專利名稱：一種含g2a基因的重組質粒及構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于真核表達載體構建領域，尤其涉及一種含G2A基因的重組質粒及構建方法。
背景技術：
孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(G2A, for G2 accumulation)是G蛋白偶聯(lián)受體家族，OGRl亞家族(包括0GR1，G2A, TDAG8, GPR4)成員之一，因其能夠誘導細胞停滯在G2/M期，并修復受損的DNA而得名。G2A在人類基因庫RPCI-Il片段40119-35358堿基位點，編碼382個氨基酸肽鏈，具有高度保守結構，七個疏水結構組成跨膜α螺旋(ΤΜ1-ΤΜ7)。Weng Z等1998 年鑒定得到在前B細胞和成纖維細胞G2/M檢驗點積累的G2A可以通過減弱BCR-ABL的轉變能力來發(fā)揮抑制細胞增殖的作用，而敲除G2A基因的小鼠則表現(xiàn)出系統(tǒng)性紅斑狼瘡和動脈粥樣硬化病變?，F(xiàn)在普遍認為動脈粥樣硬化與氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的吞噬、泡沫細胞的形成和相關細胞信號轉導作用下單核細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的反應有密切關系。溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)作為ox-LDL的主要脂質成分，已經(jīng)有研究表明它可以與G2A高親和力結合，介導細胞遷移，并作為分子伴侶協(xié)助G2A的表達。此外，動脈硬化病灶部位為酸性微環(huán)境，Murakami等報道，G2A的過表達在酸性環(huán)境下可導致肌醇磷酸的產(chǎn)生，而G2A的質子感知能力為LPC所拮抗。為進一步研究G2A怎樣介導動脈粥樣硬化等炎癥反應，探究其質子感知特性，現(xiàn)有技術需要克隆G2A基因并構建真核表達載體，為下一步考察其下游細胞應答奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種供研究G2A介導動脈粥樣硬化等炎癥反應并探究其質子感知特性的含有G2A基因的重組質粒。本發(fā)明的另外一個目的是提供了構建含有G2A基因的重組質粒的方法。概括的說，本發(fā)明設計了一對針對G2A基因的引物，從人臍靜脈內皮細胞提取總RNA，反轉錄獲得的cDNA中克隆不含終止密碼子的G2A基因并亞克隆到pMD_19T載體。將鑒定出的陽性質粒和表達載體PEGFP-N3用Hind III和BamH I雙酶切回收后連接獲得陽性重組質粒PEGFP-N3-G2A，并測序鑒定；重組載體以lipofectamine2000介導轉染293T細胞。Real time PCR法檢測外源基因在293T細胞中的表達。下面具體的說明本發(fā)明的詳細技術方案
本發(fā)明的含G2A基因的重組質粒，其包括載體片段PEGFP-N3和基因片段G2A。本發(fā)明的G2A基因片段(不含終止密碼子)來自人臍靜脈內皮細胞(HUVECs )提取總RNA，反轉錄獲得的cDNA中PCR擴增得到的；載體片段pEGFP_N3來自質粒pEGFP_N3。本發(fā)明的含G2A基因的重組質粒的構建方法包括如下步驟
(1)PCR擴增獲得G2A基因；
(2)將含有pEGFP-N3片段的載體與步驟(I)獲得的含G2A基因的PCR產(chǎn)物酶切后連
接;
(3)將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉化受體菌；(4)檢測外源基因在293T細胞中的表達。。進一步的說，步驟(I)包含通過PCR從HUVECs總RNA反轉錄得到的cDNA中獲得G2A基因；
進一步的說，步驟(I)中的PCR擴增中使用PCR引物5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGA
A-3’
和 5’-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3’ 。進一步的說，步驟(2)中所述含有pEGFP-N3的載體為質粒pEGFP_N3。進一步的說，步驟(2)中采用Η η III和I酶對含有pEGFP_N3片段的載體與 步驟(I)獲得的含G2A的基因的PCR產(chǎn)物進行酶切。進一步的說，步驟(4)中所述檢測方法為Real time PCR法。 本發(fā)明的有益效果在于LPC作為胞外配體能夠活化G2A，激活免疫細胞內信號轉導，調節(jié)T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核巨噬細胞的遷移和增殖，而LPC拮抗G2A的質子感知能力具有濃度依賴性。