專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用芽孢桿菌制備纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體為一種纖維素酶的制備方法。
背景技術(shù)：
多年來(lái)，生物轉(zhuǎn)化纖維素質(zhì)成為有用產(chǎn)物一直是生物技術(shù)的重要研究領(lǐng)域，但在天然條件下能直接分解利用纖維素作碳源的微生物卻很少，尤其在中性條件下能分解纖維質(zhì)原料的菌類(lèi)，更是少有。 目前關(guān)于纖維素酶方面研究和生產(chǎn)的報(bào)導(dǎo)，大都是關(guān)于酸性條件下能分解纖維素質(zhì)原料的菌類(lèi)，在中性條件下的幾乎還是一片空白。中性纖維素酶市場(chǎng)遠(yuǎn)景非常的好。我國(guó)是一個(gè)紡織大國(guó)，每年需要紡織用纖維素酶5萬(wàn)余噸，目前中性纖維素酶主要靠進(jìn)口，亟需開(kāi)發(fā)成本合理、易于操作的中性纖維素酶制備方法。就生產(chǎn)及應(yīng)用方面來(lái)說(shuō)，目前國(guó)內(nèi)酸性纖維素酶已經(jīng)有一部分廠家正在生產(chǎn)，并在紡織用水洗酶上占有很大的市場(chǎng)，但是酸性酶并不是很適合水洗。一是與它的復(fù)合酶系組成有關(guān)，其中有效酶組分比例太小，二是在酸性條件下水洗時(shí)反污染情況相當(dāng)嚴(yán)重，而中性纖維素酶就正好解決了上述的問(wèn)題。中性酶可在PH值6-8的條件下使用。這個(gè)特定的PH值范圍不會(huì)損壞織物的強(qiáng)力。表面活性劑在這個(gè)pH值范圍是最有效的，從而節(jié)約了紡織品加工過(guò)程中的表面活性劑的使用。目前在紡織水洗酶市場(chǎng)上中性纖維素酶非常走俏，價(jià)格也很高，酸性水洗酶很難與其競(jìng)爭(zhēng)，將來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)必是中性酶，現(xiàn)在主要靠從國(guó)外進(jìn)□。近幾年，堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)上的成功應(yīng)用，改變了傳統(tǒng)的去污方法，建立了一套新的去污機(jī)制，提高了洗滌效果，并有柔軟、增艷等作用，被洗滌劑工業(yè)稱(chēng)之為一次技術(shù)革命；在日本和丹麥它已作為洗滌劑的添加劑而被廣泛使用。堿性纖維素酶可提高洗滌效果，堿性纖維素酶的去污機(jī)理人們很早就知道。但國(guó)內(nèi)生產(chǎn)堿性纖維素酶方面仍存在空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，研究出一種高活性纖維素酶的生產(chǎn)工藝，填補(bǔ)了這方面的空白。本發(fā)明的另一目的是提供用該方法制備所得的纖維素酶。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案為一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括步驟以芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0. 5-2%、豆餅粉I 5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0. 3 0. 8%、無(wú)機(jī)鹽1-2%、消泡劑0-0. 3%和70-90%的水。所述芽抱桿菌優(yōu)選(BacillusCohn)DM_32。一種芽孢桿菌(Bacillus Cohn) DM-32，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6211。保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，電話(huà)(010)64807355。保藏日期2012年6月8日。所述芽孢桿菌系發(fā)明人從土壤中分離篩選后經(jīng)誘變得到的。該菌株具有如下特性DM-32菌株既可以在酵母膏、葡萄糖合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，也可以在麩皮、豆餅粉、豆餅粉水解液組成的粗培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其主要代謝產(chǎn)物為纖維素酶。生長(zhǎng)PH值范圍為5. 5^10. 0，生長(zhǎng)溫度范圍為25 42°C。DM-32菌體細(xì)胞桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈。產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形或柱形，中生或近中生。好氧型，革蘭氏陽(yáng)性。DM-32在細(xì)菌培養(yǎng)基平板(牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)pH7. 8-8. 2)上的菌落特征是形態(tài)為圓形，表面光滑有光澤，邊緣整齊淺乳白色，扁平，生長(zhǎng)迅速，該菌株鑒定為Bacillus sp.，并命名為Bacillus Cohn0其中，所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0. 3-0. 8%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、無(wú)機(jī)鹽I. 5-1. 8%、羧甲基纖維素鈉0. 4-0. 6%和90-95%的水。 其中，所述斜面培養(yǎng)的溫度為35_37°C，培養(yǎng)的時(shí)間為3-4天。其中，所述振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0. 4-0. 6%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、麩皮0. 3-0. 8%、無(wú)機(jī)鹽1-2%和90-95%的水。其中，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為35_37°C，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)，振蕩培養(yǎng)的裝置轉(zhuǎn)速為 120-200r/min。其中，所述淀粉為玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉中的一種或一種以上。其中，所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉中的一種或一種以上。其中，所述豆餅粉水解液是按照質(zhì)量比例，將10-18%的豆餅粉與0. 5-1. 5%的氧化鈣或氫氧化鈣、余量的水混合，在溫度110-130°C下處理0. 5-2小時(shí)獲得的。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為0. 1-15%，培養(yǎng)的溫度為33-37 °C，通風(fēng)量為0-0. 8vvm (通入空氣體積/發(fā)酵液體積/min)，培養(yǎng)時(shí)間為24-120小時(shí)，發(fā)酵的壓力為
