專利名稱：高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及釀酒領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株，xqx-6，煙曲霉Aspergillus fumigatus保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為武漢大學，郵編為430072，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，及其篩選方法和使用方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶等組成，它可將纖維素分解成多糖或單糖。纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場潛力，已被國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人士看好，將是繼糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工業(yè)酶種，因此纖維素酶是酶制劑工業(yè)中的一個新的增長點。 纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、放線菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。纖維素細菌的纖維素酶產(chǎn)量不高，主要是葡聚糖內(nèi)切酶，而且大多數(shù)對結(jié)晶纖 維素沒有活性，所分泌的酶是胞內(nèi)酶或吸附在細菌細胞壁上，很少能分泌到細胞外。纖維素放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，研究很少。纖維素真菌產(chǎn)生的多為胞外酶，產(chǎn)酶效率高，而且纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理，同時產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等，是降解纖維素原料的主要類群。其中比較典型的有木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)。但產(chǎn)生纖維素酶的菌種多易退化，從而導(dǎo)致產(chǎn)酶能力降低。目前工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶有兩種方法，液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。液體發(fā)酵工藝控制簡單，容易擴大規(guī)模。但其生產(chǎn)原料多為葡萄糖，對生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境等都要求很高，且廢水處理量大，提高了生產(chǎn)成本。固態(tài)發(fā)酵法原料多采用纖維質(zhì)原料，來源廣泛，價格低廉，但其得到的是纖維素酶曲，后期萃取、濃縮較為困難。這就導(dǎo)致目前市場上見到的纖維素酶多為液體發(fā)酵得到的，價格相對較高。因此，解決固態(tài)發(fā)酵后期處理問題是目前纖維素酶菌種低廉、聞效利用的關(guān)鍵。中國白酒產(chǎn)量巨大，其廢棄產(chǎn)物白酒丟糟每年可產(chǎn)生上千萬噸。白酒丟糟主要含有纖維素，半纖維素和木質(zhì)素三種組分，此外還含有少量淀粉，粗蛋白等。其中僅少量白酒丟糟被用來生產(chǎn)動物飼料或產(chǎn)沼氣等，大部分白酒丟糟的利用已成為白酒廠亟待解決的問題。因此，利用白酒丟糟生產(chǎn)燃料酒精越來越受到大家的關(guān)注。但由于其自身結(jié)構(gòu)原因，需對白酒丟糟進行預(yù)處理后才能用來發(fā)酵產(chǎn)生酒精。采用化學處理方法一般都需要在高溫高壓下，不僅生產(chǎn)成本高，而且過程繁瑣，不易操作，用生物方法可以很好的解決這一問題，但纖維素酶價格卻較貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠提高白酒丟糟的發(fā)酵率。本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株，xqx-6,煙曲霉Aspergillusfumigatus保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC N0.M2012231。
本發(fā)明還提供了一種上述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，包括如下步驟A.通過纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基富集培育菌；B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取所述濾紙斷裂處的培養(yǎng)物并將其在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并進行纖維素分解；E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；F.通過水浴法提取粗酶液并進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。 所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養(yǎng)基優(yōu)選包括以重量份數(shù)計，NH4NO3I 份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaCl I. O 份，CaCl2O. I 份，F(xiàn)eCl3O. 02份，酵母膏O. 05份，水1000份；和/或，所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養(yǎng)基的PH值優(yōu)選為7. O 7. 2。所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養(yǎng)液1(Γ50份；所述Mandels營養(yǎng)液包括以重量份數(shù)計，ΚΗ2Ρ042000份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7Η203000 份、CaCl2300 份、FeSO4. 