物腸內酪酸、醋酸等短鏈脂肪酸生成量，可促進排便，可抑制腸道腐敗產物氨和胺類的產生；可抑制霍亂弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、出血性大腸桿菌以及引起偽膜性腸炎的魏氏梭菌的繁殖。3、用作飼料添加劑
酪酸菌能單獨作為飼料添加劑使用，也能與乳酸菌、芽孢菌、雙歧桿菌等益生菌復配使用，能增強該類產品的功效。在提高動物免疫力、抗病カ及降低豬的料肉比方面都有顯著效果目前。酪酸菌微生態(tài)制劑的生產主要是利用其活的芽孢體，獲得大量的酪酸菌芽孢體或活菌體并保持它們的活性是酪酸菌制劑生產的關鍵，芽孢數(shù)目越多越好。酪酸菌的生產方法都是采用分批液態(tài)深層發(fā)酵法培養(yǎng)酪酸菌菌體和芽孢，然后分離菌體及芽孢，并將其做成制劑。目前酪酸菌制劑比較流行的生產方法是采用各自取得的酪酸菌生產菌種，使用三級種子培養(yǎng)的方法，發(fā)酵培養(yǎng)酪酸菌活菌體，采用管式離心機分離菌體，采用凍干機冷凍干燥的方法制備酪酸菌活菌制劑。目前國內外有關酪酸菌的文獻及專利很多，下述專利US5.292523(1994)、US4.892 731 (1990)、7P63_146825(1986)、JP6I-6625 (1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)、 CNl144873C、 CNl184308C CN 100523171 C、 CN1403567 A 、CN1463934A、CN1385402A、CN 101965910 A、CN 101032527 A 涉及丁酸梭菌 活菌劑的制備和用途，酪酸菌的培養(yǎng)方法均采用間歇式分批發(fā)酵法，都沒有涉及采用連續(xù)發(fā)酵法來制備酪酸菌活菌制劑的方法。分批發(fā)酵的缺點是人力、物力、動カ消耗較大；生產周期較長，由于分批發(fā)酵時菌體有一定的生長規(guī)律，都要經歷延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期，而且每批發(fā)酵都要經菌種擴大發(fā)酵、設備沖洗、滅菌等階段；生產效率低，生產上常以體積生產率(以每小時每升發(fā)酵物中菌體數(shù)量或代謝產物的g數(shù)來表示)來計算效率,在分批發(fā)酵過程中，必須計算全過程的生產率，即時間不僅包括發(fā)酵時間，而且也包括放料、洗罐、加料、滅菌等時間。(Ξ)

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是要提供ー種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法；本發(fā)明方法采用連續(xù)發(fā)酵法，使總發(fā)酵周期縮短，降低了染菌機會，減少了發(fā)酵風險和設備損失，節(jié)約成本，同時菌體生長的穩(wěn)定期較長，菌體數(shù)量大，芽孢轉化率高，有效提高了發(fā)酵產率。本發(fā)明的ー種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法，由下述步驟組成
①ー級種子培養(yǎng)將配制好的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基，分別置于三角瓶A和三角瓶B中，于121°C下蒸汽滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C ;再取酪酸菌試管斜面菌種，分別接種于上述已滅菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接種時間延遲10-14h;將三角瓶A和B于34-37°C厭氧培養(yǎng)12-16h ;即得一級種子A和一級種子B;
②ニ級種子培養(yǎng)將配制好的酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基分別置于種子罐A和種子罐B中，于121°C蒸汽實罐滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C ;再將步驟①培養(yǎng)好的一級種子A和ー級種子B，以5%-10%的接種量分別接種于種子罐A和種子罐B中，其中種子罐B比種子罐A接種時間延遲10-14h，以上種子在34-37°C厭氧培養(yǎng)12_16h，即得ニ級種子A和ニ級種子B;培養(yǎng)過程中間歇攪拌；上述各級種子培養(yǎng)完畢均應檢查其生長狀態(tài)及純粹試驗；
③連續(xù)發(fā)酵
a.將配制好的酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基分別置于發(fā)酵罐A和發(fā)酵罐B及補料罐C、補料罐D中，于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C ；
b.先將步驟②中培養(yǎng)得到的ニ級種子A以5%-10%的接種量接種于發(fā)酵罐A中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在34-37°C厭氧培養(yǎng)20_26h，發(fā)酵過程中間歇攪拌；
