專利名稱：一種利用玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及微生物油脂，尤其是一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，能源與環(huán)境問題日益受到人們的關(guān)注，已成為世界各國面臨的主要問題之一。如何應(yīng)對(duì)日益加劇的化石能源需求量的增加與自然資源嚴(yán)重短缺的矛盾，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，是各國研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。作為一種能夠替代傳統(tǒng)化石燃料的綠色可再生能源，生物柴油具有極大的發(fā)展?jié)摿ΑＩ锊裼?Biodiesel)是生物質(zhì)能的一種，是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物的油脂以及動(dòng)物油脂、餐飲廢棄油等為原料油脂通過酯交換工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和環(huán)保特 性，硫含量低，可大大減少二氧化硫等硫化物的排放量且生物降解性可達(dá)98%，與普通柴油相比，對(duì)環(huán)境的破壞作用顯著降低。用于生產(chǎn)生物柴油的原料油脂來源廣泛，主要包括各種天然的植物油脂、動(dòng)物脂肪以及食品工業(yè)的廢油等，目前主要集中于植物油和餐飲廢棄油脂。盡管生物柴油在世界多個(gè)國家和地區(qū)已經(jīng)有了一定的應(yīng)用，但成本過高仍然是制約其進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的主要瓶頸。以植物油脂為例，原料成本高達(dá)總成本的75%，而餐飲廢棄油脂也同樣存在收集和運(yùn)輸困難等問題。因此，開發(fā)一種廉價(jià)的原料油脂是生物柴油產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。微生物油脂(Microbial oil),又稱單細(xì)胞油脂(Single cell oil, SCO),是指微生物在一定條件下產(chǎn)生并儲(chǔ)存于菌體內(nèi)的甘油脂，其脂肪酸組成以C16、C18系脂肪酸(如硬脂酸、油酸和亞油酸)為主。產(chǎn)油微生物產(chǎn)生并儲(chǔ)存的油脂通常占其生物總量的20%以上，包括細(xì)菌、霉菌、酵母、藻類等。與傳統(tǒng)油脂生產(chǎn)相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂具有以下優(yōu)點(diǎn)生長周期短，適應(yīng)性強(qiáng)；不受場地、氣候和季節(jié)的限制，占地面積小，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)；碳源利用譜廣，可以工農(nóng)業(yè)、林業(yè)、食品行業(yè)及造紙業(yè)的多種廢棄物為基質(zhì)進(jìn)行生長，來源豐富、價(jià)格低廉；油脂成分與植物油脂組成相似，可作為生產(chǎn)生物柴油的原料，也可開發(fā)一些功能性油脂應(yīng)用于食品及其它相關(guān)領(lǐng)域。木質(zhì)纖維素是含量最豐富的自然資源之一，主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素三部分組成，其中，纖維素、半纖維素是可發(fā)酵糖的重要來源。木質(zhì)纖維素經(jīng)水解后，可生成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等多種糖類，為微生物的生長提供豐富的碳源。我國是農(nóng)業(yè)大國，如果能充分利用各種農(nóng)業(yè)廢棄物如水稻桿、高粱桿、小麥桿、玉米秸桿等進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂，將對(duì)緩解油脂供需緊張的局面和環(huán)境保護(hù)產(chǎn)生積極的影響。目前，也存在一些關(guān)于制備微生物油脂的方法，但是普便得率較低，方法較為復(fù)雜。通過檢索，發(fā)現(xiàn)與本專利申請(qǐng)相關(guān)的如下三篇專利公開文獻(xiàn)I、微生物發(fā)酵油脂及其用于制備生物柴油的方法(CN1923960)，本發(fā)明包括微生物發(fā)酵油脂的制備和利用微生物發(fā)酵油脂制備生物柴油的方法，即以酵母菌為微生物產(chǎn)油脂菌種，通過在產(chǎn)油脂菌種培養(yǎng)基中接入該酵母菌微生物，在一定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行微生物發(fā)酵制備油脂，然后經(jīng)離心、分離、提取得到微生物發(fā)酵油脂，以該微生物油脂為原料，在催化劑作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，得到生物柴油，副產(chǎn)物為甘油。該技術(shù)反應(yīng)條件溫和、操作簡單、易于控制、成本較低，以微生物發(fā)酵油脂為原料，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2、用植物廢棄物生產(chǎn)生物柴油和土壤調(diào)節(jié)劑的方法(CN101007957A)，其方法具體是將植物廢棄物粉碎后通過常規(guī)的酶水解或者酸水解得到水解產(chǎn)物，用水解產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)高產(chǎn)油脂的微生物，得到大量的菌體； 水解殘?jiān)臃N內(nèi)生菌或益生菌，待用；按常規(guī)方法從培養(yǎng)得到的菌體中提取油脂，提取的油脂再通過甲酯化得到生物柴油；菌體殘?jiān)c接種內(nèi)生菌或者益生菌的秸桿水解殘?jiān)鼜?fù)配，得到土壤調(diào)節(jié)劑。