專利名稱：一種在植物柱頭和花托特異性表達(dá)β-D-葡糖醛酸酶基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域中一種柱頭和花托特異表達(dá)的植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及一段來源于擬南芥CiraAiiZoASi1S thaliana、一果膠酶基因(AtIgl7150、啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)的時(shí)間與水平對(duì)生物的發(fā)育極其重要，而基因表達(dá)的調(diào)控包括反式作用因子與順式調(diào)控元件的特異性結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始，進(jìn)而使基因得到時(shí)空性表達(dá)。啟動(dòng)子是基因的一段DNA序列，它通常位于結(jié)構(gòu)基因的5’端，可以被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟始轉(zhuǎn)錄。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可以將其分為三類組成性啟動(dòng)子(即能使調(diào)控基因在所有組織或器官中均表達(dá))；組織特異性啟動(dòng)子(即使調(diào)控基因僅在特定組織或器官中表達(dá))；誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(即僅在內(nèi)外環(huán)境刺激誘導(dǎo)條件下才能調(diào)控下游基因表達(dá))?？梢?，啟動(dòng)子是影響基因表達(dá)效率的重要因素之一。在植物中，由于組織特異性啟動(dòng)子所指導(dǎo)的基因僅在特定發(fā)育時(shí)空表達(dá)，這就是目的基因產(chǎn)物僅在某一空間累積，增加區(qū)域表達(dá)量，避免了植物營養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。因而在現(xiàn)代植物分子遺傳工程中，組織特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用范圍愈來愈廣。如葉片特異表達(dá)啟動(dòng)子 RbcS (EMBO J. 1990，9:1717-1726)，CahiEMBO J. 1996，15:3732-3743)，WL21 (MoI Cell Biol. 1993，13:2614-2622)等；維管束特異性啟動(dòng)子 GRPl. 8 O0ZafliCell. 1991，10:1051-1061)，Pal2 O0Zafli /· 1995，6:859-876)，0sgrp-2 O0Zaflia.2003，216:824-833)等；果實(shí)特異性啟動(dòng)子 EAO0Zafli1992，100:2013-2017)，m (Plant Mol Biol. 1998，37:1001-1011), Q{Plant Mol Biol. 1995，28:423-435)和 SAllG0Zafli Mol Biol. 1993，21:625-640)等；根特異性啟動(dòng)子 TobRB7 O0Zafli Cell.1991，3:371-382);花藥、花粉特異性啟動(dòng)子 TA29 O0Zafli Cell. 1990, 2:1201-1224)，QAOiPlant Mol Biol. 2001，45:577-585)，Lat^2 {Plant Mol Biol. 1998，37:859-869)等；韌皮部特異性啟動(dòng)子PP2 {Transgenic Res. 2004, 13:559-566)等；種子特異性啟動(dòng)子 GluB-IO0Zafli J. 2000，23:415-421)，PBFO0Zafli Cell Phyisol. 2004，45:1509-1518)等。植物花器官及莢果是植物繁殖的重要器官，因此尋找該部位特異性表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種都具有重要的作用。本發(fā)明提供一種新的植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠調(diào)控目的基因在植物柱頭和花托處表達(dá)，并且該活性一直持續(xù)到莢果的整個(gè)發(fā)育期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供擬南芥一果膠酶基因的啟動(dòng)子序列(SEQ IDNo. I),以及該序列在植物基因工程中用于柱頭和花托特異性表達(dá)的用途，為后續(xù)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明從擬南芥中克隆了果膠酶A2g7775 基因啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO. 1)，并研究了該序列調(diào)控β-D-葡糖醛酸酶Wtt )基因的表達(dá)。本發(fā)明公開了一種在植物柱頭和花托特異性表達(dá)β -D-葡糖醛酸酶基因的方法，是將擬南芥一果膠酶J775 基因啟動(dòng)子DNA片段克隆到歷fldIII和雙酶切的雙元表達(dá)載體PBI121中，構(gòu)建啟動(dòng)子表達(dá)載體P::⑶S，將構(gòu)建好的表達(dá)載體P::⑶S轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，取含表達(dá)載體P: GUS的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。本發(fā)明還公開了擬南芥一果膠酶基因的啟動(dòng)子在植物柱頭和花托處特異表達(dá)β-D-葡糖醛酸酶基因中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供所述的基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中能使目的基因在植物柱頭和花托特異性表達(dá)的用途，該活性一直持續(xù)到莢果的整個(gè)發(fā)育期。所述的植物優(yōu)選為擬南芥。所述的目的基因優(yōu)選為基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的DNA片段是一啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有特異的表達(dá)活性，特異在植物柱頭和花托表達(dá)，并且該活性一直持續(xù)到莢果的整個(gè)發(fā)育期。本發(fā)明啟動(dòng)子為特異表達(dá)的基因功能研究及植物轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具，具有重要意義。


圖I為PCR克隆擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子片段，P (啟動(dòng)子)，M (分子量標(biāo)準(zhǔn)物):DL2000 ； 圖2為構(gòu)建的啟動(dòng)子表達(dá)載體(P: :GUS)結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為P: AUS轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花器官⑶S組織化學(xué)染色圖。圖4為P: AUS轉(zhuǎn)基因擬南芥植株莢果⑶S組織化學(xué)染色圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :全長(zhǎng)啟動(dòng)子克隆與中間載體構(gòu)建