為了詳細研究G2A在酸性刺激下的細胞應答，本發(fā)明克隆了 G2A基因并構建了真核表達載體pEGFP-N3-G2A質粒，用脂質體介導瞬時轉染293T細胞；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)293T細胞具有極低量的G2A基礎表達。轉染pEGFP-N3-G2A后，293T細胞中G2A mRNA表達量顯著增加，能夠滿足于進一步的實驗需要。本發(fā)明成功克隆了 G2A基因并構建了帶有G2A基因的真核表達質粒PEGFP-N3-G2A,高效轉染293T細胞并檢測到G2A基因的表達，為下一步研究其質子感知后的信號通路奠定了基礎。


圖1、G2A基因的PCR擴增
圖中，M表示DNA標準DL2000 ;1、2、3、4表示G2A基因擴增產(chǎn)物；
圖2. pMD-19T-G2A的雙酶切鑒定
圖中，M 表示 DNA 標準 Bio Marker III ;l、pMD-19T_G2A 的 Hind III和 BamH I 雙酶切產(chǎn)物；2、陰性對照pMD-19T的Hind III和BamH I雙酶切產(chǎn)物；
圖3. pEGFP-N3-G2A的雙酶切鑒定
圖中，M表示 DNA 標準 IKbp DNA ladder Marker;l、pEGFP-N3-G2A的Hindm和BamH I雙酶切產(chǎn)物；2、陰性對照pEGFP-N3的Hind III和BamH I雙酶切產(chǎn)物；
圖 4. pEGFP-N3-G2A 表達框
圖中,pUC ori為pUC復制起始位點；Kan r/Neo r卡那霉素抗性基因/新霉素抗性基因；fl ori為fl復制起始位點；HSV-tk單純皰疹病毒胸苷激酶基因；CMV IE為啟動子；Hind III和BamH I為限制性內切酶；EGFP蛋白表達基因；
圖5. G2A特異性定量引物PCR
圖中，M表示DNA標準DL500Marker; I、G2A定量弓I物PCR產(chǎn)物(239bp )
圖6. GAPDH特異性定量引物PCR產(chǎn)物
圖中，M表示DNA標準DL500Marker; I、GAPDH定量弓I物PCR產(chǎn)物(135bp )；
圖7.轉染293T細胞中G2A基因表達檢測
圖中，Blank為未轉染細胞；pEGFP-N3為轉染空載體的細胞；pEGFP-N3_G2A為轉染G2A表達載體的細胞；圖 8· 293Τ 細胞轉染 pEGFP-N3 和 pEGFP_N3_G2A 圖片(100 X)
圖中，
(A)普通光下觀察轉染pEGFP-N3載體的293T細胞照片(100X)；
(B)熒光下觀察轉染pEGFP-N3載體的293T細胞照片(100X)；
(C)普通光下觀察轉染pEGFP-N3-G2A載體的293T細胞照片(100X)；
(D)熒光下觀察轉染pEGFP-N3-G2A載體的293T細胞照片(100X)。
具體實施例方式 實施例I含G2A基因的重組質粒的構建方法
I、材料
1.I主要試劑
限制性內切酶 BamW I , Hind IIL DNAase I ；
T4-DNA 連接酶(MBI, Fermentas)；
TransStart Taq DNA Polymerase (北京全式金生物技術有限公司); dNTPs(IOmM) (Takara)；
總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒(上海生工生物有限公司)； 無支原體新生牛血清(四季青)；
DMEM高糖(Gibco公司);
胰酶(Hyclone公司)；
脂質體 Lipofectamine 2000 (Invitrigen)；
DNA marker (bioFLUX)；
反轉錄試劑盒(北京全式金)；
熒光定量試劑盒(Takara)；
其它試劑均為國產(chǎn)分析純。I. 2質粒和細胞 pMD_19T 載體(Takara)；
PEGFP-N3 (Clontech)；
293T細胞(內蒙古大學生命科學學院)；
DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞(內蒙古大學生命科學學院)。2.方法
2.I G2A基因的克隆