7H20 5 份、MnSO4L 6 份、氯化 ZnCl2L 7 份、CoC122. O 份、溶于1000份蒸餾水；和/或，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值優(yōu)選為5. O。在所述步驟A之前，所述篩選方法優(yōu)選進一步包括通過無菌水進行溶解；步驟A包括取所述溶解后的懸液加入到含有纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，靜置培養(yǎng)；和/ 或，所述步驟AJP /或所述步驟E中的培育溫度優(yōu)選為28 32°C，培養(yǎng)時間為5 7天；和/ 或， 所述步驟B的接種量優(yōu)選為10% ；和/ 或，所述步驟D的培養(yǎng)時間優(yōu)選為7 28天。所述步驟E優(yōu)選包括將步驟D得到的分解纖維素能力強的菌株培養(yǎng)成熟，刮下成熟的孢子，制成孢子菌懸液，取:T5mL的孢子菌懸液接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 32 °C下培養(yǎng)5、天。所述步驟F優(yōu)選包括在步驟E的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入80 100毫升蒸餾水，在40 50°C的水浴提取I 2小時；用四層紗布過濾；離心分離得上清液；離心速率優(yōu)選為3500轉(zhuǎn)/分鐘；對上清液進行纖維素酶酶活測定確定為高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株。本發(fā)明還提供一種利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的使用方法，包括利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株；所述菌株與釀酒酵母復(fù)配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發(fā)酵。所述白酒丟糟優(yōu)選為濕白酒丟糟。
通過本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠達到如下的有益效果I.本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法、使用方法，該菌株在篩選時經(jīng)過無機鹽培養(yǎng)基培育、接種、羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板劃線、將劃線得到的純菌株再進行無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)并纖維素分解，將分解能力強的接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，水浴法提取得到纖維素酶粗酶液；將此纖維素酶菌株同釀酒酵母、白酒丟糟、麩皮一起進行發(fā)酵，得到酒精。篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作，在發(fā)酵酒精中不需要添加多余的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質(zhì)成分產(chǎn)生可發(fā)酵糖類，進而發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。2.本發(fā)明中沒有將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的酶液提取出來制成纖維素酶，而是利用丟糟為發(fā)酵基質(zhì)，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)中產(chǎn)生的纖維素酶直接用于降解含大量纖維素的丟糟，即邊利用丟糟培養(yǎng)菌株產(chǎn)酶，邊利用產(chǎn)生的酶降解丟糟產(chǎn)生還原糖，不僅解決了纖維素酶固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的后期萃取問題，還為利用白酒丟糟生產(chǎn)酒精提供了一條廉價、無污染的有效途徑。3.本發(fā)明的篩選方法和使用方法均操作簡單，方法容易掌握，且原料來源廣泛，價格低廉,生產(chǎn)成本低。


為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，以下描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖所示實施例得到其它的實施例及其附圖。圖I為本發(fā)明一個實施例中高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法基本流程圖。該生物材料保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M2012231，保藏日期為2012年6月14日。
具體實施例方式以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明各實施例的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明所保護的范圍。本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，保藏日期為2012年6月14日，曲酶菌Aspergillusfumigatus。本發(fā)明還提供了一種上述高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，包括如下步驟A.通過纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基富集培育菌；B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取所述濾紙斷裂處的培養(yǎng)物并將其在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并進行纖維素分解；
E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；F.通過水浴法提取粗酶液并進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。本發(fā)明篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作。下面通過一些實施例來詳細描述下篩選過程，見圖1，所示101，選取待篩選的樣品；樣品的選取可以任意定，只要是通過纖維素發(fā)酵釀制的白酒即可，本發(fā)明的一個具體實施例中采用的是習酒2010年I月發(fā)酵31的大曲。102，將樣品通過無菌水進行溶解、稀釋；