c.發(fā)酵罐A接種培養(yǎng)10-14h后，將步驟②中培養(yǎng)得到的ニ級種子B以5%-10%的接種量接種于發(fā)酵罐B中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04 MPa,在34_37°C厭氧培養(yǎng)10_12h，發(fā)酵過程中間歇攪拌；
d.發(fā)酵罐B培養(yǎng)完畢后，將其培養(yǎng)液通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐A中，使發(fā)酵罐A裝料系數(shù)達到80%為止，再將補料罐C中的培養(yǎng)基通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐B中，使發(fā)酵罐B裝料系數(shù)達到80%為止；e.當發(fā)酵罐A發(fā)酵培養(yǎng)20-26h后，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液以O.084v/h的速度連續(xù)放料到離心機中離心，收集菌體；同時將發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液以O. 084v/h的速度通過滅菌管道壓入到發(fā)酵罐A中，再將補料罐C中的培養(yǎng)基以O. 084v/h的速度通過滅菌管道壓入到發(fā)酵罐B中，維持發(fā)酵罐B的體積，保持物料的平衡；補料罐D可隨時接替補料罐C，補料罐C和D交替使用，向發(fā)酵罐B中補充培養(yǎng)基以滿足發(fā)酵罐B的體積要求，以形成補料罐C或D —發(fā)酵罐B —發(fā)酵罐A的多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，持續(xù)培養(yǎng)酪酸菌菌體；所述的V為發(fā)酵罐A的實際裝料體積；
f.從發(fā)酵罐A開始放料至放料完畢，維持時間為140-360h;最后的結束順序是先放完補料罐中的培養(yǎng)基至發(fā)酵罐B中，再放完發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液至發(fā)酵罐A中，最后放完發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液至離心機中；
④制劑收集菌體，得濕菌泥，按濕菌泥重量的5%添加保護劑，再按濕泥重量2-5倍比例加入玉米淀粉，混合制粒，置沸騰床內，以氮氣為氣源進行沸騰干燥，干燥后顆粒經粉碎，過60目篩，得菌粉；再與菌粉重量2-10倍的玉米淀粉混合，即得本發(fā)明的酪酸菌制劑成品；要求每克成品中酪酸菌活菌數(shù)不少于I. OX IO9個；
上述步驟中使用的酪酸菌種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基、保護劑的組成分別如下
一級種子培養(yǎng)基葡萄糖2. 0% 2. 5%、牛肉膏O. 5% I. 5%、蛋白胨I. 0% 2. 5%、磷酸氫ニ鉀O. 02% O. 05%、氯化鈉O. 05% O. 2%、硫酸鎂O. 02% O. 2%、水93% 96· 9%,培養(yǎng)基的PH 6. 0 7. 5;
ニ級種子培養(yǎng)基硫酸銨O. 49ΓΟ. 8%、葡萄糖2. 59Γ3. 0%、酵母浸膏O. 5% I. 8%、蛋白胨O. 5% I. 5%、碳酸鈣O. 1% 0· 3%、磷酸氫ニ鉀O. 02% O. 15%、氯化鈉O. 05% 0· 15%、硫酸鎂 O. 02% "O. 05%、水 92. 45% 95. 7%,培養(yǎng)基的 PH 6. 0 7· 5;
發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基硫酸銨I. 59Γ2. 0%、葡萄糖4.09Γ5. 0%、豆粉水解液
6.0% 8. 0%、酵母粉O. 5% L 0%、磷酸氫ニ鉀O. 02% O. 15%、硫酸錳O. 002% O. 005%、硫酸鎂 O. 02% 0.15%、、碳酸鈣0· 4%"0. 6%、水 81. 45% 90. 4%，培養(yǎng)基的 PH 6. 0 7. 5 ；
保護劑海藻糖60%、蔗糖38%、維生素C2%;
上述ー級、ニ級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基，保護劑中的原料用量均為重量百分比；配制時保證所用原料的重量百分比之和為100%。本發(fā)明方法是以一定的速度向發(fā)酵罐內添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內的液量維持恒定，使得酪酸菌在穩(wěn)定狀態(tài)下生長，穩(wěn)定狀態(tài)可以有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)期。在穩(wěn)定的狀態(tài)下，酪酸菌所處的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物濃度、產物濃度、P H值等都能保持恒定，酪酸菌的菌體的濃度及其比生長速率也可維持不變，還可以根據(jù)需要來調節(jié)生長速度，提高酪酸菌芽孢體的轉化率，控制芽孢體轉化率在95%以上。這樣可充分利用原料，延長菌體生長的穩(wěn)定期，得到更多的芽孢體。采取連續(xù)發(fā)酵的方式可以減少設備的投入數(shù)量，能夠更有效地實現(xiàn)機械化和自動化，降低勞動強度；減少設備清洗。準備和滅菌等非生產占用時間，提高設備利用率，節(jié)省勞動カ和工時；由于滅菌次數(shù)減少，使測量儀器探頭的壽命得以延長；容易對過程進行優(yōu)化，有效地提高發(fā)酵產率。在目前發(fā)酵設備的制作エ藝水平和自動控制水平越來越高的條件下，已經能夠克服連續(xù)發(fā)酵法帶來的染菌問題，提高產品的生產效率，降低總的生產成本。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下特點