以從HUVECs中提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模版，用primer 5軟件設計引物，弓 I物兩端設計 Η η III和 BamA I 酶切位點，序列如下 Pl: 5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3’； P2:5，-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3，(上海生工生物有限公司合成)；擴增長度1152bp。PCR 反應體系P1 (IOmM) lml，P2 (IOmM) lml，雙蒸水 40. 5ml，IOXTransStart TaqBuffer (Mg2+) 5ml, dNTPs (IOmM) lml, TransStart Taq DNA Polymerase 0.5ml,模板 lml。反應條件94°C預變性5min 后，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin20s，循環(huán)5次后，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin20s，循環(huán)25次，最后再于72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pMD_19T載體連接，連接產(chǎn)物轉化DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆(pMD-19T-G2A)送測序。2. 2構建表達載體
用歷·/ (! III和及I雙酶切pMD-19T-G2A與pEGFP_N3，酶切產(chǎn)物回收后用T4-DNA連接酶在16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉化DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆酶切鑒定，送測序；獲得PEGFP-N3-G2A表達載體。2. 3瞬時轉染293Τ細胞
293Τ細胞培養(yǎng)在含10%無支原體新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，胰酶消化制成單細胞懸液，以2Χ IO5個/孔接種于6孔板，每板接種提取pEGFP-N3和pEGFP_N3_G2A質粒并純化。NanoDrop核酸蛋白測定儀ndlOOO測定質粒濃度和純度。分別轉染293T細胞。24 h后觀、察熒光照相，36h提取細胞總RNA。2.4 Real time PCR檢測目的基因的表達
收集未轉染及轉染上述2種質粒的293T細胞，總RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，用DNAase I去除DNA，NanoDrop核酸蛋白測定儀ndlOOO檢測A260以計算RNA的濃度。用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。SYBR Premix Ex Taq TaKaRa試劑盒熒光定量PCR檢測目的基因在各組細胞的表達.所用引物如下G2A檢測引物，G2A-F:5’-CCTGGTTCTCCTCGTCAAAGC-3’ ；G2A_R:5’ -TGAGCCTGGTGACGTCTGTCTT-3’ ；產(chǎn)物長度 239bp ;以 GAPDH 為內參，GAPDH-F:5，-TCAAGTGGGGCGATGCTGGC-3，；
GAPDH-R:5’ -TGGGGGCATCAGCAGAGGGG-3’，產(chǎn)物長度 135bp ;反應體系2XSYBR PremixEx Taq 12. 5 μ 1，上下游引物各(IOmM) 1μ l，cDNA 115ng，補雙蒸水至25 μ I。反應條件95°C預變性 30s ;95°C變性 5s，60°C (G2A)和 60°C (GAPDH)退火 30s，72°C延伸 30s，循環(huán)40次；最后再于72°C延伸IOmin ;做溶解曲線。每個反應有3次重復。2. 5統(tǒng)計學分析
采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件one-way ANOVA進行數(shù)據(jù)處理分析數(shù)據(jù)以均數(shù)依標準差(X— 土 S)表示，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準P〈0. 05。3 結果
3.I編碼區(qū)片段的克隆與序列測定
用引物P1、P2以從HUVECs中提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模版擴增得到與預期片段大小相符的特異性片段結果(圖I)。回收的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接成的重組質粒。pMD-19T-G2A經(jīng)歷idIII和及I雙酶切鑒定正確結果(圖2)。序列測定結果表明，擴增出的DNA片段長1152bp，包含了不含終止密碼子的ORF 1140bpo與已知的NCBI genebank 人 G2A 序列(NM_013345. 2)完全一致。3. 2表達載體pEGFP-N3-G2A的構建
