專利名稱：一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原及其制備的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原及其制備的試劑盒。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗稱豬藍(lán)耳病，是80年代末出現(xiàn)的一種新的豬傳染性疾病，其病原體是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respirator syndrome virus,PRRSV)。I987年美國首先報(bào)道了該病的發(fā)生，其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊等嚴(yán)重的繁殖障礙，仔豬呼吸系統(tǒng)癥狀和斷奶前死亡率增高，育成 豬呼吸困難，發(fā)育遲緩，公豬性欲減退精液品質(zhì)下降等。1991年歐洲爆發(fā)了毀滅性流行，造成了近百萬頭豬死亡。中國于1996年由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國內(nèi)疑似豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染的豬場中分離到豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，確認(rèn)了本病在國內(nèi)的發(fā)生和流行。2003年起許多專家都驚呼“全國豬場一片藍(lán)”，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的高感染率是一個(gè)不爭的事實(shí)。更為令人擔(dān)憂的是，2006年夏季，中國中南部爆發(fā)了高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，之后蔓延到全國各個(gè)省市。高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥的特點(diǎn)是能使不同年齡和不同品種的豬都感染發(fā)病，且發(fā)病率高、病死率高、治愈率低。2007年，國內(nèi)共有26個(gè)省份發(fā)生了高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，發(fā)病豬數(shù)量達(dá)30多萬頭，許多發(fā)病豬場的死淘率甚至達(dá)到100%。直至今日，疫病形勢依然嚴(yán)峻，高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒已經(jīng)成為豬的三大致死性病原之首，嚴(yán)重地影響了國內(nèi)畜牧業(yè)生產(chǎn)。由于目前還沒有有效的治療手段，所以對于豬繁殖與呼吸綜合癥，尤其是高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，及時(shí)、正確的診斷是預(yù)報(bào)疫情、控制流行態(tài)勢、防止疫病爆發(fā)的首要環(huán)節(jié)。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑50 65nm,核衣殼25 35nm,表面有明顯的纖突,核衣殼呈立體對稱的二十面體。該病毒屬于套式病毒目(Nidovirales),動脈炎病毒科(Arterivirus)。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因組全長約15. 4kb,包括9個(gè)開放閱讀框架(Open Reading Frame, 0RF),分別編碼病毒復(fù)制所需要的酶(ORFla和ORFlb)和7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(0RF2a、0RF2b、0RF3 0RF7)。ORFla和ORFlb占基因組全長的3/4，編碼的多聚蛋白ppla和pplab最終可水解為14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural Protein, NSP)。這些NSP編碼病毒RNA復(fù)制酶，是病毒產(chǎn)生的唯一的非結(jié)構(gòu)性蛋白，參與病毒復(fù)制。按照歐洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒Lelystad株各非結(jié)構(gòu)蛋白劃分，Nsp7的起止位置為Ser 2083 Glu 2351。北美洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒VR-2332株Nsp7的起止位置為Ser 2200 Glu2458氨基酸。我國流行的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒主要是北美洲型，主要為高致病性HuM株，由于HuM株較VR-2332株在Nsp2處存在30個(gè)氨基酸的缺失，所以HuM株Nsp7的起止位置為Ser 2170 Glu 2428。Nsp7共259個(gè)氨基酸，由777個(gè)堿基編碼。研究顯示Nsp7可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體，并能維持較長時(shí)間，說明Nsp7與機(jī)體免疫應(yīng)答關(guān)系密切。0RF5編碼主要的囊膜糖蛋白GP5，0RF2 0RF4分別編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4，GP5與0RF6編碼的基質(zhì)蛋白M形成二聚體，核衣殼蛋白(N蛋白)由0RF7編碼。其中，N蛋白在病毒粒子中含量較高，是病毒的優(yōu)勢結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒蛋白總量的20% 40%，同時(shí)抗原性最強(qiáng)且具有較好的保守性。