1.本發(fā)明采用多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，比單罐連續(xù)發(fā)酵在芽孢率上有較大提高，在發(fā)酵罐B培養(yǎng)過程中使酪酸菌處在對數(shù)生長期，菌體大量繁殖，在發(fā)酵罐A培養(yǎng)過程中酪酸菌處于穩(wěn)定期，便于芽孢的產生。從發(fā)酵罐A放出的培養(yǎng)液中菌落數(shù)大于I. O X IO9個/ml，芽孢率在95%以上，整個生產過程持續(xù)穩(wěn)定；
2.本發(fā)明方法不受菌種來源限制，本方法中所涉及的丁酸梭菌菌種保藏編號為CGMCC1. 336，可從中國普通微生物保藏中心(CGMCC)獲得；
3.本發(fā)明采用連續(xù)發(fā)酵法來制備酪酸菌，比常用的三級種子培養(yǎng)，分批發(fā)酵法生產酪酸菌，減少了種子培養(yǎng)的環(huán)節(jié)，縮短了總發(fā)酵周期，降低了染菌機會，減少了發(fā)酵風險和設 備投資，以5m3發(fā)酵系統(tǒng)為例，現(xiàn)有方法每天放罐兩個罐批，每月總發(fā)酵體積240m3，至少需要配備兩臺50L —級種子罐、兩臺500L ニ級種子罐、兩臺5m3發(fā)酵罐，至少需要配備4臺150型離心機。毎月至少需要進60批次的三角瓶種子、60批次的ー級種子罐、60批次的ニ級種子罐、60批次的發(fā)酵罐，而采用本發(fā)明的連續(xù)發(fā)酵法來制備酪酸菌，5m3發(fā)酵系統(tǒng)達到相同的發(fā)酵噸位，則需要配備兩臺500L—級種子罐，兩臺5m3發(fā)酵罐，兩臺IOm3補料罐，2臺105型離心機。毎月只需要進2批次的三角瓶種子、2批次的ー級種子罐、2批次的發(fā)酵罐罐，28批次的補料罐，大大降低移種環(huán)節(jié)帶來的染菌機會，并且能夠減少大量的人力和設備投入，這在勞動カ成本不斷提升的今天，能夠節(jié)約很大的成本；
4.本技術由于采用連續(xù)放料的方式，可以減少菌體分離環(huán)節(jié)管式離心機的數(shù)量；
5.本發(fā)明以氮氣為氣源進行沸騰干燥(氮氣經除濕循環(huán)使用)，保證了酪酸菌的活菌數(shù)目。㈣
具體實施例方式 以下實施例均以體積為5m3發(fā)酵罐為例說明 實施例I
本實施例中的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基的原料組成是葡萄糖2.0%、牛肉膏O. 5%、蛋白胨I. 0%、磷酸氫ニ鉀O. 02%、氯化鈉O. 05%、硫酸鎂O. 02%、水96. 41%，培養(yǎng)基的PH 6. 9。酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨O. 4%、葡萄糖2.5%、酵母浸膏
O.5%、蛋白胨O. 5%、碳酸鈣O. 1%、磷酸氫ニ鉀O. 02%、氯化鈉O. 05%、硫酸鎂O. 02%、水95. 91%，培養(yǎng)基的 PH 6. 5。酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨I. 5%、葡萄糖4. 0%、豆粉水解液6. 0%、酵母粉O. 5%、磷酸氫ニ鉀O. 02%、硫酸錳O. 002%、硫酸鎂O. 02%、、碳酸鈣O.4%、水 87. 55%,培養(yǎng)基的 PH 6. 5。保護劑的原料組成是海藻糖60%、蔗糖38%、維生素C 2%ο酪酸菌冷凍管菌種為丁酸梭菌菌種，保藏編號為CGMCC1. 336，可從中國普通微生物物保藏中心(CGMCC)獲得。本發(fā)明方法的エ藝步驟如下
I、ー級種子培養(yǎng)分別取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各4瓶，每瓶裝入已配制好的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基4L，分別于121°C蒸汽滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。取酪酸菌試管斜面菌種，接種于滅菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接種時間比三角瓶A延遲10h，在36°C厭氧培養(yǎng)12h,得一級種子A和一級種子B。
2、ニ級種子培養(yǎng)分別在500L種子罐A和種子罐B中加入已制好的酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基，A、B罐裝料系數(shù)均為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。分別將步驟I中培養(yǎng)好的一級種子A和一級種子B，以5%的接種量接種于種子罐A和B中，在35°C厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程中間歇式開攪拌；各級種子培養(yǎng)完畢均應檢查其生長狀態(tài)及純粹試驗，得ニ級種子A和ニ級種子B。3、連續(xù)發(fā)酵、