具體的操作步驟為將樣品放入容器中，加入無菌水，振蕩，搖勻。103，將102溶解、稀釋的樣品通過無機鹽培養(yǎng)基培育菌；具體的操作步驟為取部分或全部102溶解、稀釋的樣品加入到裝有纖維素無機鹽培養(yǎng)基的容器中，在28 32°C靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5 7天。其中，無機鹽培養(yǎng)基包括=NH4NO3I份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaCl
I.O 份，CaCl2O. I 份，F(xiàn)eCl3O. 02 份，酵母膏 O. 05 份，水 1000 份；PH 值為 7. O 7. 2。上面的份數(shù)均為重量份數(shù)，水可以以水的密度換算成體積的方式。104，將103培養(yǎng)的菌在浸有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙上進行一次或多次接種；具體操作步驟為待103中培養(yǎng)的菌大量生長后，按一定的接種率(比如10%)接種到滲有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙條上，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，待菌體大量生長后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的無機鹽培養(yǎng)液中，接種率與上次相同，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代。105，獲取所述濾紙斷裂處的培養(yǎng)物并將其在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；具體操作步驟經(jīng)過104多次接種后，觀察濾紙的斷裂情況，在濾紙斷裂處挑取培養(yǎng)物在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上劃線分離，28°C培養(yǎng)獲得單菌落。為了得到較純的菌株，可以進行反復(fù)劃線純化，期間可以結(jié)合顯微鏡鏡檢，直至純化得到純菌株。106，將105得到的純菌株在無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并進行纖維素分解；具體操作步驟為將105得到的純菌株進行均分，放入裝有同樣的無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同試管中，其中每個試管中浸泡一條濾紙，濾紙寬度依易于放入試管為宜，濾紙長度為5-7厘米。室溫培養(yǎng)7 28天，然后觀察每個試管中濾紙的分解情況，從中判斷菌株分解纖維素的能力。107，將106中纖維素分解能力強的所述純菌株接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；具體操作步驟為將106中得到的分解纖維素能力強的菌株培養(yǎng)成熟，刮孢子懸液接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 32°C下培養(yǎng)5-9天。所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括以重量份數(shù)計，白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養(yǎng)液1(Γ50份；所述Mandels營養(yǎng)液包括按重量份數(shù)計，ΚΗ2Ρ0420 00份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7Η20 3000 份、CaCl2300 份、FeSO4. 7H20 5 份、MnSO4L 6 份、氯化 ZnCl2L 7 份、CoC122. O份、溶于1000份蒸餾水；和/或，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為5. O。108，通過水浴法提取粗酶液并進行酶活力測試得到高產(chǎn)纖維素酶活力的纖維素酶菌株。具體操作步驟為向發(fā)酵后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蒸餾水，在4(T50°C水浴提取廣2小時，用多層紗布過濾(比如四層紗布)得到的液體紀委粗酶液。對粗酶液進行離心分離，離心速率為3500轉(zhuǎn)/分鐘，收集離心后的上清液。根據(jù)纖維素酶制劑輕工行業(yè)標準(QB2583-2003)對纖維素酶酶活力進行測定，選出高活力產(chǎn)纖維素酶的菌株。下面，通過一個較為具體的實施例來描述篩選方法實施例I :本實例所用原料為習酒2010年I月發(fā)酵31的大曲。稱取該大曲樣品10g，置于250mL裝有小玻璃珠的三角瓶中，加入90mL無菌水120r/min振蕩lOmin。取ImL懸液加入到纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C靜置培養(yǎng)。待菌體大量生長后，按10%接種到裝有濾紙條的無機鹽培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)數(shù)天，待菌體大量生長后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)液中，接種量為10%，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物。觀察濾紙條斷裂情況，在濾紙條斷裂處挑取培養(yǎng)物在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上劃線分離， 28°C培養(yǎng)獲得單菌落。將單菌落反復(fù)劃線純化，結(jié)合顯微鏡鏡檢，純化得到純菌株即為具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。以白酒丟糟為碳源，從上述中篩選的菌株中篩選優(yōu)良的高產(chǎn)纖維素酶的菌株。250mL三角瓶中裝入以白酒丟糟為碳源的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。開始發(fā)酵前，接入培養(yǎng)成熟的孢子菌懸液5mL,于28°C下培養(yǎng)靜止培養(yǎng),每天搖瓶一次。