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染后機(jī)體首先產(chǎn)生的是針對N蛋白抗體，并且在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間最長，因而該蛋白已 作為檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的診斷抗原。豬繁殖與呼吸綜合癥的診斷技術(shù)包括以下幾種(I)臨床癥狀及病理變化即通過臨床表現(xiàn)及組織病理改變進(jìn)行診斷，如發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等呼吸系統(tǒng)癥狀，耳部肢體發(fā)紺，繁殖豬早產(chǎn)、流產(chǎn)泌乳不足，公豬精液品質(zhì)下降，仔豬易死亡等。該方法并非特異性診斷方法。(2)病毒的分離培養(yǎng)和檢查通過細(xì)胞培養(yǎng)觀察病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變。該方法需要特定的實(shí)驗(yàn)條件，且實(shí)驗(yàn)周期長。(3)分子或細(xì)胞生物學(xué)診斷采用PCR、原位核酸雜交、間接免疫熒光試驗(yàn)、間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)等直接檢測感染病豬中的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒核酸或抗原。但分子生物學(xué)檢測操作復(fù)雜繁瑣，對儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室條件、以及實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求高，檢測成本亦相應(yīng)增加，因此難以在基層單位大規(guī)模開展；此外，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒具有抗原變異性的特點(diǎn)，也使得傳統(tǒng)的單一抗原檢測難以達(dá)到預(yù)期目的。(4)免疫學(xué)診斷常用的方法如免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血清中和試驗(yàn)(SN)等。其中ELISA在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體檢測。主要原因是由于它有明顯優(yōu)于其它幾種方法的優(yōu)點(diǎn)操作簡單，穩(wěn)定性好，可自動顯示結(jié)果，特異性敏感性高。對實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備的要求相對較低，易于實(shí)現(xiàn)高通量檢測，是適于在基層單位推廣的檢測方法。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的基因結(jié)構(gòu)和抗原性比較復(fù)雜，并且具有抗原變異性的特點(diǎn)，使得單一抗原檢測或通過單一抗原檢測抗體均難以達(dá)到理想的靈敏度。全病毒作為包被抗原的優(yōu)點(diǎn)是抗原制作方法比較簡單，缺點(diǎn)是病毒純化工藝復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA檢測時(shí)有較強(qiáng)的背景反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，以及不同批次差異較大，有散毒的隱患等。使用完整的病毒顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)抗原雖然可具備理想的靈敏度，抗原制作方法也比較簡單，但是需要進(jìn)行病毒培養(yǎng)、滅活、以及滅活后的驗(yàn)證等復(fù)雜工藝，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA檢測時(shí)有較強(qiáng)的背景反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，以及不同批次差異較大，具有潛在病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)的隱患等，這些缺點(diǎn)使得該方法并不適合產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；此外，完整的病毒顆粒作為抗原檢測抗體，還容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。利用基因工程技術(shù)制備重組抗原代替全病毒抗原進(jìn)行ELISA檢測，可避免使用全病毒抗原檢測的不足，其優(yōu)點(diǎn)在于目的蛋白的反應(yīng)特異性高，且一旦技術(shù)路線成熟，可大量穩(wěn)定的制備。構(gòu)建多重表位融合抗原是目前檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體最為理想的策略?；诩夹g(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，在對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒各蛋白氨基酸序列進(jìn)行了充分的生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，我們采用多重表位融合抗原(Multiple-epitope fusionantigen, MEFA)技術(shù),選取了 Nsp7與N蛋白部分殘基作為抗原優(yōu)勢表位進(jìn)行融合抗原的設(shè)計(jì)與制備，這兩部分均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體，并能維持較長時(shí)間。