專利名稱：鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的引物和探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的引物和探針及其檢測方法，特別涉及一種采用實時突光PCR的方法鑒定或輔助鑒定番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurlvirus, ToSLCV)的引物對、探針及其檢測方法。
背景技術(shù)：
番爺嚴(yán)重曲葉病毒( Tomato severe leaf curl virus, ToSLCV)是近年發(fā)現(xiàn)的病毒新種，屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),是番爺上的重要病害，特別是與番爺灼燒病毒(Tomato torrado virus,ToTV)共同侵染,導(dǎo)致許多寄主植物如番茄等的嚴(yán)重減產(chǎn)。ToSLCV是美國的檢疫性有害生物，也是蔬菜生產(chǎn)的主要限制因素。這種病毒由粉虱傳播，在生長季節(jié)，煙粉虱可將病毒傳播至很多寄主植物上。為防止ToSLCV傳入美國并擴(kuò)散，美國農(nóng)業(yè)部動植物檢疫局(APHIS)2009年6月I日發(fā)布聯(lián)邦法令，禁止以下來自加拿大以外所有國家的用于種植的寄主植物的進(jìn)ロ，包括番爺屬(Lycopersicon spp.)、辣椒屬(Capsicum spp.)、爺屬(Solanum spp.)、藜屬(Chenopodium spp.)、寥屬(Polygonum spp.)、濱藜屬(Atriplex spp. )、Halogetum 屬、煙草屬(Nicotiana spp.)、獨行菜屬(Lepidium spp.)、擬漆姑屬(Spergularia spp.)、覓屬(Amaranthus spp.)及錦葵屬(Malva spp.),直到風(fēng)險評估完成并制定有效的緩解措施。目前該病毒主要分布于洪都拉斯、墨西哥、危地馬拉及尼加拉瓜。ToSLCV可經(jīng)介體傳播，一旦田間有植株發(fā)病，病毒將快速擴(kuò)散，往往在短時間內(nèi)就會導(dǎo)致番爺大面積發(fā)病，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國質(zhì)檢總局也發(fā)布番茄嚴(yán)重曲葉病毒疫情警示，要求對上述寄主植物在入境時加強檢疫，避免該病毒的傳入。然而，我國目前還沒有關(guān)于該病毒的研究，更沒有相關(guān)的檢測方法，因而有必要建立該病毒的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的組合物、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curlvirus, ToSLCV)的組合物，由一個引物對和ー個探針組成的組合物；所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針可為TaqMan熒光探針，其核苷酸序列為序列表中序列3。其中，序列I有26個核苷酸組成；序列2由23個核苷酸組成；序列3由20個核苷
酸組成。TaqMan熒光探針是ー種寡核苷酸探針，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，淬滅熒光基團(tuán)連接在探針的3’末端。PCR擴(kuò)增時在加入ー對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增吋，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同歩。所述報告熒光基團(tuán)可為Fam (FAM)、Hex(HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬滅熒光基團(tuán)可為 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本發(fā)明中，所述探針5’端標(biāo)記的報告熒光基團(tuán)具體為FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)具體為TAMRA熒光基團(tuán)。
鑒定或輔助鑒定番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)的引物對和探針也分別屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對具體為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。所述探針可為TaqMan熒光探針，其核苷酸序列具體為序列表中序列3。在本發(fā)明中，所述探針5’端標(biāo)記的報告熒光基團(tuán)具體為FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)具體為TAMRA熒光基團(tuán)。上述組合物或引物對或探針在制備用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帯番茄嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)的試劑盒包含有上述組合物或引物對或探針。所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法具體可包括如下I)或2)或3)的步驟I)將所述組合物中的所述探針，以及所述組合物中所述引物對的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝；2)將所述引物對中的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝；3)將所述探針單獨包裝。上述組合物或引物對或探針或試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帯番茄嚴(yán)重曲葉病毒(Tomatosevere leaf curl virus, ToSLCV)的方法具體可包括如下步驟以分離自所述待測樣品的DNA為模板，利用上述組合物或引物對或探針或試劑盒進(jìn)行PCR檢測,從而確定所述待測樣品中是否攜帶番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)。在本發(fā)明中所述PCR具體為實時熒光PCR。