專利名稱：一種基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸雜交檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法。
背景技術(shù)：
微小RNA CmiRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的長度為19_23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等過程。自從1993年Lee等最早在Caenorhabditis eIegan中發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控線蟲時序發(fā)育的lin_4后，人們對研究這些小分子在動植物基本生命過程中的重要作用產(chǎn)生了極大興趣。大量的研究表明異常的miRNAs表達(dá)水平與人類多種類型的癌癥直接相關(guān)(Nature ReviewsCancer, 2006, 6，259-269)，并且還發(fā)現(xiàn)血清和唾液中的miRNAs可以穩(wěn)定存在而不被降解(Proc. Natl. Acad. Sci, 2008, 105，10513-10518)，這些性質(zhì)突顯了 miRNAs 作為癌癥早期診·斷和無創(chuàng)診斷的標(biāo)志物的價值和意義。無論是基礎(chǔ)生物學(xué)研究還是癌癥的早期診斷和篩選都迫切需要定量檢測miRNAs的方法，然而由于miRNAs在體內(nèi)的含量極少，序列短，相似性高并且容易被環(huán)境中的RNA酶降解等難點使得miRNAs的檢測一直面臨很多的技術(shù)挑戰(zhàn)。Northern blotting —直被公認(rèn)為是miRNAs檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是由于它操作繁瑣，費時費力，靈敏度相對較低并且樣品需要量大(IOyg樣品)等缺點使得它不適用于常規(guī)的臨床診斷上。定量PCR (qPCR)和微芯片技術(shù)也是人們常用的miRNAs檢測方法，但這些方法常常需要昂貴的儀器，復(fù)雜的操作,對miRNAs進行標(biāo)記等,無法滿足miRNAs床邊檢測(point-of-care tests, POCTs)的全部要求，例如不需要標(biāo)記，不需要放大，在檢測非常少的血清樣品中miRNAs具有足夠高的靈敏度和選擇性，能夠很好的區(qū)分miRNAs家族中f 2堿基的錯配，廉價且便攜適用于小型臨床或者家庭診斷等。電化學(xué)傳感器被認(rèn)為是最有希望實現(xiàn)POCT的器件，目前已經(jīng)有一些廉價而且小體積的電化學(xué)檢測器存在(如基于電化學(xué)原理的家用血糖儀)(Nat.Protoc. ,2007. 2，2888-2895 ；Nature Chemistry, 2011. 3，697-703)。但是電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度常常由于異相電極表面的傳質(zhì)過程減慢和表面擁擠效應(yīng)的影響使探針分子與目標(biāo)DNA或RNA分子之間很難接觸而受限制。目前的電化學(xué)傳感器檢測miRNAs的靈敏度大多在pM-fM范圍，無法在不進行PCR前處理情況下直接檢測十分微量的miRNAs。納米結(jié)構(gòu)表面的界面加工可以從熱力學(xué)和動力學(xué)上大大改善分子間的識別能力，這一觀點已經(jīng)從理論和實驗上都得到了證明(NatureNanotechnology, 2009. 4, 844-848 ；Nature Biotechnology, 2008. 26, 417-426)。隨著DNA納米技術(shù)的快速發(fā)展,人們已經(jīng)可以高度可控地自下而上地組裝精巧的DNA納米結(jié)構(gòu)。DNA納米結(jié)構(gòu)的界面工程在不需要借助工藝水平上的微加工技術(shù)就可以很方便的控制從溶液到空間立體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，并且能夠增加表面探針與目標(biāo)分子的接觸機會。我們之前的研究也已經(jīng)證明三維DNA納米結(jié)構(gòu)探針的三個頂點修飾巰基可以快速而又牢固地吸附到電極表面，形成有序、均相的DNA納米結(jié)構(gòu)自組裝單分子層(SAM)用于生物傳感研究(Adv. Mater. ,2010，22，4754-4758)。在此基礎(chǔ)上，利用DNA三維納米結(jié)構(gòu)來進行DNA檢測的方法也陸續(xù)出現(xiàn)，但是由于DNA和miRNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)存在著巨大的差異，因此用于檢測DNA的方法能否用于檢測miRNA完全是無法預(yù)測的。例如專利申請(CN201010119941.9)公開了一種利用DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針用于檢測目標(biāo)DNA的方法，其中，目標(biāo)DNA、DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針、DNA信號探針共同形成夾心結(jié)構(gòu)，然 后利用電化學(xué)檢測進行定量分析。同樣，由于miRNA序列非常短(22nt左右)，與DNA探針進行雜交時的溶解溫度(Tm)很低，因此不適用于形成夾心結(jié)構(gòu)進行電化學(xué)檢測。如果將待測的miRNA分成兩段與DNA探針進行雜交，所涉及的Tm值會更低，常溫下不穩(wěn)定。