培養(yǎng)過程中定時取樣，以檢測固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中各纖維質(zhì)成分的變化和纖維素酶活力。篩選出產(chǎn)纖維素酶活力最高的菌株xqx-6，煙曲霉AspergiIIus fumigatus保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為武漢大學，郵編為430072，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，保藏日期為2012年6月14日。本發(fā)明還提供了一種利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的使用方法，包括A.利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株；B.所述菌株與釀酒酵母復(fù)配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發(fā)酵。本發(fā)明在發(fā)酵酒精中不需要添加多余的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質(zhì)成分產(chǎn)生可發(fā)酵糖類，進而發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。釀酒酵母可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的任意一種釀酒酵母。在本方法中，白酒丟糟為碳源，麩皮為氮源。本發(fā)明的酒精產(chǎn)率約為2% 7%，以干白酒丟糟計。所述白酒丟糟優(yōu)選為濕白酒丟糟。下面將通過幾個較為具體的實施例來詳細描述本使用方法實施例2 :利用實施例1中篩選的菌株xqx-6以白酒丟糟為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)酒精。IOOOmL三角瓶中裝入干白酒丟糟55g，麩皮27g，硫酸銨18g，水500mL，121°C高溫蒸煮20min。冷卻后接入xqx_6種子液25mL,安琪酵母種子液25mL,于30°C下直徑培養(yǎng)15d。其酒精產(chǎn)率為5%。實施例3 :利用實施例I中篩選的菌株xqx-6以白酒丟糟為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)酒精。IOOOmL三角瓶中裝入濕白酒丟糟500g,水50mL, 121°C高溫蒸煮20min。冷卻后接入xqx_6種子液20mL，安琪酵母種子液20mL，于28°C下直徑培養(yǎng)20d。其酒精產(chǎn)率為3%。
實施例4 :利用實施例2中篩選的菌株xqx-6以爆破白酒丟糟為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)酒精。250mL三角瓶中裝入爆破的白酒丟糟50g (爆破條件添加I倍干秸桿量的O. IM 丁酮溶劑，于溫度175°C，壓力3. IMPa,維壓時間7min后爆破，物料于溫度75°C干燥8h脫毒)，水400mL，121 °C高溫蒸煮20min。冷卻后接入xqx-6種子液10mL，安琪酵母種子液10mL，于37°C下靜止培養(yǎng)10d。其酒精產(chǎn)率為7%。注安琪牌釀酒酒精酵母由湖北安琪酵母公司提供。通過本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠達到如下的有益效果1.本發(fā)明提供一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法、使用方法，該菌株在篩選時經(jīng)過無機鹽培養(yǎng)基培育、接種、羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板劃線、將劃線得到的純菌株再進行無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)并纖維素分解，將分解能力強的接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，水浴法提取得到纖維素酶粗酶液；將此纖維素酶菌株同釀酒酵母、白酒丟糟、麩皮一起進行發(fā)酵，得到酒精。篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作，在發(fā)酵酒精中不需要添加多余的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質(zhì)成分產(chǎn)生可發(fā)酵糖類，進而發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。2.本發(fā)明中沒有將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的酶液提取出來制成纖維素酶，而是利用丟糟為發(fā)酵基質(zhì)，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)中產(chǎn)生的纖維素酶直接用于降解含大量纖維素的丟糟，即邊利用丟糟培養(yǎng)菌株產(chǎn)酶，邊利用產(chǎn)生的酶降解丟糟產(chǎn)生還原糖，不僅解決了纖維素酶固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的后期萃取問題，還為利用白酒丟糟生產(chǎn)酒精提供了一條廉價、無污染的有效途徑。3.本發(fā)明的篩選方法和使用方法均操作簡單，方法容易掌握，且原料來源廣泛，價格低廉,生產(chǎn)成本低。本發(fā)明提供的各種實施例可根據(jù)需要以任意方式相互組合，通過這種組合得到的技術(shù)方案，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若對本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也包含這些改動和變型在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株，其特征在于，xqx-6,煙曲霉Aspergillusfumigatus，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M 2012231。