以此多重表位融合抗原作為捕獲抗原建立了檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體的間接ELISA方法，再經(jīng)過條件的優(yōu)化使得在達(dá)到一定產(chǎn)能(4，8000頭份/周)的前提下，該方法所需的各組分都具備了相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，從而成功研制出了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原(Multiple-epitope fusion antigen, MEFA) 本發(fā)明所提供的多重表位融合抗原，命名為NSP7-N1，具有序列表中SEQ IDNQ: I的氨基酸殘基序列。序列表中的SEQ ID No: I由301個(gè)氨基酸殘基組成，氨基((N)端第I個(gè)氨基酸殘基為起始氨基酸甲硫氨酸(M);第2 260位為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因中ORFla部分核苷酸殘基序列編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白7 (Nonstructural Protein7, NSP7)氨基酸序列 ’第261 265位柔性氨基酸連接序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser);第266 301位為0RF7部分 核苷酸殘基序列編碼的N蛋白部分氨基酸殘基序列。編碼上述多重表位融合抗原的核苷酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，具有序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No :2由903個(gè)核苷酸堿基組成，其編碼序列為自5’端第I 3核苷酸編碼氨基端第I位的甲硫氨酸；第4 780位核苷酸編碼具有序列表SEQ ID NQ I中第2 260位的NSP7氨基酸序列；第781 795位核苷酸編碼具有序列表SEQ ID NQ I中連接NSP7與N蛋白殘基序列的連接序列；第796 903位核苷酸編碼具有序列表SEQID NQ :1中N蛋白部分氨基酸殘基序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述多重表位融合抗原的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述多重表位融合抗原的方法，包含步驟1)克隆或合成多重表位融合抗原的基因序列；2)酶切克隆的多重表位融合抗原的基因序列，連接經(jīng)酶切的表達(dá)載體，構(gòu)建多重表位融合抗原的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，表達(dá)多重表位融合抗原融合蛋白；4)純化所述融合蛋白，獲得所述多重表位融合抗原。其中步驟I)所述多重表位融合抗原的基因序列如SEQ ID N0:2所示，可以將SEQID No 2通過全基因合成，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到多重表位融合抗原NSP7-N1。用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體可為在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如 pGEX-4T-2，pET-3a, pET_28a, pET_30a, pET_28b，pET_28c 或 pET_42a 優(yōu)選為pET_42a。以pET_42a為表達(dá)載體，構(gòu)建的含有所述多重表位融合抗原(MEFA)基因的重組表達(dá)載體為 pET-42a-NSP7-Nl。上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New YorkiColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989))構(gòu)建。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為BL21 (DE3)，BL21 (Al)，BL21 (DE3) plysS, ER2529, E2566, Novablue (DE3), Rosetta (DE3), Rosetta (DE3) plys, BL21 (DE3) codon plus 等,優(yōu)選為 BL21 (DE3)codon plus?？刹捎脴?gòu)建工程菌所用的常規(guī)培養(yǎng)條件對工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)所述工程菌為重組大腸桿菌時(shí)，步驟3)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0. 3 I. OmmoI/L,優(yōu)選為0. 6mmol/L，誘導(dǎo)溫度為24 37°C，優(yōu)選為30°C低溫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為2 6小時(shí)，優(yōu)選為3. 5小時(shí)。上述制備方法中，步驟4)還包括采用GST親和層析純化，其中采用的親和層析純化介質(zhì)優(yōu)選為快流速GST標(biāo)簽(GSTrap Fast Flow)。上述制備方法中，步驟4)還包括采用His親和層析純化，其中采用的親和層析純化介質(zhì)優(yōu)選為快流速組氨酸標(biāo)簽(Histrap Fast Flow)。上述制備方法中，步驟4)還包括脫鹽柱(Desalting)處理。