所述PCR的體系中，所述引物對中的兩條引物以及所述探針的摩爾比可為I :1 :1。在本發(fā)明的一個實施例中，反應(yīng)起始時，所述引物對中的兩條引物的濃度，以及所述探針的濃度均為0. 2 μ mol/L。所述PCR的退火溫度可為60°C。在本發(fā)明的一個實施例中，所述實時熒光PCR的反應(yīng)參數(shù)具體如下50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 5s,60°C lmin，共 40 個循環(huán)。本發(fā)明根據(jù)番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)外殼蛋白基因保守區(qū)序列，設(shè)計用于實時熒光PCR檢測的引物對(序列I和序列2)及探針(序列3)，通過對反應(yīng)的退火溫度的優(yōu)化建立了該病毒的實時熒光PCR檢測方法。實驗證明該方法可以檢測待測樣品中是否攜帶番爺嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)，且具有快速靈敏及特異性強的優(yōu)點。


圖I為實時熒光PCR技術(shù)檢測番茄嚴(yán)重曲葉病毒的特異性實驗結(jié)果。其中，標(biāo)號為I的曲線為ToSLCV DNA的擴(kuò)增曲線；其余曲線為非洲木薯花葉病毒(African cassavamosaic virus, ACMV) DNA、棉花曲葉病毒(Cotton leafcurl virus, CLCuV) DNA 和番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) DNA 的擴(kuò)增曲線。圖2為實時熒光PCR技術(shù)檢測番茄嚴(yán)重曲葉病毒的靈敏度實驗。其中，曲線1-8均為ToSLCV DNA的擴(kuò)增曲線，分別是5^5^5^5^5^5^57和58倍比稀釋；曲線9為空白對照的擴(kuò)增曲線。圖3為普通PCR檢測番茄嚴(yán)重曲葉病毒的靈敏度實驗結(jié)果。其中，泳道1-8依次為5\52,53,5\55,56,57 58倍比稀釋;泳道9為空白對照;泳道M為DNA Marker DM500。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的試劑盒的制備根據(jù)番爺嚴(yán)重曲葉病韋(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)外殼蛋白基因(GenBank No. AJ850209. I)的公開序列,采用探針設(shè)計軟件Express2. O設(shè)計探針及引物,用于制備試劑盒。試劑盒由如下引物對和探針(TaqMan探針)組成。引物對正向引物(ToSLCVF):5' -GTTGGTAAACGTTTCTGCGTTAAGTC-3 '(序列 I，GenBankNo. AJ850209. I 的第 152-177 位)反向引物(ToSLCVR)5 ' -GTGTGGTTCTTCAGCTTGATGTT-3 '(序列 2，GenBankNo. AJ850209. I的第212-234位的反向互補序列)探針(ToSLCVP):5 ' -ATATTAGGGAAGATCTGGAT-3 '(序列 3，GenBankNo. AJ850209. I 的第 185-204 位)探針ToSLCVP的5’端用報告熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)TAMRA標(biāo)記。實施例2、鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的試劑盒的特異性檢測用實施例I制備的試劑盒分別以感染番茄嚴(yán)重曲葉病毒的番茄葉片(葉片表現(xiàn)嚴(yán)重曲葉，病毒英文名Tomato severe leaf curl virus,記載在First Report ofTomato severe leaf curl virus in Mexico, 2006, 9 (8) :1116.公眾可從中國檢驗檢疫科學(xué)研究院獲得)、感染非洲木薯花葉病毒的木薯葉片(葉片表現(xiàn)花葉，病毒英文名African cassava mosaic virus, ACMV,記載在Multiplex PCR for the detection of African cassava mosaic virus and East Afrcan cassava mosaic Cameroon virusin cassava, 2008, 154:111-120.公眾可從中國檢驗檢疫科學(xué)研究院獲得)和感染番茄黃化曲葉病毒的番爺葉片(葉片表現(xiàn)黃化曲葉，病毒英文名Tomato yellow leaf curlvirus，TYLCV，記載在北京番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生及分子檢測，2010，(I) :28-30.公眾可從中國檢驗檢疫科學(xué)研究院獲得)為實驗材料，檢測其是否攜帯有番茄嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curl virus, ToSLCV),以驗證該試劑盒的特異性。姆個樣品采用相同的檢測方法，包括樣本總DNA的提取和實時熒光PCR兩個步驟。一、樣品總DNA的提取取0. Ig (鮮重)樣品，取適量液氮研磨后，按照植物病毒吸附DNA提取試劑盒(武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司，產(chǎn)品目錄號EX1010)的操作步驟提取DNA。ニ、實時熒光PCR分別以步驟ー獲得的各樣品的總DNA為模板進(jìn)行實時熒光PCR。