2.—種權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟 A.通過纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基富集培育菌； B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙上進行一次或多次接種； C.獲取所述濾紙斷裂處的培養(yǎng)物并將其在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株； D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并進行纖維素分解； E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； F.通過水浴法提取粗酶液并進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。
3.如權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特征在于， 所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養(yǎng)基包括以重量份數(shù)計，NH4NO3I 份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaClI. O 份，CaCl2O. I 份，F(xiàn)eCl3O. 02 份，酵母膏O. 05份，水1000份；和/或，所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養(yǎng)基的pH值為7. O 7. 2。
4.如權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特征在于， 所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括以重量份數(shù)計，白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養(yǎng)液10^50份；所述Mandels營養(yǎng)液包括按重量份數(shù)計，KH2P042000份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7H20 3000份、CaCl2 300份、FeSO4. 7H20 5份、MnSO4L 6份、氯化ZnCl2L 7份、CoC122. O份、溶于1000份蒸餾水；和/或,所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5. O。
5.如權(quán)利要求2-4任一項所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法,其特征在于， 在所述步驟A之前，所述篩選方法進一步包括通過無菌水進行溶解；步驟A包括取所述溶解后的懸液加入到含有纖維素無機鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，靜置培養(yǎng)； 和/或， 所述步驟AjP /或所述步驟E中的培育溫度為28 32°C，培養(yǎng)時間為5 7天； 和/或， 所述步驟B的接種量為10% ； 和/或， 所述步驟D的培養(yǎng)時間為7 28天。
6.如權(quán)利要求2-4任一項所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特征在于， 所述步驟E包括 將步驟D得到的分解纖維素能力強的菌株培養(yǎng)成熟，刮下成熟的孢子，制成孢子菌懸液，取:T5mL的孢子菌懸液接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 32°C下培養(yǎng)5、天。
7.如權(quán)利要求6所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特征在于，所述步驟F包括 在步驟E的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入80 100毫升蒸餾水，在40 50°C的水浴提取I 2小時；用四層紗布過濾；離心分離得上清液；離心速率優(yōu)選為3500轉(zhuǎn)/分鐘； 對上清液進行纖維素酶酶活測定確定為高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株。
8.一種利用權(quán)利要求2-7任一種所述的篩選方法篩選的權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的使用方法，其特征在于，包括 利用權(quán)利要求2-7任一種所述的篩選方法篩選的權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株； 所述菌株與釀酒酵母復(fù)配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發(fā)酵。
9.如權(quán)利要求8所述的高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株的使用方法，其特征在于， 所述白酒丟糟為濕白酒丟糟。
全文摘要
本發(fā)明涉及釀酒領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法。本高產(chǎn)纖維素酶活力的菌株為曲霉菌，該篩選包括A.通過無機鹽培養(yǎng)基富集培育菌；B.將A富集培育的菌在浸有無機鹽培養(yǎng)基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取濾紙斷裂處的培養(yǎng)物并將其在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將C得到的純菌株在無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并進行纖維素分解；E.將D中纖維素分解能力強的純菌株接種于滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；F.通過水浴法提取粗酶液并進行酶活力測試得到高產(chǎn)纖維素酶菌株。該菌株與釀酒酵母復(fù)配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發(fā)酵。本發(fā)明能夠提高白酒丟糟的發(fā)酵率。
文檔編號C12R1/865GK102876589SQ20121039503
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者鐘方達, 胡峰, 唐云容, 李波, 楊開梅, 張文學, 趙盈盈, 吳正云, 鐘霞 申請人:貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司