專利名稱：OsSPX1蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物花粉育性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及植物花粉育性領(lǐng)域，更具體來說涉及OsSPXl蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物花粉育性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上重要的糧食作物，其產(chǎn)量的形成涉及到很多因素，包括遺傳與環(huán)境因素。傳粉受精過程是其中關(guān)鍵因素之一。在水稻中挖掘與花粉育性相關(guān)的基因，了解其作用機(jī)制對(duì)水稻的高產(chǎn)育種有重要的借鑒作用。另外，自然的花粉敗育在作物育種實(shí)踐以及雜交制種生產(chǎn)中也有積極的作用。因此，探索并發(fā)現(xiàn)與花粉育性相關(guān)的基因并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中，具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供OsSPXl蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物花粉育性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPXl基因的表達(dá)，得到花粉育性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的植物為具有所述OsSPXl基因的植物；所述OsSPXl基因編碼如下(a)或(b)所述的OsSPXl蛋白(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。所述OsSPXl基因?yàn)槿缦翴)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5XSSC,0. 1%SDS 中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. I X SSC,
0.1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0. I X SSC, 0. 1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0. 1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。所述“抑制目的植物中OsSPXl基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方法具體如下在所述目的植物中導(dǎo)入反義基因；所述反義基因?yàn)榕c所述OsSPXl基因反向互補(bǔ)的基因。所述反義基因具體可通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述重組表達(dá)載體具體可為在植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301的多克隆位點(diǎn)插入所述反義基因得到的重組質(zhì)粒。 所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。以上任一所述方法均可用于植物雜交育種。所述植物為具有所述OsSPXl基因的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。本發(fā)明還保護(hù)抑制所述OsSPXl基因表達(dá)的物質(zhì)在培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述植物為具有所述OsSPXl基因的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。本發(fā)明還保護(hù)所述OsSPXl蛋白或所述OsSPXl基因在調(diào)控目的植物的花粉育性的中的應(yīng)用。所述植物為具有所述OsSPXl基因的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。本發(fā)明還保護(hù)調(diào)節(jié)所述OsSPXl基因表達(dá)的物質(zhì)或方法在調(diào)控目的植物的花粉育性的中的應(yīng)用。所述調(diào)節(jié)所述OsSPXl基因表達(dá)的物質(zhì)具體可為含有反義基因的重組質(zhì)粒；所述反義基因?yàn)榕c所述OsSPXl基因反向互補(bǔ)的基因。所述反義基因具體可通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述重組表達(dá)載體具體可為在植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301的多克隆位點(diǎn)插入所述反義基因得到的重組質(zhì)粒。所述目的植物為具有所述OsSPXl基因的植物。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。本發(fā)明還保護(hù)所述反義基因。本發(fā)明還保護(hù)所述反義基因在培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述植物為具有所述OsSPXl基因的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體為水稻，如日本睛水稻。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果抑制OsSPXl基因的表達(dá)可以導(dǎo)致成熟花粉敗育，進(jìn)而對(duì)水稻產(chǎn)量產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于作物(包括水稻、玉米等)雜交育種，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl和重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl_antisense的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，圖A為重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl，圖B為重組質(zhì)粒pCOU 0sSPXl_antisense。圖A和B中的LB和RB分別代表T-DNA的左臂和右臂，Nos代表胭脂堿合酶終止子，Hpt II代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，CaMV35s代表花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子，Ubi代表玉米泛素啟動(dòng)子，OsSPXl代表序列表序列2所示的OsSPXl基因。