本方法利用植物廢棄物轉(zhuǎn)化為生物柴油，同時(shí)生產(chǎn)土壤調(diào)節(jié)劑，能充分利用秸桿成分實(shí)現(xiàn)資源效益最大化，有廣闊的市場空間。3、秸桿載體用于油脂熱解制備生物柴油的方法(CN101463264A)，提供一種秸桿載體用于油脂熱解制備生物柴油的方法，油菜籽等含油脂物料粉碎后與粉碎的秸桿混和，或油脂與粉碎的秸桿混和，用固定床或流化床反應(yīng)器熱解，收集液相產(chǎn)物分離脂肪酸甲酯即得生物柴油。本發(fā)明的秸桿載體用于油脂熱解制備生物柴油的方法，具有下述優(yōu)點(diǎn)首先，用熱解的方法將油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油，避免了油脂提取和傳統(tǒng)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)復(fù)雜工藝；其次，本發(fā)明所用的油脂物料來源廣泛，包括富含動(dòng)植物和微生物油脂物料及動(dòng)植物和微生物油月旨，對(duì)油脂原料沒有選擇性，有利于解決生物柴油生產(chǎn)過程中油脂來源不足問題。通過對(duì)比，本發(fā)明專利申請(qǐng)與上述專利公開文獻(xiàn)有本質(zhì)不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種方法簡便、降低原料油脂的生產(chǎn)成本、提高農(nóng)副產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值、對(duì)環(huán)境無污染而且油脂含量較高的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，步驟如下⑴玉米秸桿水解液的制備將玉米秸桿通過酸水解制得玉米秸桿水解液；⑵脫毒處理；向步驟⑴中的玉米秸桿水解液中加入0&(011)2，調(diào)pH至10-11，離心取上清液，用磷酸回調(diào)PH至6. 0，離心取上清液，再將上清液滅菌、抽濾，所得濾液調(diào)pH至6. 0，再次滅菌后備用;⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng)向步驟⑵制得的玉米秸桿水解液中加入固液比g/mL為0. 1-0. 3%的(NH4)2SO4,0. 01-0. 10% 的酵母粉，0. 05-0. 2% 的 KH2PO4,0. 01-0. 05% 的Mg2SO4 *7H20，溶解后調(diào) pH至 5. 0，經(jīng)121°C、20min滅菌，作為發(fā)酵培養(yǎng)基；向滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入產(chǎn)油微生物，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10-20%，在30°C、180r/min條件下培養(yǎng)96_144h，發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體；⑷微生物油脂提取步驟⑶中菌體經(jīng)破碎、提取即得微生物油脂。而且，所述步驟⑴中玉米秸桿水解液的制備的具體步驟如下
玉米秸桿經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過40目篩，按照玉米秸桿粉末與稀酸溶液的固液比g mL為1:8-11的比例加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，于121°C高壓水解20min，3800r/min離心15min,即得玉米稻桿水解液。而且，所述步驟⑵中Ca (OH) 2為Ca (OH) 2粉末。而且，所述步驟⑶中向步驟⑵制得的玉米秸桿水解液中加入固液比g/mL為0. 2%的(NH4)2SO4jO. 05% 的酵母粉，0. 1% 的 KH2PO4,0. 03% 的 Mg2SO4 7H20。而且，所述步驟⑶中的發(fā)酵培養(yǎng)基制備中調(diào)節(jié)pH所用的酸為鹽酸。而且，所述步驟⑶中的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15%。而且,所述步驟⑶中的產(chǎn)油微生物是圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloidesAs2. 1389)。
而且，所述步驟⑶中的發(fā)酵時(shí)間為120h。而且，所述步驟⑷中微生物油脂提取的具體步驟如下使用酸熱耦合超聲波法對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎，即每克菌體加入10mL、4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫下靜置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C環(huán)境中速冷；取出后超聲破碎；將破碎后的菌體細(xì)胞按照固液比g mL為1:2-5的比例加入體積比為I: I的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振蕩后，超聲lOmin，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑即得微生物油脂。而且，所述破碎后的菌體細(xì)胞與乙醚石油醚混合溶液的固液比g :mL為1:3。