(I)分別將已滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基置于5m3發(fā)酵罐A和發(fā)酵罐B中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C。補料罐為C、D均為10m3，補料罐裝料系數(shù)為70%，將補料罐中的補料培養(yǎng)基于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C備用。(2)先將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子A以5%的接種量接種于發(fā)酵罐A中，控制罐壓O. 02MPa O. 04MPa，在36で厭氧培養(yǎng)20h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(3)發(fā)酵罐A接種培養(yǎng)IOh后，將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子B以5%的接種量接種于發(fā)酵罐B中，控制罐壓O. 02MPa^0. 04MPa，在36 °C厭氧培養(yǎng)10h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(4)發(fā)酵罐B培養(yǎng)完畢后，將其培養(yǎng)液通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐A中，使得發(fā)酵罐A裝料系數(shù)達到80%時停止，再將補料罐C中的培養(yǎng)基通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐B中，使得發(fā)酵罐B裝料系數(shù)達到80%時停止。(5)當發(fā)酵罐A中發(fā)酵培養(yǎng)20h后，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液以O. 084V/h的速度，即O. 336m3A的速度連續(xù)放料到離心機收集菌體。同時以相同的速度將發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐A中，再將補料罐C中的培養(yǎng)基以同樣的速度通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐B中，維持發(fā)酵罐A的體積，保持物料的平衡，補料罐D可隨時接替補料罐C，補料罐C和D交替使用，向發(fā)酵罐B中補充培養(yǎng)基以滿足發(fā)酵罐B的體積要求。這樣就形成了補料罐C或D —發(fā)酵罐B —發(fā)酵罐A的多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，持續(xù)培養(yǎng)酪酸菌菌體。(6)從發(fā)酵罐A開始放料至放料完畢，維持時間為140h ;最后的結束順序是先放完補料罐中的培養(yǎng)基至發(fā)酵罐B中，再放完發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液至發(fā)酵罐A中，最后放完發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液至離心機中。4、菌體收集采用高速管式離心機連續(xù)收集菌體,轉速16000r/min,獲得濕菌泥；菌泥放置在4°C冰柜中儲存，到一定量后拿出制粒。5、添加保護劑將菌泥稱重，按濕菌泥重量的5%添加保護劑。6、混合制粒將事先在125°C干燥4h的玉米淀粉，按照濕菌泥重量的2倍比例加入，進行混合制粒。7、沸騰干燥將步驟6所制作的菌粒放入沸騰床，以氮氣為氣源進行沸騰干燥(氮氣經除濕循環(huán)使用)，氮氣先經過10°c的表冷除濕，然后加溫到72°C。8、粉篩將步驟7干燥好的菌粒粉碎并過60目篩網(wǎng)。9、配料將步驟8制成的菌粉和事先在125°C干燥4h的玉米淀粉按重量比1:4的比例進行配料混合，即得本發(fā)明的酪酸菌制劑成品。10、成品檢驗此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌數(shù)為2. 8 X IO9個。
11、真空包裝出廠將制成的菌粉進行真空包裝，包裝后經抽樣進行全檢，合格后出廠。實施例2
本實施例中的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基的原料組成是葡萄糖2. 2%、牛肉膏I. 0%、蛋白胨I. 8%、磷酸氫ニ鉀O. 04%、氯化鈉O. 1%、硫酸鎂O. 1%、水94. 76%，培養(yǎng)基的PH 6. 9。酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨O. 6%、葡萄糖2.8%、酵母浸膏I. 0%、蛋白胨I. 0%、碳酸鈣O. 2%、磷酸氫ニ鉀O. 1%、氯化鈉O. 1%、硫酸鎂O. 03%、水94. 17%，培養(yǎng)基的PH 6.7。
酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨I. 7%、葡萄糖4. 5%、豆粉水解液7. 0%、酵母粉O. 8%、磷酸氫ニ鉀O. 1%、硫酸錳O. 003%、硫酸鎂O. 08%、、碳酸鈣O. 5%、水 85. 31%,培養(yǎng)基的 PH 6. 0-7. 5。保護劑的原料組成是海藻糖50%、蔗糖48%、維生素C 2%。酪酸菌冷凍管菌種為丁酸梭菌菌種，保藏編號為CGMCC1. 336，可從中國普通微生物物保藏中心(CGMCC)獲得。本發(fā)明方法的エ藝步驟如下
I、ー級種子培養(yǎng)分別取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各6瓶，每瓶裝入已配制好的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基4L，分別于121°C蒸汽滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。取酪酸菌試管斜面菌種，接種于滅菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接種時間比三角瓶A延遲llh，在36°C厭氧培養(yǎng)14h,得一級種子A和一級種子B。2、ニ級種子培養(yǎng)分別在500L種子罐A和種子罐B中加入已制好的酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基，A、B罐裝料系數(shù)均為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。分別將步驟I中培養(yǎng)好的一級種子A和一級種子B，以8%的接種量接種于種子罐A和B中，在35°C厭氧培養(yǎng)14h，培養(yǎng)過程中間歇式開攪拌；各級種子培養(yǎng)完畢均應檢查其生長狀態(tài)及純粹試驗，得ニ級種子A和ニ級種子B。3、連續(xù)發(fā)酵
(I)分別將已滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基置于5m3發(fā)酵罐A和發(fā)酵罐B中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C。補料罐為C、D均為10m3，補料罐裝料系數(shù)為70%，將補料罐中的補料培養(yǎng)基于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C備用。(2)先將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子A以8%的接種量接種于發(fā)酵罐A中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在36で厭氧培養(yǎng)23h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(3)發(fā)酵罐A接種培養(yǎng)Ilh后，將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子B以8%的接種量接種于發(fā)酵罐B中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在36 °C厭氧培養(yǎng)12h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(4)發(fā)酵罐B培養(yǎng)完畢后，將其培養(yǎng)液通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐A中，使得發(fā)酵罐A裝料系數(shù)達到80%時停止，再將補料罐C中的培養(yǎng)基通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐B中，使得發(fā)酵罐B裝料系數(shù)達到80%時停止。(5)當發(fā)酵罐A中發(fā)酵培養(yǎng)23h后，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液以O. 084V/h的速度，即O. 336m3A的速度連續(xù)放料到離心機收集菌體。同時以相同的速度將發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐A中，再將補料罐C中的培養(yǎng)基以同樣的速度通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐B中，維持發(fā)酵罐A的體積，保持物料的平衡，補料罐D可隨時接替補料罐C，補料罐C和D交替使用，向發(fā)酵罐B中補充培養(yǎng)發(fā)酵罐基以滿足發(fā)酵罐B的體積要求。這樣就形成了補料罐C或D —發(fā)酵罐B —發(fā)酵罐A的多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，持續(xù)培養(yǎng)酪酸菌菌體。(6)從發(fā)酵罐A開始放料至放料完畢，維持時間為240h ;最后的結束順序是先放完補料罐中的培養(yǎng)基至發(fā)酵罐B中，再放完發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液至發(fā)酵罐A中，最后放完發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液至離心機中。4、菌體收集采用高速管式離心機連續(xù)收集菌體,轉速>16000r/min,獲得濕菌泥；囷泥放直在4 C冰柜中儲存，到一定量后拿出制粒。5、添加保護劑將菌泥稱重，按濕菌泥重量的5%添加保護劑。