0.02-0. 07MPa。本發(fā)明提出的方法制得的纖維素酶。本發(fā)明所述的纖維素酶在紡織品加工中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為①本發(fā)明提出的方法得到的是在pH中性及堿性條件下均適用的纖維素酶，而國(guó)內(nèi)現(xiàn)在一般生產(chǎn)的都是酸性條件下適用的纖維素酶，中性及堿性纖維素酶在水洗酶應(yīng)用方面明顯優(yōu)于酸性纖維素酶。②使用的菌種為芽孢桿菌，和目前國(guó)內(nèi)一般采用木霉菌作為纖維素酶生產(chǎn)菌種不同。該方法所使用的芽孢桿菌是一種易于保存、擴(kuò)增、繁殖快、適合大規(guī)模生產(chǎn)的菌種，可以縮短生產(chǎn)周期。③采用的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和一般常規(guī)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基不同。一般產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基中都要有纖維類(lèi)原料碳源作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)底物。纖維類(lèi)原料成本昂貴，而且在投料、物料消毒、大規(guī)模生產(chǎn)等方面使用起來(lái)都有諸多不便。而該方法采用淀粉類(lèi)原料作為碳源，成本低，而且在運(yùn)輸、投料、消毒等方面都優(yōu)于纖維類(lèi)原料。
④培養(yǎng)基中添加豆餅粉水解液作為可溶性氮源，成本低、制作及使用方便、氮利用率高。一般生產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基用蛋白胨或玉米漿作為可溶性氮源，成本很高。⑤該方法所制備的纖維素酶成本低、活力高、對(duì)pH適用范圍廣穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。CMC酶活的測(cè)定底物使用1%羧甲基纖維素鈉(CMC)，加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液， 在50°C、80r/min、pH4 10下反應(yīng)30分鐘，測(cè)定酶解產(chǎn)生的葡萄糖量。一個(gè)CMC酶活力單位定義為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每小時(shí)每毫升酶液生成一毫克葡萄糖的酶量，以u(píng)/ml表示。實(shí)施例中，所用蛋白胨購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；消泡劑為泡敵，購(gòu)自濟(jì)南國(guó)邦化工有限公司，PPG型工業(yè)級(jí)；可溶性淀粉購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純。實(shí)施例I :三角瓶發(fā)酵制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無(wú)菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn，保藏編號(hào)CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)(內(nèi)徑2. 5mm,取量10微升，下同)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)3天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉
I.0%氯化鈉0. 5%磷酸氫二鉀0. 1%，CMC (羧甲基纖維素鈉)0. 5%，碳酸鈉1%，瓊脂2. 0% ;其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度36°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%磷酸氫二鉀0. 1%碳酸鈉1% ;其余為水。3、然后再在裝液量為IOOml的500ml三角瓶中用芽孢桿菌做菌種發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶，接種量為0. 1%體積比，發(fā)酵溫度0-72小時(shí)為35-37°C，72-120小時(shí)為33_35°C，搖床轉(zhuǎn)速為180-200r/min。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為玉米淀粉1%豆餅粉2%豆餅粉水解液10%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%，磷酸氫二鉀0. 1%碳酸鈉1%，其余為水。4、其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經(jīng)高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，石灰1%, 7jC 85%，處理?xiàng)l件為120-122。。，I小時(shí)。5、酶活力測(cè)定測(cè)定結(jié)果表明，pH6. (T9. 0時(shí)，該纖維素酶活力最高，9.0時(shí)為459. 2u/ml, pH值6. 0時(shí)為382. 5u/ml。pH為5. 0和10. 0時(shí)，其活力下降至最高值的80%。PH為4. 0時(shí)，活力下降至最高值的50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的纖維素酶在中性和堿性條件下均有很高活力。實(shí)施例2 IOL發(fā)酵罐制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無(wú)菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn，保藏編號(hào)CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 3%、蛋白胨0. 8%、酵母粉0. 8%、氯化鈉0. 4%、磷酸氫二鉀
0.1%、CMC0. 5%、碳酸鈉1%、瓊脂2. 0%，其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度36°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 4%、蛋白胨I. 0%、酵母粉0. 8%、麩皮0. 5%、氯化鈉0. 4%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉0. 6%，其余為水。3、然后在裝料量為6L的IOL不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐中用芽孢桿菌做菌種發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，接種量為I. 5%體積比，發(fā)酵溫度在0-72小時(shí)之內(nèi)為35-37°C，然后在72-120小時(shí)為33-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，通風(fēng)為0. 7vvm,罐壓為0. 05MPa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為玉米淀粉0. 5%、豆餅粉5%、豆餅粉水解液8%、麩皮0. 3%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉I. 2%、泡敵0. 01%，其余為水。發(fā)酵每4小時(shí)取樣測(cè)定各種指標(biāo)。4、其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經(jīng)高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，石灰1%，水85%，處理?xiàng)l件為120°C，蒸煮I小時(shí)。 