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為I、本發(fā)明微生物油脂的生產(chǎn)方法利用稀硫酸水解玉米秸桿得到木質(zhì)纖維素水解液，經(jīng)Ca (OH) 2脫毒處理后可有效減少或抑制水解液中的發(fā)酵抑制物，從而促進(jìn)微生物發(fā)酵，得到含量較高的微生物油脂。本發(fā)明方法得到的生物量為13. 5g/L，油脂產(chǎn)量4. 71g/L，油脂含量為34. 89%，還原糖利用率95. 73%。2、本發(fā)明微生物油脂的生產(chǎn)方法以玉米秸桿為原料，價(jià)格低廉、來源廣泛，不僅擴(kuò)大了原料油脂的來源、降低了原料油脂的生產(chǎn)成本，提高了農(nóng)副產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值，而且對(duì)環(huán)境保護(hù)和資源的可再生利用具有積極的意義。3、本發(fā)明微生物油脂的生產(chǎn)方法以木質(zhì)纖維素水解液為底物發(fā)酵生產(chǎn)微生物油月旨，水解后獲得的可發(fā)酵糖可作為培養(yǎng)基用于多種生物發(fā)酵產(chǎn)品，不僅擴(kuò)展了生物柴油的原料油脂來源，使生物質(zhì)資源得到充分應(yīng)用，而且方法簡便，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明是以富含木質(zhì)纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸桿為原料，通過稀酸水解制得水解液，經(jīng)Ca (OH) 2脫毒處理后，添加適量氮源及其它微量的無機(jī)鹽成分，經(jīng)產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化獲得油脂。實(shí)施例I一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，具體步驟如下⑴玉米秸桿水解液的制備
玉米秸桿經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過40目篩，按照玉米秸桿粉末與稀酸溶液的固液比(g mL)為1:8的比例加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，于121 °C高壓水解20min，3800r/min離心15min,得玉米稻桿水解液，即木質(zhì)纖維素水解液；采用DNS法測水解液中還原糖的含量；⑵脫毒處理Ca(OH)JA毒處理向水解液中加入Ca (OH) 2粉末，調(diào)pH至10-11，3800r/min離心IOmin,取上清液,用磷酸回調(diào)pH至6. 0, 3800r/min離心IOmin,取上清液；所得上清液經(jīng)滅菌有沉淀產(chǎn)生，抽濾，去除沉淀，用NaOH調(diào)pH至6. 0，滅菌；⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng)
①種子液的培養(yǎng)在無菌條件下從活化后的圓紅冬孢酵母(RhodosporidiumtoruloidesAs2. 1389)斜面上挑取1_2環(huán)菌體，接入到已滅菌的50mLYEro液體種子培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，得到發(fā)酵種子液；所述的YEH)培養(yǎng)基的組成為酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6. 0 ；固體培養(yǎng)基加入20g/L的瓊脂。所述的YEH)培養(yǎng)基在121 °C條件下滅菌20min ；②發(fā)酵培養(yǎng)在步驟⑵制得的玉米秸桿稀酸水解液中加入固液比(g/mL)為0. 1%的(NH4) 2S04,0. 01% 的酵母粉，0. 01% 的 KH2PO4,0. 01% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，調(diào) pH 至5.0，經(jīng)121°C、20min滅菌后，作為發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；在滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入步驟①所得的發(fā)酵種子液，接種量為培養(yǎng)基體積的10%，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C、180r/min，發(fā)酵周期120h，發(fā)酵結(jié)束后，4000r/min離心15min收集濕菌體,用蒸懼水洗漆兩次后于45°C烘箱中干燥至恒重,獲得干菌體，備用；⑷微生物油脂提取將步驟⑶得到的干菌體利用有機(jī)溶劑乙醚-石油醚提取法，對(duì)干燥的油脂微生物菌體細(xì)胞內(nèi)的油脂進(jìn)行提取，方法如下用酸熱耦合超聲波法對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎，即每克菌體加入10mL、4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫下靜置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C環(huán)境中速冷。取出后再置于200W的超聲清洗器中超聲lOmin。將破碎后的菌體細(xì)胞按照固液比(g:mL)l:2的比例加入體積比為1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振蕩后，超聲lOmin，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑即得粗油脂。