因此，與形成夾心結(jié)構(gòu)的檢測方法相比，人們通常會選擇與之截然不同的方法來對miRNA進行檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的超靈敏的電化學(xué)miRNA的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法需要大量的目標(biāo)miRNAs等缺點。本發(fā)明提供一種基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，包括(I)通過自組裝的方法合成DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針，所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針包括延伸出的一段識別序列；(2)將所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面；
(3)將目標(biāo)miRNA與所述工作電極表面的所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針雜交；(4)加入氧化還原酶和相應(yīng)的底物，使用電化學(xué)裝置進行電化學(xué)檢測。通過上述簡單的步驟，本發(fā)明提供了一種高靈敏度的檢測miRNA的方法，該方法操作簡單、不需要對目標(biāo)miRNA進行標(biāo)記和PCR擴增，具有成本低廉等優(yōu)勢。在所述步驟(I)中，所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針是由四條單鏈DNA自組裝形成的四面體探針，所述的四條單鏈DNA中的三條單鏈DNA的5’端修飾有巰基，另一條單鏈DNA在一端延伸出所述識別序列。通過調(diào)整三條修飾有巰基的單鏈DNA的堿基數(shù)目，本發(fā)明所提供的方法可以根據(jù)實際需要調(diào)整該DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針從工作電極表面突伸出的高度。通過調(diào)整識別序列，本發(fā)明所提供的方法可以根據(jù)目標(biāo)miRNA的堿基進行適應(yīng)性調(diào)整，從而滿足各種不同的檢測要求。在所述步驟(2)中，還包括將另一 DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到所述電化學(xué)裝置的工作電極表面，所述另一 DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針不具有所述識別序列。通過同時將具有識別序列的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針和不具有識別序列的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針同時組裝到工作電極表面，可以調(diào)節(jié)工作電極表面的探針密度。由于該探針密度對于雜交效率的影響是十分關(guān)鍵的，通過該可選的步驟，可以找到最佳的組裝密度以適合低濃度miRNA的雜交，從而提聞靈敏度。在所述步驟(2)中，所述的電化學(xué)裝置的工作電極是金電極，通過巰基和金之間的金硫鍵將所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面。該金硫鍵可以將探針牢牢地固定于工作電極表面，無需其他輔助分子維持探針在界面上的形態(tài)，取向。DNA信號探針、所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針與所述目標(biāo)miRNA形成夾心結(jié)構(gòu)。雖然通常來說識別序列無法與miRNA形成夾心結(jié)構(gòu)用于電化學(xué)檢測，但是本發(fā)明通過將識別序列負(fù)載在DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針上，最終結(jié)合DNA信號探針與miRNA形成了夾心結(jié)構(gòu)用于電化學(xué)檢測，克服了現(xiàn)有技術(shù)中在檢測miRNA時的偏見，這也就從一個側(cè)面體現(xiàn)出本發(fā)明所涉及的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的在穩(wěn)定性上的優(yōu)勢。在所述步驟(3)中，所述DNA信號探針的序列和所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的所述識別序列彼此相鄰地與所述目標(biāo)miRNA的整個序列互補。即DNA信號探針的序列和DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的識別序列無間隔地相連，兩者之間不具有缺口地與miRNA互補，從而利用DNA與RNA之間的氫鍵作用以及DNA之間的堿基堆積作用增強了 miRNA雜交的穩(wěn)定性。與在先申請CN201010119941. 9中的DNA信號探針與識別序列之間具有缺口相比，這也是本發(fā)明的又一突破。在所述步驟(3)中，所述目標(biāo)miRNA的濃度為IOaM-IOnM,優(yōu)選為10fM-10nM。利用單鏈DNA探針作為對照的實驗表明，具有識別序列的單鏈DNA (不具有DNA三維納米結(jié)構(gòu))的探針在濃度低于IOpM時就很難與背景電流區(qū)分，在濃度高于IOpM而低于IOnM的時候信號偏差較大。換句話說，不具有DNA三維納米結(jié)構(gòu)的探針無法用于檢測IOpM以下的miRNA，用于檢測IOpM-IOnM的miRNA時誤差很大。而本發(fā)明的方法通過參數(shù)的調(diào)節(jié)，例如氧化還 原酶的替換，卻能夠檢測低至IOaM的miRNA，而且檢測都相當(dāng)精確，這一點從各個附圖中的平滑曲線可以看出。