專利名稱：冬蟲夏草中國(guó)被毛孢合成代謝黃嘌呤核苷酸的酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的參與次黃嘌呤核苷酸出發(fā)合成代謝黃嘌呤核苷酸的MP脫氫酶，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏 草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價(jià)格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長(zhǎng)環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護(hù)蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴(yán)格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國(guó)內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國(guó)被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對(duì)蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國(guó)內(nèi)外已對(duì)蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。核苷類是蟲草最主要的活性物質(zhì)之一，其中嘌呤類核苷包括腺苷和鳥苷及它們的前體類物質(zhì)次黃嘌呤核苷(肌苷)和黃嘌呤核苷等。研究表明腺苷可作為心臟病治療藥物，還可用于診斷冠心病，其類似物具有抗病毒活性和抗腫瘤作用；肌苷可用于心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減少癥、視神經(jīng)萎縮和中心性視網(wǎng)膜炎等疾病的治療，能預(yù)防及解除由血防藥物引起的對(duì)心臟或肝臟的副作用；鳥苷則可作為三氮唑核苷、無環(huán)鳥苷等許多抗病毒藥物的合成原料。由于嘌呤核苷及其類似物的重要生理作用，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)嘌呤類核苷已有很多石開究° Matsui 等(Matsui, Sato et al. Mutation of an inosine-producingstrain of Bacillus subtilis to DL—methionine sulfoxide resistance for guanosineproduction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997, 34(4):337-341.)對(duì)肌苷生產(chǎn)菌B. subtilisl411進(jìn)行誘變處理得到鳥苷高產(chǎn)菌AG169。為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)水平，國(guó)內(nèi)有研究人員對(duì)生產(chǎn)菌中嘌呤核苷合成途徑的遺傳背景進(jìn)行了研究(Qian，Caiet al. Analysis of three nucleotide sequences involved in purine nucleotidesbiosynthesis in inosine and guanosine-producing bacilus subtilis.ActaMicrobiologica Sinica, 2003,43(2) :200-205.)。該研究從分子水平揭示了生產(chǎn)菌的部分遺傳特性，有助于在基因水平理解產(chǎn)物在生產(chǎn)菌中的積累。目前，所應(yīng)用的嘌呤類核苷生產(chǎn)菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝嘌呤類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對(duì)冬蟲夏草菌嘌呤類核苷合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢合成代謝黃嘌呤核苷酸的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與次黃嘌呤核苷酸出發(fā)合成代謝黃嘌呤核苷酸的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一個(gè)來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與次黃嘌呤核苷酸出發(fā)合成代謝黃嘌呤核苷酸的頂P脫氫酶序列為SEQ ID No. I的punEl蛋白和序列為SEQ ID No. 2的punE2蛋白；該酶可催化次黃嘌呤核苷酸制備黃嘌呤核苷酸。由次黃嘌呤核苷酸合成代謝獲得黃嘌呤核苷酸的路徑如下
權(quán)利要求
1.一個(gè)來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的參與次黃嘌呤核苷酸合成代謝黃嘌呤核苷酸的頂P脫氫酶序列為SEQ ID No. I的punEl蛋白和序列為SEQ ID No. 2的punE2蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的IMP脫氫酶在生物催化次黃嘌呤核苷酸制備黃嘌呤核苷酸中的應(yīng)用。
3.編碼權(quán)利要求I所述IMP脫氫酶的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因?yàn)镮MP脫氫酶基因即序列為SEQIDNo. 3的punEl基因和序列為SEQ ID No. 4的punE2基因。
5.如權(quán)利要求3或4所述的基因在構(gòu)建能夠生物催化次黃嘌呤核苷酸制備黃嘌呤核苷酸的基因工程菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與次黃嘌呤核苷酸出發(fā)合成代謝黃嘌呤核苷酸的IMP脫氫酶，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。所述IMP脫氫酶，包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的蛋白，其編碼基因分別對(duì)應(yīng)為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本發(fā)明從原理上對(duì)次黃嘌呤核苷酸合成黃嘌呤核苷酸的代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)黃嘌呤核苷酸生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主黃嘌呤核苷酸的高表達(dá)性，為擴(kuò)大黃嘌呤核苷酸的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102703396SQ20121017374
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者吳暉, 李邦良, 柳志強(qiáng), 王鴻艷, 薛亞平, 袁水金, 許峰, 許靜, 鄭裕國(guó), 陳麗芳 申請(qǐng)人:杭州中美華東制藥有限公司, 浙江工業(yè)大學(xué)