經(jīng)檢測，本發(fā)明所得微生物油脂的組成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕櫚油酸(c16:1)、反式棕櫚油酸(c16:1)、棕櫚酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亞油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分為C16和C18系脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、亞油酸的含量相對(duì)較高，與植物油的組成相似，可以作為原料油脂用于生產(chǎn)生物柴油及其它相關(guān)化工行業(yè)。經(jīng)檢測，所得玉米秸桿稀酸水解液中的還原糖含量為38. 77g/L ;發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量達(dá)到12g/L，油脂產(chǎn)量3. 5g/L，油脂含量為29. 17%，還原糖利用率92. 52%。實(shí)施例2一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，具體步驟如下
⑴玉米秸桿水解液的制備玉米秸桿經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過40目篩，按照玉米秸桿粉末與稀酸溶液的固液比(g mL)為1:10的比例加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，于121°C高壓水解20min，3800r/min離心15min,得玉米稻桿水解液，即木質(zhì)纖維素水解液；采用DNS法測水解液中還原糖的含量；⑵脫毒處理Ca(OH)JA毒處理向水解液中加入Ca (OH) 2粉末，調(diào)pH至10-11，3800r/min離心15min,取上清液,用磷酸回調(diào)pH至6. 0, 3800r/min離心15min,取上清液；所得上清液經(jīng)滅菌有沉淀產(chǎn)生，抽濾，去除沉淀，用NaOH調(diào)pH至6. 0，滅菌；
⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng)①種子液的培養(yǎng)在無菌條件下從活化后的圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides As2. 1389)斜面上挑取1_2環(huán)菌體，接入到已滅菌的50mLYEro液體種子培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，得到發(fā)酵種子液；所述的YEH)培養(yǎng)基的組成為酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.0 ;固體培養(yǎng)基加入20g/L的瓊脂。所述的YEH)培養(yǎng)基在121 °C條件下滅菌20min ；②發(fā)酵培養(yǎng)在步驟⑵制得的玉米秸桿稀酸水解液中加入固液比(g/mL)為0. 2%的(NH4) 2S04,0 . 05% 的酵母粉，0. 1% 的 KH2PO4,0. 03% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，調(diào) pH 至5.0，經(jīng)121°C、20min滅菌后，作為發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；在滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入步驟①所得的發(fā)酵種子液，接種量為發(fā)酵液體積的15%，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C、180r/min，發(fā)酵周期120h，發(fā)酵結(jié)束后，4000r/min離心15min收集濕菌體,用蒸懼水洗漆兩次后于45°C烘箱中干燥至恒重,獲得干菌體，備用；⑷微生物油脂提取將步驟⑶得到的干菌體利用有機(jī)溶劑乙醚-石油醚提取法，對(duì)干燥的油脂微生物菌體細(xì)胞內(nèi)的油脂進(jìn)行提取，方法如下用酸熱耦合超聲波法對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎，即每克菌體加入10mL、4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫下靜置30min后沸水浴3min，立即置于_20°C環(huán)境中速冷，取出后再置于200W的超聲清洗器中超聲lOmin。將破碎后的菌體細(xì)胞按照固液比(g:mL)l:3的比例加入體積比為1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振蕩后，超聲lOmin，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑即得粗油脂。經(jīng)檢測，本發(fā)明所得微生物油脂的組成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕櫚油酸(c16:1)、反式棕櫚油酸(c16:1)、棕櫚酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亞油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分為C16和C18系脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、亞油酸的含量相對(duì)較高，與植物油的組成相似，可以作為原料油脂用于生產(chǎn)生物柴油及其它相關(guān)化工行業(yè)。經(jīng)檢測，所得玉米秸桿稀酸水解液中的還原糖含量為38. 77g/L ;發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量達(dá)到13. 5g/L，油脂產(chǎn)量4. 71g/L，油脂含量為34. 89%，還原糖利用率95. 73%。實(shí)施例3