在所述步驟(3)中，所述目標(biāo)miRNA的序列選自SEQ ID NO: IU SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22。當(dāng)所述miRNA 的序列選自 SEQ ID NO: Il-SEQ ID NO: 18 時，本發(fā)明的方法能夠很好地區(qū)分let-7家族miRNA中的單堿基錯配，具有良好的特異性。當(dāng)所述miRNA的序列選自SEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 22時，本發(fā)明的方法能夠特異性地識別成熟的miRNA，不受前體miRNA的干擾，具有良好的特異性。在所述步驟(4)中，所述的氧化還原酶為親和素修飾的辣根過氧化物酶或多聚的親和素修飾的辣根過氧化物酶。其中，與親和素修飾的辣根過氧化物酶(avidin-HRP)相比，本發(fā)明的方法中使用多聚的親和素修飾的辣根過氧化物酶(poly_HRP80)能夠大大提高檢測的靈敏度。在所述步驟(4)中，所述的底物是TMB和雙氧水。步驟簡單，檢測方法成本低廉。總之，本發(fā)明所提供的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法是一種高靈敏度的檢測miRNA的方法，可以檢測低至IOaM的miRNAs，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中需要大量的測試樣品(miRNA)的難點。另外，該檢測方法特異選擇性強，能夠很好區(qū)分同族的miRNAs的堿基錯配。與利用單鏈DNA探針相比，本發(fā)明的方法穩(wěn)定性更高。


圖I為本發(fā)明方法的技術(shù)原理圖。其中，I表不目標(biāo)miRNA, 2表不DNA信號探針,3表示親和素修飾的辣根過氧化物酶，4表示多聚的親和素修飾的辣根過氧化物酶，5表示四面體探針，6表示工作電極表面。 圖2為實施例I中目標(biāo)miRNA濃度與電流信號對應(yīng)關(guān)系圖。A圖為根據(jù)本發(fā)明的四面體探針檢測miR-21的結(jié)果，待測miR-21濃度依次分別為10fM、100fM、ΙρΜ、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、1ηΜ、10ηΜ。B圖為對照的單鏈DNA探針檢測miR-21的結(jié)果，待測miR-21濃度依次分別為IOOfM,ΙρΜ、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、InM。圖3為實施例2中miRNA濃度與電流信號對應(yīng)關(guān)系圖。待測miR-21濃度依次分別為 IOaM, IOOaM, IfM, IOfM, IOOfM, ΙρΜ、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、InM、IOnM0
其中aM:l(T18mole / L ；fM :l(T15mole / L ；pM:l(T12mole / L ；nM:lCT9mole / L。圖4為實施例3中電流信號與沒有識別序列的四面體探針調(diào)控組裝密度的關(guān)系圖，其中空白(blank)是指不含目標(biāo)miRNAs的電流信號。圖5為實施例4中的四面體探針檢測miRNAs的特異性圖。A圖是對let_7家族所 有miRNAs的區(qū)分圖，所有miRNAs濃度為ΙρΜ。B圖是對成熟的miR-31與前體miR-31的區(qū)分圖，濃度都為ΙΟρΜ。其中，*代表P〈0. 05，說明兩者之間有顯著性差異，可以區(qū)分目標(biāo)miRNA與非特異性 miRNA。
具體實施例方式下面用實施例進一步說明本發(fā)明的工作流程和功效，但本發(fā)明并不受其限制。實施例I試劑包括組裝形成具有DNA三維納米結(jié)構(gòu)的四面體探針的四條單鏈DNA，Tetra-A (75bp,分子量 23071. O, ssDNA)、Tetra-B (55bp,分子量 17018. 0，5’ 端修飾巰基 ssDNA)、Tetra-C (55bp,分子量 16898. O, 5’端修飾巰基 ssDNA)、Tetra-D (55bp,分子量 16877. O, 5，端修飾巰基ssDNA)，均購自大連Takara生物有限公司。該四條單鏈DNA含有三個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域分別和其它三條單鏈DNA的相對應(yīng)結(jié)構(gòu)域互補(17對堿基互補)，每條單鏈DNA分別圍繞四面體結(jié)構(gòu)的一個面一圈，在每個頂點處含有兩個堿基(非互補，柔性)起彎折作用，單鏈DNA 3’端和5’端匯聚在四面體的四個頂點，Tetra-A在5’末端延伸出一段DNA序列作為識別序列，Tetra-B/C / D分別在5’末端修飾巰基，分別在四面體的頂點上衍生出來。Tetra-A (SEQ ID NO: I):5， -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CACGAG AAG AGC CGC CATAGT A AAAAAAAAAA TCAACATCAG-3，Tetra-B (SEQ ID N0:2):5’ -HS-C6-TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGTMT AGA TGC GAG GGTCCA ATA C-3，Tetra-C (SEQ ID NO:3):5’ -HS-C6-TCA ACT GCC TGG TGA TAA MC GAC ACT ACG TGGGM TCT ACT ATG GCGGCT CTT C-3，Tetra-D (SEQ ID NO:4):5’-HS-C6-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGTCGT TTG TAT TGG ACCCTC GCA T-3，其中，Tetra-A 鏈上 IObp 的識別序列5’-TCAACATCAG-3’ 目標(biāo) miRNA:
hsa-miR-21 (SEQ ID NO:5) : 5，-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (ssRNA)DNA信號探針(SEQ ID NO:6):5’-TCTGATAAGCTA-Biotin_3’( 12bp，分子量4214. 4，3’端標(biāo)記生物素分子的ssDNA)作為對照的單鏈DNA 探針(SEQ ID NO: 7):5’-SH-C6-TAAATAAATATCAACATCAG_3’(20bp，分子量6298. O，5 ’端修飾巰基的ssDNA)，該單鏈DNA探針同樣具有識別序列5， -TCAACATCAG-3’目標(biāo)miRNA分別與四面體探針的識別序列及DNA信號探針互補，形成夾心結(jié)構(gòu)。親和素修飾的辣根過氧化物酶(avidin-HRP),購自Roche公司，參考產(chǎn)品說明書使用前用 IOOmM PBS 稀釋成 O. 5U / mL avidin-HRP。3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺水溶液(TMB)購于Neogen公司，K-blue低活性底物 (已配有雙氧水)。焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)購買于 Sigma 公司。巰基修飾的OEG (HS- (CH2) n-EG2-0H, 0EG)購于 Prochimia (Poland)。所有的化學(xué)試劑都是分析純沒有經(jīng)過進一步的純化直接使用。所有的溶液都用RNase-free 水配制。RNase-free 水用 O. 1%DEPC 處理 MilliQ 水(18M Ω .cm, Mi I Iipore)得到。本發(fā)明的檢測步驟如下I、具有DNA三維納米結(jié)構(gòu)的四面體探針的自組裝取等量的Tetra-A、B、C、D 四條單鏈 DNA，用 TM buffer (20mM Tris, 50mMMgCl2，pH8. O)稀釋，使其終濃度為luM，體積50yL。上述溶液95° C反應(yīng)IOmin后，立即降溫到4° C，持續(xù)IOmin以上。2、清洗打磨電極并組裝取直徑為2mm的金電極，先用O. 3 μ m和O. 05 μ m的氧化鋁粉依次打磨，然后用乙醇和超純水各超聲2min，在O. 5M硫酸中測定其循環(huán)伏安曲線，最后用超純水沖洗然后用氮氣吹干，備用。在電極上分別滴加3 μ L四面體探針組裝液，室溫下組裝過夜。另外，將一段巰基修飾的單鏈DNA探針用做對照實驗。該單鏈DNA探針的組裝溶液為20mM Tris, 50mM MgCl2, pH 8. O0取3 μ L O. 2 μ M的單鏈探針滴加到金電極表面室溫反應(yīng)3hr，然后用2mM的OEG封閉過夜，防止DNA倒伏在電極表面，使DNA分子單層有序的排列在電極表面。3、雜交反應(yīng)將不同濃度(10fM、IOOfM,lpM、10pM、100pM、InM、IOnMMA 目標(biāo)miRNA(has_miR-21)與生物素修飾的信號探針DNA (500nM)在含有IM NaCl和20mM MgCl2的IOmM PB緩沖溶液(pH 7. 4)中混合?；旌暇鶆蛑?0° C變性5分鐘，室溫冷卻20分鐘后，取100 μ L混合液加入2mL RNase-free的小管中(Axygen)。最后將修飾了四面體探針或單鏈DNA探針的電極浸入小管中與目標(biāo)miNRA和信號探針進行孵育雜交。經(jīng)過10° C雜交5hr后，取出電極用O. OlM PBS緩沖溶液沖洗電極并用N2吹干，再與3 μ L的avidin-HRP (O. 5U / mL)在4° C冰箱孵育15分鐘。制備好的電極最后用0. OlM PBS進行徹底沖洗用于電化學(xué)測試。4、電化學(xué)檢測
取ImL TMB底物到電解池中，將電極浸沒到TMB底物中。電化學(xué)檢測采用傳統(tǒng)的三電極體系，以Ag / AgCl (3M KCl)為參比電極，鉬絲電極為對電極，金電極為工作電極。使用CH Instruments公司的CHI630B型電化學(xué)工作站進行電化學(xué)檢測，采用循環(huán)伏安法(CV)和穩(wěn)態(tài)時間電流曲線法(amperometric i_t)進行電化學(xué)表征。循環(huán)伏安法起始電壓為0V,最高電壓為+0. 7V，最低電壓為0V，掃速為O. lV/s。時間電流曲線法測量的電位為100mV，檢測時間為100s，此時氧化還原反應(yīng)電流信號已經(jīng)趨于穩(wěn)定。電化學(xué)檢測使用辣根過氧化物酶(HRP)的催化底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺水溶液(Κ-Blue低活性底物TMB，已含有雙氧水)。結(jié)果如圖2A所示，電化學(xué)信號隨著目標(biāo)miRNA的濃度變化而發(fā)生變化。利用此曲線，我們可以實現(xiàn)對目標(biāo)miRNA的定量分析，可以檢測低至IOfM的miRNA。單鏈DNA探針作為對照，結(jié)果如圖2B所示，信號值偏差較大，并且當(dāng)濃度目標(biāo)miRNA的濃度低于IOpM時就 很難與背景電流區(qū)分開來。其具體機理如圖I所示，連接于工作電極表面6上的四面體探針5與目標(biāo)miNRAl和信號探針2進行雜交，在與親和素修飾的辣根過氧化物酶3或多聚的親和素修飾的辣根過氧化物酶4結(jié)合以后進行電化學(xué)檢測，所涉及的反應(yīng)方程式如下