獲得的重組質粒PMD-19T-G2A和表達載體質粒pEGFP-N3(4. 7kb)經(jīng)歷/ d III和I雙酶切，將G2A (1152bp)片段與pEGFP-N3連接，得到的表達載體pEGFP_N3_G2A。經(jīng)歷/ d III和及I雙酶切鑒定符合預期結果(圖3)，測序結果與已知的NCBI gene bank人G2A序列(NM_013345. 2)完全一致。G2A基因真核表達載體pEGFP_N3_G2A表達框的構建見(圖4)。3. 3熒光定量PCR特異性引物的鑒定
引物G2A-F/R和GAPDH-F/R以cDNA為模板擴增得到與預期片段大小相符的特異性片段(圖5;圖6)序列測定結果表明,擴增出的片段與與已知的NCBI gene bank序列人G2A序列(NM_013345. 2)目的片段(239bp)和 GAPDH 基因(NM_002046. 3)目的片段(135bp)完
全一致。3. 4熒光定量PCR檢測G2A基因在293T細胞中的表達
使用G2A定量引物及GAPDH定量引物，以GAPDH為內參基因，分別提取未轉染細胞、轉染空載體(PEGFP-N3)細胞和轉染pEGFP-N3-G2A載體細胞的總RNA，去除DNA后，反轉錄為cDNA并以此為模板，熒光定量PCR檢測G2A基因的表達，檢測到G2A基因表達水平較未轉染的細胞提高153倍(圖7)。3. 5瞬時轉染pEGFP-N3和pEGFP_N3_G2A到293T細胞的熒光檢測
PEGFP-N3和pEGFP-N3-G2A轉染293T細胞24 h后觀察熒光(圖8)，統(tǒng)計陽性細胞，轉 染率約為80%。因為G2A基因與EGFP基因是融合表達，熒光檢測同時也說明了 G2A基因已經(jīng)在蛋白水平表達，轉基因細胞構建成功。
權利要求
1.一種含G2A基因的重組質粒，其特征在于，包括載體片段PEGFP-N3和基因片段G2A。
2.如權利要求I所述的重組質粒，所述基因片段G2A是從人臍靜脈內皮細胞提取總 RNA,反轉錄獲得的cDNA中PCR擴增得到的。
3.如權利要求I所述的重組質粒，所述載體片段PEGFP-N3來自質粒pEGFP_N3。
4.如權利要求1-3所述的任一含G2A基因的重組質粒的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)PCR擴增獲得G2A基因；2)將含有pEGFP-N3片段的載體與步驟I)獲得的含G2A基因的PCR產(chǎn)物酶切后連接；3)將步驟2)獲得的連接產(chǎn)物轉染293T細胞；4)檢測外源基因在293T細胞中的表達。
5.如權利要求4所述的含G2A基因的重組質粒的構建方法，其特征在于步驟I)包含通過PCR從人臍靜脈內皮細胞提取總RNA，反轉錄獲得的cDNA中擴增得到G2A基因。
6.如權利要求5所述的含G2A基因的重組質粒的構建方法，其特征在于步驟I)中的 PCR 擴增中使用 PCR 引物 5’ -AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3’ 和 5’ -GGATCCGCAGGACTCCTC AATCAGCC-3，。
7.如權利要求4所述的含G2A基因的重組質粒的構建方法，其特征在于步驟2)中所述含有pEGFP-N3的載體為質粒pEGFP-N3。
8.如權利要求4所述的含G2A基因的重組質粒的構建方法，其特征在于步驟2)中采用 Hind III和漢I酶對含有pEGFP_N3片段的載體與步驟I)獲得的含G2A的基因的PCR產(chǎn)物進行酶切。
9.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于步驟4)中所述檢測方法為Realtime PCR 法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含G2A基因的重組質粒，包括載體片段pEGFP-N3和基因片段G2A，該重組質粒的構建方法為首先PCR擴增獲得G2A基因；再將含有pEGFP-N3片段的載體與上步獲得的含G2A基因的PCR產(chǎn)物酶切后連接；將連接產(chǎn)物轉化受體菌；最后鑒定陽性克隆，獲得pEGFP-N3-G2A連接產(chǎn)物。本發(fā)明成功克隆了G2A基因并構建了帶有G2A基因的真核表達質粒pEGFP-N3-G2A，高效轉染293T細胞并檢測到G2A基因的表達，為研究G2A怎樣介導動脈粥樣硬化等炎癥反應并探究其質子感知特性奠定了基礎。
文檔編號C12N15/63GK102703485SQ20121019724
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權日2012年6月15日
發(fā)明者馮文利, 木其日, 楊德志, 阿拉坦高勒, 黃旭東 申請人:阿拉坦高勒