圖2為轉(zhuǎn)基因水稻株系的PCR鑒定電泳圖。圖A為制備抑制表達(dá)株系的過程Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定結(jié)果，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下的片段依次為5k、3k、2k、lk、75(^ 、50(^ 、25(^ 、10(^ ，泳道8為日本睛，泳道1_7為待鑒定的Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻。圖B為制備過表達(dá)株系的過程中Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定結(jié)果，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下的片段依次為5k、3k、2k、lk、750bp、500bp、250bp、100bp、泳道9為日本睛，泳道1_8為待鑒
定的Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻。圖3為實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻株系中OsSPXl基因的相對(duì)表達(dá)水平。其中，A為過表達(dá)株系，B為抑制表達(dá)株系。圖4為T5代過表達(dá)株系、抑制表達(dá)株系與日本睛開花期小花、雄蕊和花粉育性的表型。
圖5為T5代過表達(dá)株系、抑制表達(dá)株系與日本睛花粉育性的統(tǒng)計(jì)。圖6為T5代過表達(dá)株系、抑制表達(dá)株系與日本睛的花藥囊腔的顯微鏡照片；花藥外壁、花藥內(nèi)壁和游離花粉粒的掃描電鏡照片；花粉粒截面和內(nèi)外壁的透射電鏡照片。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中的引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。水稻品種日本睛(Oryza sativa L. cv. Nipponbare):中國農(nóng)業(yè)大學(xué)保證向公眾提供；麥考文獻(xiàn)Gene expression profiles deciphering rice phenotypic variationbetween Nipponbare(Japonica) and 93-11 (Indica) during oxidative stress.PLoSOne. 2010 Jan 8,5(1)。根癌農(nóng)桿菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHAlO5):中國農(nóng)業(yè)大學(xué)保證向公眾提供；參考文獻(xiàn)Toki S，Hara N，Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S，TanakaH. 2006. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice. Plant. J. 47 (6):969-76。實(shí)施例I、水稻OsSPXl基因的獲得以4°C低溫處理12h的水稻日本睛芽期(發(fā)芽7-10天的幼苗)植株為材料，利用TRIZOL試劑提取總RNA，并以總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，在引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的引導(dǎo)下，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約900bp的DNA片段，對(duì)該片段進(jìn)行測序。引物CDS-PF :5’ -ATAGATCTATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3 (帶下劃線部分序列為限制性內(nèi)切酶Bgl II識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；引物CDS-PR :5’ -GCGGTACCTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’ (帶下劃線部分序列為限制性內(nèi)切酶KpnI識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。測序結(jié)果表明，上述約900bp的DNA片段兩端分別為Bgl II識(shí)別位點(diǎn)和KpnI識(shí)別位點(diǎn)，Bgl II識(shí)別位點(diǎn)和KpnI識(shí)別位點(diǎn)之間為序列表序列2所示的888bp核苷酸序列，該888bp核苷酸序列為ー個(gè)開放閱讀框，編碼具有序列表序列I所示的由295個(gè)氨基酸組成的蛋白。
將序列表的序列I所示的蛋白質(zhì)命名為OsSPXl蛋白，該蛋白自氨基末端(N末端)第1-169位氨基酸殘基為SPX蛋白結(jié)構(gòu)域。將編碼OsSPXl蛋白的基因命名為OsSPXl基因。OsSPXl基因的基因組DNA定位于水稻第六號(hào)染色體的23，875，408bp至23，879，965bp (其序列如序列表序列3所示)，其NCBI 定位號(hào)為 NP_001058013, NCBI 基因號(hào)(GENE ID)為:0s06g0603600, TIGR 號(hào)為 L0C_0s06g40120o實(shí)施例2、水稻OsSPXl基因正、反義重組表達(dá)載體的構(gòu)建一、水稻OsSPXl基因正義重組表達(dá)載體的構(gòu)建 I、用限制性內(nèi)切酶Bgl II和KpnI雙酶切實(shí)施例I中得到的約900bp的DNA片段，回收酶切產(chǎn)物(也可通過如下方法制備酶切產(chǎn)物，合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板，用引物CDS-PF和引物CDS-PR組成的弓I物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶Bgl II和KpnI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并回收酶切產(chǎn)物)。2、用限制性內(nèi)切酶Bgl II和KpnI雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301 (GenBank號(hào)AF234297)，回收載體骨架(約IOkb)。