一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，具體步驟如下⑴玉米秸桿水解液的制備玉米秸桿經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過40目篩，按照玉米秸桿粉末與稀酸溶液的固液比(g mL)為1:10的比例加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，于121°C高壓水解20min，3800r/min離心15min,得玉米稻桿水解液，即木質(zhì)纖維素水解液；采用DNS法測水解液中還原糖的含量；⑵脫毒處理Ca(OH)JA毒處理向水解液中加入0&(011)2粉末，調(diào)口11至10-11，380017/111111離心20min,取上清液,用磷酸回調(diào)pH至6. 0, 3800r/min離心15min,取上清液；所得上清液經(jīng)滅 菌有沉淀產(chǎn)生，抽濾，去除沉淀，用NaOH調(diào)pH至6. 0，滅菌；⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng)①種子液的培養(yǎng)在無菌條件下從活化后的圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides As2. 1389)斜面上挑取1_2環(huán)菌體，接入到已滅菌的50mLYEro液體種子培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，得到發(fā)酵種子液；所述的YEH)培養(yǎng)基的組成為酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6. 0 ；固體培養(yǎng)基加入20g/L的瓊脂。所述的YEH)培養(yǎng)基在121 °C條件下滅菌20min ；②發(fā)酵培養(yǎng)在步驟⑵制得的玉米秸桿稀酸水解液中加入固液比(g/mL)為0. 3%的(NH4) 2S04,0. 10% 的酵母粉，0. 2% 的 KH2PO4,0. 05% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，調(diào) pH 至5.0，經(jīng)121°C、20min滅菌后，作為發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；在滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入步驟①所得的發(fā)酵種子液，接種量為15%，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C、180r/min，發(fā)酵周期144h，發(fā)酵結(jié)束后，4000r/min離心15min收集濕菌體，用蒸餾水洗滌兩次后于45°C烘箱中干燥至恒重，獲得干菌體，備用。⑷微生物油脂提取將步驟⑶得到的干菌體利用有機(jī)溶劑乙醚-石油醚提取法，對(duì)干燥的油脂微生物菌體細(xì)胞內(nèi)的油脂進(jìn)行提取，方法如下用酸熱耦合超聲波法對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎，即每克菌體加入10mL、4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫下靜置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C環(huán)境中速冷；取出后再置于200W的超聲清洗器中超聲IOmin ;將破碎后的菌體細(xì)胞按照固液比(g:mL) 1:5的比例加入體積比為1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振蕩后，超聲lOmin，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑即得粗油脂。經(jīng)檢測，本發(fā)明所得微生物油脂的組成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕櫚油酸(c16:1)、反式棕櫚油酸(c16:1)、棕櫚酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亞油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分為C16和C18系脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、亞油酸的含量相對(duì)較高，與植物油的組成相似，可以作為原料油脂用于生產(chǎn)生物柴油及其它相關(guān)化工行業(yè)。經(jīng)檢測，所得玉米秸桿稀酸水解液中的還原糖含量為38. IlgfL0發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量達(dá)到12. 4g/L，油脂產(chǎn)量4g/L，油脂含量為32. 26%，還原糖利用率91. 08%。
權(quán)利要求