上述的步驟具體包括以下步驟 ①將含目的NSP7-N1重組融合蛋白的破菌上清用快流速GST凝膠初純化，采用洗脫液(50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L還原型谷胱甘肽，pH8. 0)連續(xù)洗脫并收集目的NSP7-N1重組蛋白峰；②初純化的NSP7-N1重組蛋白用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱再次純化，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫收集后者；③用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50Mm Tris-HCl, pH 8. 0 ；④脫鹽后NSP7-N1重組蛋自內(nèi)加入帶有His標(biāo)簽的重組EK酶，重組EK酶與NSP7-N1重組蛋自量比為1:1000，置于4°C低速搖床24 48小時(shí)；⑤再次用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱純化及去除重組EK酶，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫，40mM洗下蛋白即為所需NSP7-N1重組蛋白。上述制備方法中，采用Lowry法(Folin酚法)測定NSP7-N1重組蛋白濃度，采用高效液相色譜法(HPLC)測定NSP7-N1重組蛋白純度。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的試劑盒，其包含上述的多重表位融合抗原。該試劑盒，還進(jìn)一步包括以下組分抗原包被板、陰性對照和陽性對照、樣本稀釋液、沖洗緩沖液、酶標(biāo)抗體工作液、底物液、終止液。本發(fā)明采用的是重組表達(dá)的多重表位融合抗原作為捕獲抗原，結(jié)合了全病毒和重組表達(dá)蛋白作為捕獲抗原的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)有效彌補(bǔ)了二者的缺點(diǎn)。該抗原的特征是融合了 2種免疫原性強(qiáng)、保守性好的病毒蛋白表位，可有效捕獲豬感染豬繁殖與呼吸綜合癥病毒后與機(jī)體免疫應(yīng)答關(guān)系密切的、表達(dá)水平高、應(yīng)答持續(xù)時(shí)間長的特異性抗體，可有效控制低漏檢風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測的準(zhǔn)確性。本發(fā)明制備的多重表位融合抗原純度高，有更好的穩(wěn)定性，而且上述的純化工藝簡單，成產(chǎn)成本低。本發(fā)明采用優(yōu)選的間接ELISA方法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題是在達(dá)到一定產(chǎn)能的前提下，所生產(chǎn)出來的產(chǎn)品是否具有滿足實(shí)際使用所要求的穩(wěn)定性。以每周4，8000頭份/周的產(chǎn)能生產(chǎn)出來的產(chǎn)品，抽樣后進(jìn)行加速破壞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試劑盒在37°C保存I周后，其檢測信噪比無明顯下降。


圖I為NSP7-N1重組蛋白純化圖。圖2 :多重表位融合重組抗原有效性初步驗(yàn)證結(jié)果。左側(cè)前6孔為抗原包被組(coated with antigen),后6孔為無抗原包被的空白對照(blank),每個(gè)樣本雙復(fù)管檢測，抗原包被組和空白對照(無抗原包被)組的對應(yīng)位置為相同的陽性樣本和檢測條件。
圖3 :巴馬香豬減毒疫苗的抗體應(yīng)答動力學(xué)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì) 說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(沈關(guān)心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進(jìn)行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。材料和來源全基因合成及測序工作由Invitrogen公司完成。菌株BL21codon plus (DE3), DH5 a 購自 Novagen 公司；pET42a (+)購自 Novagen 公司；限制性內(nèi)切酶Sal I、BamH I , pfu DNA聚合酶,T-DNA連接酶購自promega公司；DL2000DNA Marker, DNA膠回收試劑盒,質(zhì)粒抽提試劑盒及蛋白質(zhì)Marker購自Tiangen生物科技有限公司；豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體購自上海碩博生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG來源于美國KPL公司；法國LSI豬藍(lán)耳病毒抗體ELISA診斷試劑盒購自廣州凱來動物藥品有限公司；Lowr法蛋白測定試劑盒購于上海美季生物技術(shù)有限公司；純化所用層析柱及填料購自Amersham公司；腸激酶(EK酶)購自重慶紫禾醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)化學(xué)分析純。實(shí)施例I多重表位融合抗原(MEFA) NSP7-N1的設(shè)計(jì)及其編碼基因的克隆I、多重表位融合抗原NSP7-N1的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI提供是在線數(shù)據(jù)庫檢索可獲得豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因組序列(GenBank :JQ663567. I )、NSP7氛基酸殘基序列(NCBI Reference Sequence:NP 740601.1)、核衣殼蛋白N的氨基酸殘基序列(GenBank:AAY53878. I)。