6、混合制粒將事先在125°C干燥4h的玉米淀粉，按照濕菌泥重量的3倍比例加入，進行混合制粒。7、沸騰干燥將步驟6所制作的菌粒放入沸騰床，以氮氣為氣源進行沸騰干燥(氮氣經除濕循環(huán)使用)，氮氣先經過10°c的表冷除濕，然后加溫到74°C。8、粉篩將步驟7干燥好的菌粒粉碎并過60目篩網(wǎng)。9、配料將步驟8制成的菌粉和事先在125°C干燥4h的玉米淀粉按重量比1:5的比例進行配料混合，即得本發(fā)明的酪酸菌活菌制劑的成品。10、成品檢驗此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌數(shù)為I. 8 X IO9個。11、真空包裝出廠將制成的菌粉進行真空包裝，包裝后經抽樣進行全檢，合格后出廠。實施例3
本實施例中的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基的的原料組成是葡萄糖2. 5%、牛肉膏I. 5%、蛋白胨2. 5%、磷酸氫ニ鉀O. 05%、氯化鈉O. 2%、硫酸鎂O. 2%、水93. 05%,培養(yǎng)基的PH 6. 8。酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨0.8%、葡萄糖3.0%、酵母浸膏I. 8%、蛋白胨I. 5%、碳酸鈣O. 3%、磷酸氫ニ鉀O. 15%、氯化鈉O. 15%、硫酸鎂O. 05%、水92. 25%，培養(yǎng)基的 PH 6. 5。酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基的原料組成是硫酸銨2. 0%、葡萄糖5. 0%、豆粉水解液8. 0%、酵母粉I. 0%、磷酸氫ニ鉀O. 15%、硫酸錳O. 005%、硫酸鎂O. 15%、、碳酸鈣O. 6%、水83. 09%,培養(yǎng)基的PH6. 4。保護劑的原料組成是海藻糖50%、蔗糖48%、維生素C 2%。酪酸菌冷凍管菌種為丁酸梭菌菌種，保藏編號為CGMCC1. 336，可從中國普通微生物物保藏中心(CGMCC)獲得。本發(fā)明方法的エ藝步驟如下
I、ー級種子培養(yǎng)分別取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各8瓶，每瓶裝入已配制好的酪酸菌ー級種子培養(yǎng)基4L，分別于121°C蒸汽滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。取酪酸菌試管斜面菌種，接種于滅菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接種時間比三角瓶A延遲10h，在36°C厭氧培養(yǎng)16h,得一級種子A和一級種子B。2、ニ級種子培養(yǎng)分別在500L種子罐A和種子罐B中加入已配制好的酪酸菌ニ級種子培養(yǎng)基，A、B罐裝料系數(shù)均為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C。分別將步驟I中培養(yǎng)好的一級種子A和一級種子B，以10%的接種量接種于種子罐A和B中，在35°C厭氧培養(yǎng)16h，培養(yǎng)過程中間歇式開攪拌；各級種子培養(yǎng)完畢均應檢查其生長狀態(tài)及純粹試驗，得ニ級種子A和ニ級種子B。3、連續(xù)發(fā)酵
(I)分別將已滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基置于5m3發(fā)酵罐A和發(fā)酵罐B中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%，于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C，補料罐C、D均為10m3，補料罐裝料系數(shù)為70%，將補料罐中的補料培養(yǎng)基于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C備用。(2)先將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子A以10%的接種量接種于發(fā)酵罐A中，控制 罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在36で厭氧培養(yǎng)26h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(3)發(fā)酵罐A接種培養(yǎng)IOh后，將步驟2中培養(yǎng)得到的ニ級種子B以10%的接種量接種于發(fā)酵罐B中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在36 °C厭氧培養(yǎng)16h，發(fā)酵過程中間歇式開攪拌。