5、酶活力測(cè)定結(jié)果表明，pH6. 5時(shí)，該纖維素酶活力為402. Iufml0 pH8. 5時(shí)，該纖維素酶活力為446. 2u/ml。pH6. 0 9. 0時(shí),該纖維素酶活力最高。實(shí)施例3 30m3發(fā)酵罐制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無(wú)菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn,保藏編號(hào)CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，35-37°C培養(yǎng)3_4天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 8%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、氯化鈉0. 6%、磷酸氫二鉀0. 2%、CMC0. 6%、碳酸鈉I. 2%、瓊脂2. 0%，其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 6%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、麩皮0. 8%、氯化鈉0. 3%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉0. 6%，其余為水。3、種子罐擴(kuò)培3m3種子罐，裝液量為I. 8m3,接種量為0. 2%，培養(yǎng)溫度35_37°C，通風(fēng)量為0. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)周期24小時(shí)。培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%磷酸二氫鉀0. 1%碳酸鈉1%;其余為水。4、然后在裝液量為ISm3的30m3不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐中用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，接種量為10%體積比，發(fā)酵溫度為0-72小時(shí)為36°C，72-120小時(shí)為35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，通風(fēng)為0. 8vvm，罐壓為0. 07MPa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分比為甘薯淀粉1%、豆餅粉2%、豆餅粉水解液10%、麩皮0. 5%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉1%、泡敵0.01%，其余為水。發(fā)酵每4小時(shí)取樣測(cè)定各種指標(biāo)。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過(guò)壓濾濃縮得到纖維素酶成品。其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經(jīng)高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，氫氧化鈣1%，水85%，處理?xiàng)l件為122°C，蒸煮I小時(shí)。5、酶活力測(cè)定結(jié)果表明，pH6. 5時(shí)，該纖維素酶活力為394. 5u/ml,pH8. 5時(shí)，該纖維素酶活力為436. lu/mlo pH6. 0 9. 0時(shí),該纖維素酶活力最高。
權(quán)利要求
1.一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括步驟以芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0. 5-2%、豆餅粉I 5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0. 3 0. 8%、無(wú)機(jī)鹽1-2%、消泡劑0-0. 01%和70-90%的水。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0. 3-0. 8%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、無(wú)機(jī)鹽I. 5-1. 8%、羧甲基纖維素鈉0.4-0. 6% 和 90-95% 的水。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉 0. 4-0. 6%、蛋白胨 0. 8-1. 2%、酵母粉 0. 8-1. 2%、麩皮 0. 3-0. 8%、無(wú)機(jī)鹽 1-2% 和 90-95% 的水。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為35-37°C，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)，振蕩培養(yǎng)的裝置轉(zhuǎn)速為120-200r/min。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述淀粉為玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉中的一種或一種以上。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述豆餅粉水解液是按照質(zhì)量比例，將10-18%的豆餅粉與0. 5-1. 5%的氧化鈣或氫氧化鈣、余量的水混合，在溫度110-130°C下處理0. 5-2. 0小時(shí)獲得的。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為體積比0.1-15%，培養(yǎng)的溫度為33-37 °C，通風(fēng)量為0-0. 8vvm,培養(yǎng)時(shí)間為24-120小時(shí)，發(fā)酵的壓力為0.02-0. 07MPa。
8.一種芽孢桿菌，(Bacillus Cohn) DM-32，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6211。
9.權(quán)利要求1-7任一所述的方法制得的纖維素酶。
10.權(quán)利要求9所述纖維素酶在紡織品加工中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其包括步驟以芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質(zhì)量含量的淀粉0.5-2%、豆餅粉1-5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0.3-0.8%、無(wú)機(jī)鹽1-2%、消泡劑0-0.3%。本方法得到的是在pH中性及堿性條件下高活性的纖維素酶，在水洗酶應(yīng)用方面明顯優(yōu)于酸性纖維素酶，本發(fā)明的方法采用淀粉類(lèi)原料作為碳源，其在運(yùn)輸、投料、消毒等方面都優(yōu)于纖維類(lèi)原料；以豆餅粉水解液作為可溶性氮源，成本低、制作及使用方便。本發(fā)明的方法所制備的纖維素酶成本低、活力高、對(duì)pH適用范圍寬穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102766615SQ201210256710
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者代淑梅, 李秋園 申請(qǐng)人:唐山市冀東溶劑有限公司