其中NSP7由ORFla核苷酸部分殘基編碼，按照歐洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒Lelystad株各非結(jié)構(gòu)蛋白劃分，Nsp7氨基酸編碼序列的起止位置為Ser2083 Glu2351。北美洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒VR-2332株Nsp7氨基酸序列的起止位置為Ser2200 Glu2458。我國流行的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒主要為北美洲型高致病性HuM株，較VR-2332株在Nsp2處存在30個(gè)氨基酸的缺失。本發(fā)明選取HuM株Nsp7氨基酸序列的起止位置為Ser2170 Glu2428，共259個(gè)氨基酸作為本發(fā)明的融合表位抗原片段，由777個(gè)核苷酸編碼。核衣殼蛋白N由0RF7核苷酸序列編碼，起止位置為Met4996 Ala5118，依照保守性和抗原性較強(qiáng)的氨基酸序列為依據(jù)，選取Qln5016 Pix)5051作為本發(fā)明的融合表位抗原片段，共36個(gè)氨基酸殘基，由108個(gè)核苷酸編碼。在Nsp7蛋白與N蛋白之間由-Gly261-Gly-Gly-Gly-Ser265-柔性氨基酸序列連接。本發(fā)明的多重表位融合抗原命名為NSP7-N1，共301個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NQ: I)。將此序列相對應(yīng)的核苷酸序列(GenBank獲取)提交Graphical codon usageanalyzer (http: //guca. schoedl. del)綜合分析，參照密碼子偏嗜分析圖，對柱高值低于50的，即在大腸桿菌中表達(dá)中使用頻率偏低的密碼子，進(jìn)行同義密碼子置換優(yōu)化(如同義密碼子表達(dá)頻率均低于50，選取閾值為35)。優(yōu)化后，其相對應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NQ:2。將編碼NSP7-N1的序列SEQ ID NQ: 2兩端分別添加限制性酶切位點(diǎn)Sal I、BamH I，其中BamH I酶切位點(diǎn)后加入GATGATGATGATAAG核苷酸序列，其編碼的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys氨基酸序列為EK酶的識別位點(diǎn)。全序列委托上海英駿生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成。本發(fā)明的編碼多重表位融合抗原的核苷酸序列如SEQ ID NQ:2所示。2、多重表位融合抗原NSP7-N1重組質(zhì)粒構(gòu)建將pET42a載體與合成的NSP7-N1全基因序列經(jīng)Sal I /BamH I雙酶切消化4小 時(shí)后，用T4DNA連接酶4°C過夜連接。取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5 a菌200ul，冰浴，吸取I ul連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5 a菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘，加入800u I室溫的2XYT培養(yǎng)液混勻，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。分別將50ul、200ul及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌液涂于3個(gè)含卡那霉素抗性的2 X YT培養(yǎng)板上，37 °C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。用堿裂解法提取質(zhì)粒，取質(zhì)粒用Sal I /BamH I雙酶切4小時(shí)。酶切后，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳圖可見與設(shè)計(jì)值924bp —致的片斷。實(shí)施例2NSP7-N1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(NewYork:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989))轉(zhuǎn)化 BL21codon plus (DE3)工程菌，取重組 pET42a_NSP7_Nl 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21codon plus(DE3)菌，涂布于含氯霉素抗性與卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，測細(xì)菌OD值達(dá)0. 6 0. 8時(shí)加入終濃度為0. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，按時(shí)間點(diǎn)1，2，4，6小時(shí)收集誘導(dǎo)的細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)的工程細(xì)菌出現(xiàn)分子量約為34kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期pET42a-NSP7-Nl的表達(dá)產(chǎn)物的分子量值相符，約占細(xì)菌總蛋白的35%。再將IPTG誘導(dǎo)3. 