專利名稱：一種柑橘果酒釀造酵母菌的篩選及柑橘果酒生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高品質(zhì)柑橘果酒釀造酵母菌的篩選及柑橘果酒生產(chǎn)方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上最大的水果生產(chǎn)國(guó)，而水果深加工業(yè)卻一直很薄弱。果酒是以水果為原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵而成的低度飲料酒，富含糖、有機(jī)酸、酯類及多種維生素，含有豐富的具有增強(qiáng)免疫功能的S0D。果汁中的主要成分是糖類，酵母菌則是以糖類物質(zhì)為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，生成酒精和一定量的香味物質(zhì)。所以酵母品種是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風(fēng)味，決定果酒品質(zhì)的優(yōu)劣。果酒有很多種，其中以葡萄釀造的葡萄酒規(guī)模最大，目前使用的果酒酵母多為葡萄酒釀造專用酵母。我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó)，具有豐富的資源，但高品質(zhì)柑橘酒釀造酵母很少。因此篩選出一種高品質(zhì)柑橘果酒釀造用酵母菌是柑橘果酒生產(chǎn)的關(guān)鍵課題。盡管果酒因其具有的營(yíng)養(yǎng)和保健作用而備受現(xiàn)代人喜愛(ài)，但果酒酵母菌在生產(chǎn)或者發(fā)酵品質(zhì)上仍然存在不少的問(wèn)題1、專用發(fā)酵菌種缺乏，目前果酒生產(chǎn)中所采用的酵母大多數(shù)為葡萄酒酵母，這種酵母是針對(duì)葡萄酒生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)開(kāi)發(fā)出來(lái)的，在其他果酒生產(chǎn)中效果并不好。市場(chǎng)上缺少高品質(zhì)的柑橘果酒釀造用的酵母菌。2、產(chǎn)品風(fēng)味不穩(wěn)定用篩選的純種釀酒酵母作為發(fā)酵菌種釀造的酒通常風(fēng)味過(guò)于平淡。因此，目前選育果酒酵母已不只局限于釀酒酵母cere而擴(kuò)展到水果中天然存在的一些產(chǎn)香酵母、產(chǎn)酯酵母,如孢漢遜酵母屬Hanseniaspora、克勒克酵母屬JHoecAera和畢赤酵母屬/7ZcAia等酵母的選育。這些酵母會(huì)對(duì)果酒的總體風(fēng)味產(chǎn)生積極的影響，能生成很多芳香物質(zhì)和特殊風(fēng)味成分，使酒的風(fēng)味特征明顯改善。

3、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定有的新果酒產(chǎn)品剛上市不久，就出現(xiàn)了質(zhì)量問(wèn)題，主要表現(xiàn)為顏色加重、氧化感增加、果香變淡，嚴(yán)重時(shí)有失光、沉淀現(xiàn)象。果酒的質(zhì)量不穩(wěn)定與酵母菌的質(zhì)量有關(guān)。本發(fā)明以野生柑橘-皺皮柑CYtrw1S verrucosa Hort.為原料，以發(fā)酵力和發(fā)酵原酒品質(zhì)作為指標(biāo)，篩選出了一株高品質(zhì)柑橘果酒發(fā)酵專用酵母菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從江漢平原廣泛分布的一種野生柑橘-皺皮柑的汁液中，采用微生物分離純化的方法，獲得了一種高品質(zhì)果酒釀造專用酵母菌。該酵母菌經(jīng)培養(yǎng)，用于柑橘果酒的釀造，酒質(zhì)穩(wěn)定、口感柔和。該酵母菌具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明高品質(zhì)果酒釀制用酵母菌的篩選純化及培養(yǎng)是這樣進(jìn)行的。具體步驟為1、將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中，在適宜溫度下，皺皮柑汁液可進(jìn)行自行發(fā)酵，酒體散發(fā)果香味，但品質(zhì)不穩(wěn)定，酒液呈淡淡酸味。證實(shí)野生皺皮柑中存在釀造果酒所用的酵母菌。2、收集自行發(fā)酵帶酒香的皺皮柑汁液，吸取0.2mL涂布均勻涂布于裝有已滅菌固體豆芽汁培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，28°C恒溫箱培養(yǎng)2d后進(jìn)行鏡檢。從中挑取生長(zhǎng)菌落良好，有明顯酵母菌菌落特征，呈酒香的菌體。在無(wú)菌操作臺(tái)上，挑取選定的酵母菌劃線接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d。除了酵母菌外還伴有少量霉菌，進(jìn)一步進(jìn)行純化，挑取形態(tài)特征突出的釀酒酵母菌分區(qū)劃線，重復(fù)以上步驟:T5次，直到分離出純單菌株。