實時突光PCR 反應(yīng)體系2XGoldStar Taqman Mixture (Cffbio. Co. Ltd,Cat#CW0932) 10 μ I ；DNA 模板 2 μ I ;ToSLCVF、ToSLCVR 及 ToSLCVP (濃度均為 10 μ mol/L)各0. 4 μ L ；DEPC-H20補至20 μし該反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始吋，上下游引物以及探針的濃度均為0. 2 μ mol/L。同時以水代替DNA模板作為空白対照。將樣品管放入Roche LightCycler 480 II突光PCR儀后,設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 個循環(huán)；60°C收集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。結(jié)果如圖I所示，只有感染番茄嚴(yán)重曲葉病毒的番茄葉片這一祥品，通過實時熒光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，而其它樣品與空白對照一祥，熒光強度均沒有變化，表明所設(shè)計的探針引物對番茄嚴(yán)重曲葉病毒具有良好的特異性。實施例3、鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的試劑盒的靈敏度檢測用DEPC水按51、52、53、54、55、56、57和58倍比，將實施例2中的感染番茄嚴(yán)重曲葉病毒的番茄葉片的DNA (ToSLCV的DNA)進(jìn)行稀釋，分別作為DNA模板，進(jìn)行實時熒光PCR檢測，同時以普通PCR作為對照。實時熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均如實施例2所述。不同稀釋度的DNA模板在20 μ L反應(yīng)體系中，終濃度由大到小以此為15ng/ μ L、3ng/ μ L、0. 6ng/ μ L、120pg/ μ L、24pg/μ L、4. 8pg/μ L、960fg/μ L、192fg/μ L。普通PCR反應(yīng)體系(20μL):10XPCR buffer(含Mg2+)2 μ L，dNTP MixtureC IOmmol/L) 0· 6 μ L, ToSLCVF 及 ToSLCVR (均為 10 μ mol/L)各 0· 5 μ L，2U/ μ L Taq 酶 I μ L, DNA 模板 2 μ L，以及 DEPC-H2O 13. 4 μ し反應(yīng)程序94で5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)；72で 8min。實時熒光PCR檢測結(jié)果如圖2所示，對ToSLCV DNA的最低檢測限是57稀釋度(960fg/yL)。普通PCR檢測結(jié)果如圖3所示，對ToSLCV DNA的最低檢測限是56稀釋度(4. 8pg/y L)(大小為 83bp 的目的條帶，GenBank No. AJ850209. I 的第 152-234)。這表明，利用實施例I制備的試劑盒對ToSLCV DNA進(jìn)行實時熒光PCR比普通PCR靈敏度高約5倍。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的組合物，由一個引物對和一個探針組成的組合物；所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。
2.鑒定或輔助鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的引物對或探針； 所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，或權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于所述探針的5’端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有TAMRA熒光基團(tuán)。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述組合物，或所述引物對，或所述探針在制備用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒的試劑盒，包含有權(quán)利要求1-3中任一所述組合物，或所述引物對，或所述探針。
6.權(quán)利要求5所述試劑盒的制備方法，包括如下I)或2)或3)的步驟 1)將權(quán)利要求I或3所述組合物中的所述探針，以及所述組合物中所述引物對的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝； 2)將權(quán)利要求2所述引物對中的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝； 3)將權(quán)利要求2或3所述探針單獨包裝。
7.權(quán)利要求1-3中任一所述組合物，或所述引物對，或所述探針，或權(quán)利要求5所述試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒中的應(yīng)用。
8.檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒的方法，包括如下步驟以分離自所述待測樣品的DNA為模板，利權(quán)利要求1-3中任一所述組合物，或所述引物對，或所述探針，或權(quán)利要求5所述試劑盒進(jìn)行PCR檢測，從而確定所述待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述PCR的體系中，所述引物對中的兩條引物以及所述探針的摩爾比為I :1 :1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述方法，其特征在于所述PCR的退火溫度為60°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒的引物和探針及其檢測方法。本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定番茄嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV)的組合物，該組合物由一個引物對和一個探針組成的組合物；所述引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。實驗證明利用本發(fā)明所提供的引物和探針通過實時熒光PCR的方法可以檢測待測樣品中是否攜帶番茄嚴(yán)重曲葉病毒(Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV)，且該方法具有靈敏準(zhǔn)確特異性好的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK102676696SQ20121014094
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 牟海青, 辛言言, 魯潔 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院