5小時(shí)的BL21Codon plus (DE3)重組菌用裂菌液破菌，離心后分別取上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)3. 5小時(shí)的菌液分別做陰性和陽性對照，結(jié)果在上清中與陽性對照重組蛋白條帶相對應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，而沉淀無此蛋白條帶，證實(shí)重組融合蛋白為可溶性表達(dá)。實(shí)施例3NSP7-N1重組蛋白的純化轉(zhuǎn)化pET42a-NSP7-Nl重組質(zhì)粒的工程細(xì)菌經(jīng)0. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后使用 GSTrap F. F.初純化，使用 GSTrap F. F.的結(jié)合緩沖液(20mmol/L sodium phosphate,0. 15M NaCl, pH7. 3)重懸后冰上超聲破菌，4°C高速離心，留上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脫液(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L還原型谷胱甘肽，pH8. 0)洗脫，收集洗脫蛋白。將含目的蛋白的洗脫峰用His-結(jié)合緩沖液(20mmol/l, sodiumphosphate, 0. 5M NaCl, pH7. 4)按I :9的體積比稀釋后上HisTrap HP再次純化，His-結(jié)合緩沖液平衡后用 His-洗脫緩沖液(20mmol/L sodium phosphate, 0. 5M NaCl,0. 5M 咪唑,pH7. 4)，先10%緩沖液洗脫去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，平衡后用100%緩沖液將目的蛋白洗下。再用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50Mm Tris-HCl, pH 8. O。將獲得的純化重組蛋白用HiTrap Desalting置換緩沖體系為EK切割緩沖液(50mmol/LTris-HCl，pH8. 0)，按EK酶與蛋白1:1000的質(zhì)量比加入加入帶有His標(biāo)簽的EK酶，4°C低速搖床(60r/分鐘)切割12小時(shí)左右。切割后用His-結(jié)合緩沖液稀釋后HisTrap HP純化，分別收集穿透峰、10%緩沖液洗脫和100%緩沖液洗脫的蛋白，17. 5%SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。pET42a_NSP7_Nl表達(dá)的融合蛋白是以GST-NSP7-N1形式存在，經(jīng)EK酶切后可得到NSP7-N1目的蛋白。實(shí)施例4NSP7-N1重組蛋白的濃度、純度鑒定ULowry法(Folin-酚試劑法)測定NSP7-N1蛋白質(zhì)含量
表I :制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(單位ml)
權(quán)利要求
1.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的多重表位融合抗原，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列基因片段。
4.一種宿主菌，其特征在于，具有如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體。
5.一種制備權(quán)利要求I所述的多重表位融合抗原的方法，其特征在于，包含以下步驟 1)克隆或合成多重表位融合抗原的基因序列； 2)酶切克隆的多重表位融合抗原的基因序列，連接經(jīng)酶切的表達(dá)載體，構(gòu)建多重表位融合抗原的重組表達(dá)載體； 3)將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，表達(dá)多重表位融合抗原融合蛋白； 4)純化所述融合蛋白，獲得所述多重表位融合抗原。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0. 3 I. Ommol/L，誘導(dǎo)溫度為24 37°C，誘導(dǎo)時(shí)間為2 6小時(shí)。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟4)進(jìn)一步包含以下步驟 1)采用GST親和層析進(jìn)行初純化； 2)采用His親和層析純化； 3)脫鹽柱處理； 4)采用Lowry法測定重組蛋白濃度； 5)采用高效液相色譜法測定重組蛋白純度。
8.—種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求I所述的多重表位融合抗原。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還進(jìn)一步包括以下組分抗原包被板、陰性對照和陽性對照、樣本稀釋液、沖洗緩沖液、酶標(biāo)抗體工作液、底物液、終止液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明還涉及該多重表位融合抗原的制備方法，及檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體的試劑盒。本發(fā)明制備的多重表位融合抗原純度高，穩(wěn)定性好，而且制備工藝簡單，成產(chǎn)成本低，所述試劑盒的檢測靈敏度高，安全性強(qiáng)。
文檔編號C12N5/10GK102731661SQ201210241270
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者嚴(yán)俊, 姚靜, 張憲, 李小魚, 江雨麗, 石延賓, 胡偉, 魏勇, 黃洪濤 申請人:重慶業(yè)為基生物科技有限公司