(4)發(fā)酵罐B培養(yǎng)完畢后，將其培養(yǎng)液通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐A中，使得發(fā)酵罐A裝料系數(shù)達到80%時停止，再將補料罐C中的培養(yǎng)基通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐B中，使得發(fā)酵罐B裝料系數(shù)達到80%時停止。(5)當發(fā)酵罐A中發(fā)酵培養(yǎng)26h后，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液以O. 084V/h的速度，即O. 336m3A的速度連續(xù)放料到離心機收集菌體。同時以相同的速度將發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐A中，再將補料罐C中的培養(yǎng)基以同樣的速度通過滅菌的管道壓入到發(fā)酵罐B中，維持發(fā)酵罐A的體積，保持物料的平衡，補料罐D可隨時接替補料罐C，補料罐C和D交替使用，向發(fā)酵罐B中補充培養(yǎng)基以滿足發(fā)酵罐B的體積要求。這樣就形成了補料罐C或D —發(fā)酵罐B —發(fā)酵罐A的多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，持續(xù)培養(yǎng)酪酸菌菌體。(6)從發(fā)酵罐A開始放料至放料完畢，維持時間為360h ;最后的結束順序是先放完補料罐中的培養(yǎng)基至發(fā)酵罐B中，再放完發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液至發(fā)酵罐A中，最后放完發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液至離心機中。4、菌體收集采用高速管式離心機連續(xù)收集菌體,轉速>16000r/min,獲得濕菌泥；囷泥放直在4 C冰柜中儲存，到一定量后拿出制粒。5、添加保護劑將菌泥稱重，按濕菌泥重量的5%添加保護劑。6、混合制粒將事先在125°C干燥4h的玉米淀粉，按照濕菌泥重量的4倍比例加入，進行混合制粒。7、沸騰干燥將步驟6所制作的菌粒放入沸騰床，以氮氣為氣源進行沸騰干燥(氮氣經除濕循環(huán)使用)，氮氣先經過10°c的表冷除濕，然后加溫到75°C。8、粉篩將步驟7干燥好的菌粒粉碎并過60目篩網(wǎng)。9、配料將步驟8制成的菌粉和事先在125°C干燥4h的玉米淀粉按重量比1:6的比例進行配料混合，即得本發(fā)明的酪酸菌活菌制劑的成品。10、成品檢驗此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌數(shù)為I. 3 X IO9個。11、真空包裝出廠將步驟8制成的菌粉進行真空包裝，包裝后經抽樣進行全檢，合格后出廠。
上述實施例中的ー級、ニ級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基，保護劑中的原料用量均為重量百分比。
權利要求
1. 一種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法，其特征在于由下述步驟組成 一級種子培養(yǎng)將配制好的酪酸菌一級種子培養(yǎng)基，分別置于三角瓶A和三角瓶B中，于121°C下蒸汽滅菌30分鐘，降溫冷卻至35°C;再取酪酸菌試管斜面菌種，分別接種于上述已滅菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接種時間延遲10-14h;將三角瓶A和B于34_37°C厭氧培養(yǎng)12_16h ;即得一級種子A和一級種子B; 二級種子培養(yǎng)將配制好的酪酸菌二級種子培養(yǎng)基分別置于種子罐A和種子罐B中，于121°C蒸汽實罐滅菌30分鐘，降溫冷卻至35 V ;再將步驟①培養(yǎng)好的一級種子A和一級種子B，以5%-10%的接種量分別接種于種子罐A和種子罐B中，其中種子罐B比種子罐A接種時間延遲10-14h，以上種子在34-37°C厭氧培養(yǎng)12_16h，即得二級種子A和二級種子B;培養(yǎng)過程中間歇攪拌；上述各級種子培養(yǎng)完畢均應檢查其生長狀態(tài)及純粹試驗； 連續(xù)發(fā)酵 a.將配制好的酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基分別置于發(fā)酵罐A和發(fā)酵罐B及補料罐C、補料罐D中，于121°C蒸汽實罐滅菌20分鐘，降溫冷卻至35°C ； b.先將步驟②中培養(yǎng)得到的二級種子A以5%-10%的接種量接種于發(fā)酵罐A中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04MPa，在34-37°C厭氧培養(yǎng)20_26h，發(fā)酵過程中間歇攪拌； c.發(fā)酵罐A接種培養(yǎng)10-14h后，將步驟②中培養(yǎng)得到的二級種子B以5%-10%的接種量接種于發(fā)酵罐B中，控制罐壓O. 02MPa-0. 04 MPa,在34_37°C厭氧培養(yǎng)10_12h，發(fā)酵過程中間歇攪拌； d.