3、將步驟I的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接，得到OsSPXl基因的正義重組表達(dá)載體，又稱重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301的Bgl II和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1A。重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl中，按照載體骨架中啟動(dòng)子至終止子的方向，依次具有Ubi啟動(dòng)子、序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子(正義基因)和Nos終止子，從而表達(dá)與OsSPXl基因。ニ、水稻OsSPXl基因反義重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、以實(shí)施例I中得到的約900bp的DNA片段為模板(也可直接合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板)，用引物Fl和引物Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物Fl :5，-GCGGTACCATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3 (帶下劃線部分序列為限制性內(nèi)切酶KpnI識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；引物Rl :5’ -ATAGATCTTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3 (帶下劃線部分序列為限制性內(nèi)切酶Bgl II識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。2、用限制性內(nèi)切酶KpnI和Bgl II雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶Bgl II和KpnI雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301 (GenBank號(hào)AF234297)，回收載體骨架(約IOkb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到OsSPXl基因的反義重組表達(dá)載體，又稱重組質(zhì)粒pCOU 0sSPXl_antisense。根據(jù)測序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pCOU 0sSPXl_antisense進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301的Bgl II和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子的反向互補(bǔ)序列(反義基因)。重組質(zhì)粒pCOU0sSPXl_antisense 的 T-DNA 區(qū)的結(jié)構(gòu)不意圖見圖 1B。重組質(zhì)粒 pCOU 0sSPXl_antisense中，按照載體骨架中啟動(dòng)子至終止子的方向，依次具有Ubi啟動(dòng)子、與序列表的序列2反向互補(bǔ)的雙鏈DNA分子和Nos終止子，從而表達(dá)與OsSPXl基因編碼的RNA反向互補(bǔ)的RNA分子，可以抑制植物中原有OsSPXl基因的表達(dá)。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得分別將實(shí)施例2構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl和重組質(zhì)粒pCOU 0sSPXl_antisense用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化日本睛的成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，具體方法如下I、將重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到含有重組質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌。2、將重組農(nóng)桿菌接種于YEB液體培養(yǎng)液(含100 U g/ml卡那霉素和75 U g/ml利福平)，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6-0. 8，然后10，OOOrpm室溫離心lmin，用MS鹽溶液(pH5. 8)重懸菌體并稀釋至原培養(yǎng)液菌濃度的20-50倍，得到重組農(nóng)桿菌菌 懸液。MS 鹽溶液的配方NH4NO3 I. 65g、KNO3 I. 9g、KH2PO4 0. 17g、MgSO4 7H20 0. 7g、CaCl2 2H20 0. 44g、MnSO4 4H20 22. 3mg、ZnSO4 7H208. 6mg、H3BO3 6. 2mg、KI 0. 83mg、Na2MoO4 2H20 0. 25mg、CoCl2 6H20 0. 025mg、CuSO4 5H20 0. 025mg、FeSO4 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg、肌醇 lOOmg、煙酸(B5)O. 5mg、鹽酸吡哆醇(維生素 B6) 0. lmg、鹽酸硫胺素(維生素B1) 0. 5mg、甘氨酸2. Omg,用水定容至1し3、將滅菌后的日本睛種子接種于N6D培養(yǎng)基平板(pH5. 8)，32°C培養(yǎng)1_5天，去除芽和殘留胚乳后再繼代培養(yǎng)10-20天，得到成熟胚愈傷組織。N6D培養(yǎng)基的配方溶劑為水；溶質(zhì)及其濃度如下KN03 2. 83g/L、(NH4) 2S04
0.463g/L、MgSO4 7H20 0. 185g/L、CaCl2 0. 166g/L、KH2PO4 0. 4g/L ；MnSO4 4H20 4. 4mg/L、ZnSO4 7H20 I. 5mg/L、KI 0. 8mg/L、H3BO3 I. 6mg/L、FeSO4 7H20 27. 8mg/L、Na2EDTA 2H2037. 3mg/L ；2, 4_D 2mg/L，CH: 0. 3g/L，L-脯氨酸 2. 878g/L，蔗糖 30g/L,固化劑 4g/L。4、將步驟3得到的成熟胚愈傷組織浸于步驟2得到的重組農(nóng)桿菌菌懸液中，輕輕晃動(dòng)約I. 5min，然后接種于含有10-20mg/Lこ酰丁香酮的N6D培養(yǎng)基(pH5. 2)上，該培養(yǎng)基上預(yù)先墊有一層浸有0.5毫升AAM培養(yǎng)基(Hiei，Y.，S. Ohta，T Komari andT. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L ノmediatedby agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA. PlantJ. 6:271-282.)的無菌濾紙，25°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天。5、將經(jīng)過步驟4共培養(yǎng)的愈傷組織接種于含有50mg/L潮霉素(hygromycin B)和250mg/L羧芐青霉素(carbenicillin)的RE分化培養(yǎng)基(pH5. 8)中培養(yǎng)1-2周，然后選取生長旺盛的抗性愈傷組織進(jìn)行分化、壯苗，獲得Ttl代植株。RE分化培養(yǎng)基的配方溶劑為水；溶質(zhì)及其濃度如下=NH4NO3 I. 65g/L、KNO3