1.一種利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于步驟如下 (I)玉米秸桿水解液的制備將玉米秸桿通過酸水解制得玉米秸桿水解液； ⑵脫毒處理； 向步驟⑴中的玉米秸桿水解液中加入Ca(0H)2，調(diào)pH至10-11，離心取上清液，用磷酸回調(diào)pH至6. 0，離心取上清液，再將上清液滅菌、抽濾，所得濾液調(diào)pH至6. 0，再次滅菌后備用； ⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng) 向步驟⑵制得的玉米秸桿水解液中加入固液比g/mL為0. 1-0. 3%的(NH4) 2S04，0. 01-0. 10% 的酵母粉，0. 05-0. 2% 的 KH2PO4,0. 01-0. 05% 的Mg2SO4 *7H20，溶解后調(diào) pH至 5. 0，經(jīng)121°C、20min滅菌，作為發(fā)酵培養(yǎng)基； 向滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入產(chǎn)油微生物，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10-20%，在30°CU80r/min條件下培養(yǎng)96_144h，發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體； ⑷微生物油脂提取步驟⑶中菌體經(jīng)破碎、提取即得微生物油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑴中玉米秸桿水解液的制備的具體步驟如下 玉米秸桿經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過40目篩，按照玉米秸桿粉末與稀酸溶液的固液比g mL為1:8-11的比例加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，于121 °C高壓水解20min，3800r/min離心15min,即得玉米稻桿水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑵中Ca(OH)2為Ca(OH)2粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑶中向步驟⑵制得的玉米秸桿水解液中加入固液比g/mL為0. 2%的(NH4)2SO4,0. 05% 的酵母粉，0. 1% 的 KH2PO4,0. 03% 的 Mg2SO4 7H20。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑶中的發(fā)酵培養(yǎng)基制備中調(diào)節(jié)PH所用的酸為鹽酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑶中的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑶中的產(chǎn)油微生物是圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloidesAs2. 1389)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑶中的發(fā)酵時(shí)間為120h。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述步驟⑷中微生物油脂提取的具體步驟如下 使用酸熱耦合超聲波法對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎，即每克菌體加入10mL、4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫下靜置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C環(huán)境中速冷；取出后超聲破碎；將破碎后的菌體細(xì)胞按照固液比g :mL為1:2-5的比例加入體積比為1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振蕩后，超聲lOmin，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑即得微生物油脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于所述破碎后的菌體細(xì)胞與乙醚石油醚混合溶液的固液比g :mL為1:3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，步驟如下⑴將玉米秸稈通過酸水解制得玉米秸稈水解液；⑵向水解液中加入Ca(OH)2，調(diào)pH至10-11，3800r/min離心10-20min，取上清液，用磷酸回調(diào)pH至6.0，3800r/min離心10-20min，取上清液，再將上清液滅菌、抽濾，所得濾液用NaOH調(diào)pH至6.0；⑶產(chǎn)油微生物的發(fā)酵培養(yǎng)⑷步驟⑶中干菌體經(jīng)破碎、提取即得微生物油脂。本發(fā)明微生物油脂的生產(chǎn)方法利用稀硫酸水解玉米秸稈得到木質(zhì)纖維素水解液，經(jīng)Ca(OH)2脫毒處理后可有效減少或抑制水解液中的發(fā)酵抑制物，從而促進(jìn)微生物發(fā)酵，得到含量較高的微生物油脂，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物柴油。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102719499SQ20121020813
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者劉澤君, 羅成 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)