以擬南芥thaliana, Columbia ecotype)葉片為材料，用 CTAB 法(.EMBO J 1987, 6:3901-3907)提取植物總DNA。以植物總DNA為模板，通過特異引物擴(kuò)增果膠酶J tlgl725 基因的啟動(dòng)子片段。合成引物primer-Ι (5 ’ - AAGCTTGTATACAGGTTTTAGTAGTTGAT-3’，SEQ ID NO. 2,引入了 ZffndIII 位點(diǎn))、和 primer-2 (5，-GGATCCAATGCACGGCGCCATCTTCTTCT -3’，SEQ ID NO. 3，引入了漢·ΗΙ 位點(diǎn))。擴(kuò)增出 581bp啟動(dòng)子片段(命名為P)(圖I)。PCR產(chǎn)物P直接與pGEM-T (購自Promega公司)克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)菌株，篩選陽性克隆(內(nèi)含有啟動(dòng)子片段P)。實(shí)施例2 =GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建
用限制性酶VifldIII和雙酶切實(shí)施例I中的陽性克隆及雙元表達(dá)載體PBI121(北京天恩澤基因科技有限公司)，將酶切后的全長(zhǎng)啟動(dòng)子及缺失啟動(dòng)子片段分別與PBI121酶切片段連接，構(gòu)建啟動(dòng)子表達(dá)載體(P: :GUS)(圖2)，分別把它們轉(zhuǎn)化到DH5 a大腸桿菌感受態(tài)菌株中，進(jìn)行擴(kuò)繁。實(shí)施例3 :農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
將構(gòu)建好的表達(dá)載體(P::⑶S)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞EHA10國家微生物資源庫(產(chǎn)品ID為20110114049)中。具體方法如下構(gòu)建的表達(dá)載體(P::⑶S)大腸桿菌菌株接種到IOml含Km (50 μ g/ml) LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提質(zhì)粒，為后續(xù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌備用。EHA105農(nóng)桿菌菌株接種5ml含Sm (50μ g/ml)YEP液體培養(yǎng)基中，28°C下200rpm培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集菌體，用O. IM冰凍CaCl2重懸，冰上放置20分鐘后，4°C下5000rpm離心2分鐘，收集的菌體用200 μ I O. IM冰凍CaCl2懸浮。然后加入制備好的表達(dá)載體質(zhì)粒(P:⑶S)，冰上放置20分鐘，_70°C放置10分鐘，37°C放置5分鐘后加入800 μ I不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)4小時(shí)后，離心收集菌體，用玻璃涂棒涂布與含有Km(50 μ g/ml)和Sm (50μ g/ml)的YEP固體培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)2天。用特異性引物(primer-1/primer-2)對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定,篩選陽性克隆。實(shí)施例4 :擬南芥轉(zhuǎn)化及鑒定
取含表達(dá)載體(P::⑶S)的農(nóng)桿菌(實(shí)施例3中已構(gòu)建)菌液20μ1，加入5ml YEP, 28 °C恒溫振搖過夜，將此5ml菌液倒入250ml含Km (50 μ g/ml)和Sm (50 μ g/ml)的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C恒溫振搖過夜，農(nóng)桿菌的濃度應(yīng)達(dá)到0D600=1. 8時(shí)，4000rpm離心15分鐘， 棄去上清，加入浸潤(rùn)培養(yǎng)基(l/2MS+5%蔗糖)，重懸后，加入表面活性劑Silwet-L77，使其終濃度達(dá)到O. 02%。將擬南芥植株的花序浸沒在菌液中，浸潤(rùn)持續(xù)2min，用保鮮膜覆蓋過夜后揭膜。正常生長(zhǎng)，收取種子。種子晾干后先用70%乙醇消毒10分鐘，再用10次氯酸鈉消毒5分鐘，最后用滅菌水沖洗5編。將滅菌好的擬南芥種子點(diǎn)在MS固體培養(yǎng)基(含30 μ g/ml Km抗生素)上，25°C人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)，2_3周后葉片發(fā)綠且根伸長(zhǎng)的即為疑似轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)這些植株提基因組DNA，用⑶S特異引物(上游引物5’ -GATGTCACGCCGTATGT-3’，SEQ ID NO. 4 和下游引物 5’ -CACACTCTGTCTGGCT-3’，SEQ IDNO. 5) PCR擴(kuò)增進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。選擇陽性苗，放于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)施例5:⑶S活性檢測(cè)
取實(shí)施例4中的陽性苗各器官(如花、葉、根、莖等)，分別置于GUS染色液(50mM磷酸緩沖液；5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；IOmMEDTA ；lmM X-Gluc)中，37°C溫育5小時(shí)，樣品經(jīng)75%乙醇脫水后觀察照相，如圖3 (花)，圖4 (莢果)。在其它組織器官均未觀察到GUS活性。
權(quán)利要求
1.一種在植物柱頭和花托特異性表達(dá)β-D-葡糖醛酸酶基因的方法，是將擬南芥一果膠酶基因啟動(dòng)子DNA片段克隆到歷/7dIII和雙酶切的雙元表達(dá)載體PBI121中，構(gòu)建啟動(dòng)子表達(dá)載體P::⑶S，將構(gòu)建好的表達(dá)載體P::⑶S轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，取含表達(dá)載體P: :GUS的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。
2.擬南芥一果膠酶基因的啟動(dòng)子在植物柱頭和花托處特異表達(dá)β-D-葡糖醛酸酶基因中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在植物柱頭和花托特異性表達(dá)β-D-葡糖醛酸酶基因的方法，是將擬南芥一果膠酶(At1g17150)基因啟動(dòng)子與目的基因構(gòu)建成表達(dá)盒，然后通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到擬南芥中。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的啟動(dòng)子具有特異表達(dá)活性，特異的在植物柱頭和花托處表達(dá)，并且該表達(dá)活性一直持續(xù)到莢果的整個(gè)發(fā)育期。本發(fā)明啟動(dòng)子為植物的轉(zhuǎn)基因育種及特異表達(dá)的基因功能研究提供了有利的工具，具有重要的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102864166SQ20121032901
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者曹軍, 劉海軍, 石峰 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)