1.9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、MgSO4 7H20 0. 7g/L、CaCl2 2H20 0. 44g/L、MnSO4 4H20 22. 3mg/L、ZnS04.7H20 8. 6mg/L,H3BO3 6. 2mg/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、CoCl2 6H200. 025mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、FeSO4 7H20 27. 8mg/L、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg/L、肌醇100mg/L、煙酸(B5)O. 5mg/L、鹽酸卩比卩多醇(維生素B6)0. 5mg/L、鹽酸硫胺素(維生素B1)0. lmg/L,鹿糖30g/L,山梨醇30g/L,酸水解酪蛋白2g/L, a_萘こ酸0. 02mg/L,激動(dòng)素2mg/L,呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，植物凝膠4g/L。T1代表示Ttl代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T4代表示T3代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T5代表示T4代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。
6、轉(zhuǎn)基因水稻株系的PCR鑒定分別取Ttl代植株和T1代植株進(jìn)行分子鑒定。分子鑒定的方法提取基因組DNAJf基因組DNA作為模板用HPT-F和HPT-R組成的引物對(duì)組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定(HPT-F 5’ -TACTTCTACACAGCCATC-3’ ；HPT-R :5’ -CGTCTGTCGAGAAGTITC-3’ ；靶序列為載體骨架上潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分序列，如果得到約947bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定結(jié)果為陽性)，PCR鑒定為陽性的植株即轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)于某一 Ttl代植株，如果其T1代植株均PCR鑒定為陽性，則該植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株，該植株及其后代即為I個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系。采用重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl_antisense進(jìn)行步 驟I至6得到的純合的轉(zhuǎn)基因株系為抑制表達(dá)株系，共獲得9個(gè)抑制表達(dá)株系。部分Ttl代植株的鑒定結(jié)果見圖2A。從9個(gè)抑制表達(dá)株系中隨機(jī)取兩個(gè)株系(Anti-Iinel和Anti_line2)進(jìn)行實(shí)施例4和實(shí)施例5。采用重組質(zhì)粒pCOU OsSPXl進(jìn)行步驟I至6得到的純合的轉(zhuǎn)基因株系為過表達(dá)株系，共獲得8個(gè)過表達(dá)株系。部分Ttl代植株的鑒定結(jié)果見圖2B。從8個(gè)過表達(dá)株系中隨機(jī)取兩個(gè)株系(Ox-Iinel和0x-line2)進(jìn)行實(shí)施例4和實(shí)施例5。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因水稻的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測分別取日本睛、Ox-Iinel的T1代植株、0x_line2的T1代植株、Anti-Iinel的T1代植株和Anti-line2的T1代植株的旗葉(均為在大田種植約120天的植株)，利用TRIZOL試劑提取總RNA，以此RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。用于鑒定Anti-Iinel植株和Anti_line2植株中OsSPXl基因表達(dá)情況的引物對(duì)如下(靶序列對(duì)應(yīng)OsSPXl基因編碼區(qū)，對(duì)應(yīng)序列表序列3的第362-473位，約112bp)5’-GTACACTGCATGACCTTGATCTTGA-3’ ；5’-CCGAGAGTTCATGAAAGAGGATGTAG-3’ 。用于鑒定Ox-Iinel植株和0x_line2植株中OsSPXl基因表達(dá)情況的引物對(duì)如下(靶序列對(duì)應(yīng)OsSPXl基因的3’ UTR區(qū)，對(duì)應(yīng)序列表序列3的第4233-4485位，約253bp)5’-GCAAGGAGATCGTCGACTTC-3’ ；5’-GCCCCAGTCCTCTTGTCATA-3’ 。用于鑒定內(nèi)標(biāo)基因的引物對(duì)如下(靶序列對(duì)應(yīng)18s rRNA，約180bp)5’-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3’ ；5’-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3’ 。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系4ii I cDNA 模板(2ng/ii 1),4. 5u I SYBR Green MasterMix，I ii I 特異引物，0. I ddH20。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增程序(利用MJ Research公司生產(chǎn)的檢測系統(tǒng))95°C 5min, I個(gè)循環(huán)；95°C 30s,60°C 30s (讀板，read plate),85°C Is (讀板，read plate),共 40 個(gè)循環(huán)；72°C 2min，65°C -95V (每隔 0. 2°C作溶解曲線)。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Ox-Iinel植株和0x_line2植株中OsSPXl基因的相對(duì)表達(dá)水平見圖3A。Ox-Iinel植株和0x-line2植株中OsSPXl基因的表達(dá)量明顯高于日本睛。Anti-Iinel植株和Anti_line2植株中OsSPXl基因的相對(duì)表達(dá)水平見圖3B。Anti-Iinel植株和Anti_line2植株中OsSPXl基因的表達(dá)量明顯低于日本睛。