發(fā)酵罐B培養(yǎng)完畢后，將其培養(yǎng)液通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐A中，使發(fā)酵罐A裝料系數(shù)達到80%為止，再將補料罐C中的培養(yǎng)基通過滅菌好的管道壓入發(fā)酵罐B中，使發(fā)酵罐B裝料系數(shù)達到80%為止； e.當發(fā)酵罐A發(fā)酵培養(yǎng)20-26h后，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液以O.084v/h的速度連續(xù)放料到離心機中離心，收集菌體；同時將發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液以O. 084v/h的速度通過滅菌管道壓入到發(fā)酵罐A中，再將補料罐C中的培養(yǎng)基以O. 084v/h的速度通過滅菌管道壓入到發(fā)酵罐B中，維持發(fā)酵罐B的體積，保持物料的平衡；補料罐D可隨時接替補料罐C，補料罐C和D交替使用，向發(fā)酵罐B中補充培養(yǎng)基以滿足發(fā)酵罐B的體積要求，以形成補料罐C或D —發(fā)酵罐B —發(fā)酵罐A的多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式，持續(xù)培養(yǎng)酪酸菌菌體；所述的V為發(fā)酵罐A的實際裝料體積； f.從發(fā)酵罐A開始放料至放料完畢，維持時間為140-360h;最后的結束順序是先放完補料罐中的培養(yǎng)基至發(fā)酵罐B中，再放完發(fā)酵罐B中的培養(yǎng)液至發(fā)酵罐A中，最后放完發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液至離心機中； 制劑收集菌體，得濕菌泥，按濕菌泥重量的5%添加保護劑，再按濕泥重量2-5倍比例加入玉米淀粉，混合制粒，置沸騰床內，以氮氣為氣源進行沸騰干燥，干燥后顆粒經粉碎，過60目篩，得菌粉；再與菌粉重量2-10倍的玉米淀粉混合，即得本發(fā)明的酪酸菌制劑成品；要求每克成品中酪酸菌活菌數(shù)不少于I. OX IO9個； 上述步驟中使用的酪酸菌種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基、保護劑的組成分別如下一級種子培養(yǎng)基葡萄糖2. 0% 2. 5%、牛肉膏O. 5% I. 5%、蛋白胨I. 0% 2. 5%、磷酸氫二鉀O. 02% O. 05%、氯化鈉O. 05% O. 2%、硫酸鎂O. 02% O. 2%、水93% 96· 9%,培養(yǎng)基的PH 6. 0 7. 5 ； 二級種子培養(yǎng)基硫酸銨O. 49ΓΟ. 8%、葡萄糖2. 59Γ3. 0%、酵母浸膏O. 5% I. 8%、蛋白胨O. 5% I. 5%、碳酸鈣O. 1% 0· 3%、磷酸氫二鉀O. 02% O. 15%、氯化鈉O. 05% 0· 15%、硫酸鎂 O. 02% "O. 05%、水 92. 45% 95. 7%,培養(yǎng)基的 PH 6. 0 7· 5 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基硫酸銨I. 59Γ2. 0%、葡萄糖4.09Γ5. 0%、豆粉水解液·6.0% 8. 0%、酵母粉O. 5% L 0%、磷酸氫二鉀O. 02% O. 15%、硫酸錳O. 002% O. 005%、硫酸鎂 O. 02% 0.15%、、碳酸鈣0· 4%"0. 6%、水 81. 45% 90. 4%，培養(yǎng)基的 PH 6. 0 7. 5 ；保護劑海藻糖60%、蔗糖38%、維生素C2% ； 上述一級、二級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基，保護劑中的原料用量均為重量百分比；配制時保證所用原料的重量百分比之和為100%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種連續(xù)發(fā)酵法生產酪酸菌制劑的方法，其步驟為①一級種子培養(yǎng)；②二級種子培養(yǎng)；③連續(xù)發(fā)酵；④制劑；要求每克酪酸菌制劑成品中酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×109個；本發(fā)明方法是采用多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵的方式培養(yǎng)酪酸菌，即以一定的速度向發(fā)酵罐內添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度放出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內的發(fā)酵液體積維持恒定，使酪酸菌在穩(wěn)定狀態(tài)下生長，可有效延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)期，提高酪酸菌芽孢體的轉化率至95%以上，有效提高發(fā)酵產率；同時還可降低勞動強度，提高設備利用率，省時省力，降低總的生產成本。
文檔編號C12N1/20GK102660473SQ201210135950
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權日2012年5月4日
發(fā)明者丁立, 胡軍, 蔡翔, 陳從富 申請人:湖北綠雪生物產業(yè)有限公司