專(zhuān)利名稱(chēng)：香蕉穿孔線蟲(chóng)lamp特異性檢測(cè)方法
香蕉穿孔線蟲(chóng)LAMP特異性檢測(cè)方法—.技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明適用于香蕉穿孔線蟲(chóng)檢測(cè)，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。二.背景技術(shù)
香蕉穿孔線蟲(chóng)(Radopholus similis)是國(guó)際公認(rèn)的對(duì)農(nóng)林業(yè)為害最重的十大植物寄生線蟲(chóng)之一。該線蟲(chóng)寄主范圍廣，多達(dá)250余種；為害重，對(duì)香蕉、柑橘及黑胡椒等造成毀滅性的危害；地理分布廣，在世界一百多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有分布。該線蟲(chóng)被包括中國(guó)在內(nèi)全世界三十多個(gè)國(guó)家及區(qū)域組織列為重要檢疫性有害生物。
近幾年，該線蟲(chóng)在我國(guó)局部地區(qū)的溫室和大棚的觀賞植物上被發(fā)現(xiàn)，可能是隨著觀賞植物的引進(jìn)傳入，盡管及時(shí)發(fā)現(xiàn)并得到有效控制，但該線蟲(chóng)嚴(yán)重威脅我國(guó)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)安全。因此，加強(qiáng)對(duì)該線蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)、檢疫防控，阻止其進(jìn)一步傳入，至關(guān)重要。
香蕉穿孔線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)、側(cè)尾腺綱(Secernentea)、墊刃目 (Tylenchida)、短體線蟲(chóng)科(Pratylenchidae)、穿孔線蟲(chóng)屬(Radopholus)。該線蟲(chóng)的傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征輔以測(cè)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。因此該線蟲(chóng)的準(zhǔn)確鑒定需要工作人員豐富的工作經(jīng)驗(yàn)，故難以滿足植物檢疫工作的實(shí)際需要。
隨著PCR等分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展及推廣，越來(lái)越多的分子檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用到植物有害生物檢測(cè)技術(shù)中，近年來(lái)香蕉穿孔線蟲(chóng)種特異性PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)，但是這些基于PCR的檢測(cè)技術(shù)都需要PCR儀等昂貴設(shè)備，難以用于現(xiàn)場(chǎng)檢疫，以及在一些基層監(jiān)測(cè)工作中應(yīng)用。三.發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種香蕉穿孔線蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification)快速檢測(cè)方法。運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的方法，能夠提高檢測(cè)效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度，本發(fā)明針對(duì)香蕉穿孔線蟲(chóng)核糖體DNA的ITS2 區(qū)8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)I組引物(含6條特異引物)，具有特異性高、快速等優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)時(shí)間只需 25-30分鐘。此外，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，不需復(fù)雜設(shè)備，因此還可用于室外監(jiān)測(cè)及一線口岸現(xiàn)場(chǎng)檢疫。
四.技術(shù)方案
(I)香蕉穿孔線蟲(chóng)DNA提取
取線蟲(chóng)，置于PCR管中，液氮放置2分鐘，加入1μ I蛋白酶K(lmg/ml)，65°C 15分鐘，95°C以上水處理10分鐘，所得即為線蟲(chóng)DNA提取液；
(2)香蕉穿孔線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)特異引物
Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'
Rs-3B3 5' -ACGCATTCATGTACGCAT-3'
Rs-3FIP 5' -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'
Rs-3BIP 5' -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3'
RS-3LF 5' -TACGAGCCGAGTGATCCA-3'Rs-3LB 5' -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'(3)香蕉穿孔線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng)體系PCR管中加入下列試劑，使總反應(yīng)體積為20 ill :
權(quán)利要求
1.一組香蕉穿孔線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)用特異引物，其核苷酸序列為Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'Rs-3B3 5/ -ACGCATTCATGTACGCAT-3'Rs-3FIP 5/ -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'Rs-3BIP 5/ -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3/Rs-3LF 5/ -TACGAGCCGAGTGATCCA-3' Rs-3LB 5/ -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'。
2.一種檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的濁度觀察檢測(cè)方法其以總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組合進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)25分鐘后觀察反應(yīng)液渾濁度變化。
3.—種檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的熒光觀察檢測(cè)方法其以總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組合進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)25分鐘后觀察反應(yīng)液顏色變化。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，香蕉穿孔線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)方法檢測(cè)25分鐘后，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)液為渾濁，而陰性結(jié)果為澄清。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，香蕉穿孔線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)方法檢測(cè)25分鐘后，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)液為綠色，而陰性結(jié)果為黃色。
6.一種試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及香蕉穿孔線蟲(chóng)(Radopholus similis)分子檢測(cè)，屬于植物檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明基于香蕉穿孔線蟲(chóng)與其相近種序列存在差異，通過(guò)比對(duì)香蕉穿孔線蟲(chóng)與其相近種線蟲(chóng)序列差異性，設(shè)計(jì)了1組特異引物(6條)。同時(shí)，本發(fā)明提供了一組檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的LAMP引物組序列，還進(jìn)一步提供了檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明的引物特異性好，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，為香蕉穿孔線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)及香蕉穿孔線蟲(chóng)病防控提供了有效的技術(shù)保障。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103031381SQ20121055000
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者熊玉芬, 葛建軍, 王旭 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院