權(quán)利要求
1.一種基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，包括(1)通過自組裝的方法合成DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針，所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針包括延伸出的一段識別序列；(2)將所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面；(3)將目標(biāo)miRNA與所述工作電極表面的所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針雜交；(4)加入氧化還原酶和相應(yīng)的底物，使用電化學(xué)裝置進行電化學(xué)檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，所述的DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針是由四條單鏈DNA自組裝形成的四面體探針，所述的四條單鏈DNA中的三條單鏈DNA的5’端修飾有巰基，另一條單鏈DNA在一端延伸出所述識別序列。
3.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，還包括將另一 DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到所述電化學(xué)裝置的工作電極表面，所述另一 DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針不具有所述識別序列。
4.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述的電化學(xué)裝置的工作電極是金電極，通過巰基和金之間的金硫鍵將所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面。
5.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，DNA信號探針、所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針與所述目標(biāo)miRNA形成夾心結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求5所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述DNA信號探針的序列和所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的所述識別序列彼此相鄰地與所述目標(biāo)miRNA的整個序列互補。
7.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述目標(biāo)miRNA的濃度為10aM-10nM。
8.如權(quán)利要求7所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述目標(biāo)miRNA的濃度為10fM-10nM。
9.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述目標(biāo)miRNA的序列選自SEQ ID NO: IU SEQ ID NO: 12, SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDN0:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID N0:21、SEQ ID N0:22。
10.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，所述的氧化還原酶為親和素修飾的辣根過氧化物酶或多聚的親和素修飾的辣根過氧化物酶。
11.如權(quán)利要求I所述的基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，所述的底物是TMB和雙氧水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)miRNA檢測方法，包括通過自組裝的方法合成DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針，DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針包括延伸出的一段識別序列；將DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面；將目標(biāo)miRNA與所述工作電極表面的所述DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針雜交；加入氧化還原酶和相應(yīng)的底物，使用電化學(xué)裝置進行電化學(xué)檢測。該方法可以檢測低至10aM的miRNA，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法需要大量的測試樣品的難點。另外，該檢測方法的特異選擇性強，能夠很好區(qū)分同族的miRNA的堿基錯配。而且與利用單鏈DNA探針相比，本發(fā)明的方法穩(wěn)定性更高。
文檔編號C12Q1/68GK102899418SQ201210445958
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者樊春海, 聞艷麗, 林美華 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所