實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因水稻的小花表型及花粉育性的觀察統(tǒng)計(jì)分別取日本睛、Ox-Iinel的T5代植株、0x_line2的T5代植株、Anti-Iinel的T5代植株和Anti-Iine2的T5代植株，種植于大田中，正常管理。觀察植株在抽穗揚(yáng)花時(shí)期的表型，尤其是花器官的生長狀況。小花照片見圖4A，雄蕊照片見圖4B。各個(gè)株系的小花在外觀表型上無明顯差異。Ox-Iinel植株、0x-line2植株和日本睛的小花表型和雄蕊表型都一致。與日本睛和過表達(dá)株系相比，Anti-Iinel植株和Anti-line2植株的雄蕊松散、花藥較 小并呈白色。對(duì)姆個(gè)植株分別取花粉粒進(jìn)行Alexander染色(參考文獻(xiàn)！Alexander, M.P.DIfierentI a丄 staining of aborted and nonaborted pollen. StainTechnol. 1969，44，117 - 122.)。呈現(xiàn)紅色的為活性花粉，不呈現(xiàn)紅色的花粉為敗育花粉。進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。染色后的照片見圖4C。各個(gè)株系的活性花粉比率(又稱花粉育性，單位為％)比較結(jié)果見圖5。Anti-Iinel植株和Anti_line2植株有花粉敗育現(xiàn)象，敗育率在50%以上，甚至可達(dá)95%以上。利用顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)一步觀察Anti_line2、日本睛和Ox-Iinel花藥及游離花粉粒的細(xì)節(jié)(部分照片見圖6)?？梢悦黠@看到與日本睛相比，Anti-line2植株的花藥囊腔不飽滿，而Ox-Iinel植株的花藥囊腔中花粉粒更多更充實(shí)；Anti_line2植株的花藥內(nèi)外壁的表面結(jié)構(gòu)模糊，花粉干癟無內(nèi)容物，而花粉外壁明顯增厚內(nèi)壁缺乏，花粉敗育的現(xiàn)象更為清晰，而Ox-Iinel植株的花粉粒內(nèi)部的淀粉體更大，更飽滿，這也與其花粉Alexander染色的情況相吻合。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPXl基因的表達(dá)，得到花粉育性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物； 所述OsSPXl基因編碼如下(a)或(b)所述的OsSPXl蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述OsSPXl基因?yàn)槿缦翴)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2所不的DNA分子； 2)序列表的序列3所不的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述“抑制目的植物中OsSPXl基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方法如下在所述目的植物中導(dǎo)入反義基因；所述反義基因?yàn)榕c所述OsSPXl基因反向互補(bǔ)的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述反義基因通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在植物表達(dá)載體pCAMBIA-1301的多克隆位點(diǎn)插入所述反義基因得到的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求I至5中任一所述方法在植物雜交育種中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，或如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
8.抑制OsSPXl基因表達(dá)的物質(zhì)在培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用； 所述OsSPXl基因編碼如下(a)或(b)所述的OsSPXl蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
9.序列表的序列I所示OsSPXl蛋白或所述OsSPXl蛋白的編碼基因在調(diào)控目的植物的花粉育性的中的應(yīng)用。
10.調(diào)節(jié)OsSPXl基因表達(dá)的物質(zhì)或方法在調(diào)控目的植物的花粉育性的中的應(yīng)用； 所述OsSPXl基因編碼如下(a)或(b)所述的OsSPXl蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了OsSPX1蛋白及其編碼基因在調(diào)節(jié)植物花粉育性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPX1基因的表達(dá)，得到花粉育性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述OsSPX1基因編碼如下(a)或(b)所述的OsSPX1蛋白(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明可以應(yīng)用于作物(包括水稻、玉米等)雜交育種,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102766631SQ20121025345
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者于靜娟, 劉鳳霞, 張力圩, 徐文英, 王玲, 蘇震, 趙琳娜, 魏強(qiáng) 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)