經(jīng)培養(yǎng)，單菌株在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，酵母菌長(zhǎng)勢(shì)良好，并伴有濃郁的酒香味。將該分離純化培養(yǎng)的柑橘果酒釀造專用酵母菌于2012年11月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No =2012472,名稱為釀酒酵母ZGJ-KfeccAart與fcmcerevisiae ZGJ-1 )。保藏地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。以下簡(jiǎn)稱ZGJ-1。ZGJ-1菌株的菌學(xué)特性
a、形態(tài)特征細(xì)胞個(gè)體呈球形或橢圓形，大小為5. 2MmX 12. 7Mm0單個(gè)或成雙，芽殖；培養(yǎng)物為奶油狀；菌落中間呈圓錐狀凸起、表面光滑、邊緣整齊；有濃郁的酒香味，在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度快。b、生理生化特征ZGJ-1與GenBank上其他酵母菌的18S rRNA和26S rRNA核苷酸序列的一致性分別為99%和97%,該菌株屬于釀酒酵母cerevisiae0在碳源的氧化測(cè)定中，當(dāng)以蔗糖、a -D-葡萄糖為唯一碳源時(shí)，GZJ-1具有強(qiáng)氧化能力，測(cè)定結(jié)果呈陽(yáng)性，菌株生長(zhǎng)能力好，代謝產(chǎn)物積累顯著；當(dāng)以D-棉子糖為唯一碳源時(shí)，GZJ-1氧化能力呈弱陽(yáng)性，菌株生長(zhǎng)能力較弱，代謝產(chǎn)物積累不顯著。在碳源利用上，ZGJ-1可以有效利用蔗糖和a -D-葡萄糖，其次利用D-棉子糖和水蘇糖，不能利用龍膽二糖、麥芽糖、D-半乳糖、核糖醇等。該菌株 最適生長(zhǎng)溫度范圍為26 28°C。本發(fā)明應(yīng)用釀酒酵母ZGJ-1 (CCTCC No :2012472)用于柑橘果酒釀造的生產(chǎn)方法，其步驟為
1、原料處理選用成熟度高、無(wú)腐爛的柑橘為原料，清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸3飛min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機(jī)打成漿一用滅菌的雙層紗布過(guò)濾于發(fā)酵瓶中一得到柑橘果漿，測(cè)出果漿的總糖度10%，并記錄結(jié)果；
2、果汁澄清(果膠酶處理):測(cè)定柑橘果漿的原始pH(pH=4. 5)，分裝在滅菌的發(fā)酵瓶中，加入0. 2%的果膠酶，50°C靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調(diào)整柑橘果漿糖度為20% (若沒(méi)有達(dá)到，則加白砂糖進(jìn)行微調(diào))。3、主發(fā)酵在含澄清已滅菌的果汁發(fā)酵瓶中，按照比例為5 10% (最佳7%)加入上述擴(kuò)培后的種子液，同時(shí)按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20±1°C條件中靜置發(fā)酵擴(kuò)12天，過(guò)濾即得柑橘果酒發(fā)酵原液；
4、果酒品質(zhì)的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果測(cè)定發(fā)酵原液的各項(xiàng)指標(biāo)，用pH酸度計(jì)測(cè)酸度、糖度計(jì)測(cè)糖度、用酒精計(jì)測(cè)乙醇含量。結(jié)果表明，用釀酒酵母ZGJ-1所釀造的果酒，其酸度(以檸檬酸計(jì)，mol/L)為0. 28、糖度(以葡萄糖計(jì)，g/L)為5. O、酒度(％vol)為12，三項(xiàng)指標(biāo)顯示該發(fā)酵液已達(dá)到果酒國(guó)標(biāo)要求。該果酒的品質(zhì)指標(biāo)明顯優(yōu)于皺皮柑自行發(fā)酵15d后的果酒品質(zhì)(酸度為0. 26、糖度為5. 0和酒度為4)。5、發(fā)酵原酒品質(zhì)(感官評(píng)定)發(fā)酵產(chǎn)出的酒液經(jīng)后酵2°C貯藏2個(gè)月即為成品柑橘果酒。外觀評(píng)價(jià)色澤和澄清度。用釀酒酵母ZGJ-1所釀造的果酒顏色為淡黃色，為柑橘果酒應(yīng)有之色澤，酒體澄清透明、有光澤；具有純正和諧的柑橘果香，口味清爽細(xì)膩，酒體豐滿，具有柑橘果酒的獨(dú)特性。高品質(zhì)果酒釀造酵母菌ZGJ-1的凝聚性及發(fā)酵力測(cè)定1、凝聚性試驗(yàn)將釀酒酵母ZGJ-1與法國(guó)原裝釀酒酵母K1、市售安琪酵母分別接種于豆芽汁液體培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)5d。取培養(yǎng)液以3500 r/min離心15min，收集酵母細(xì)胞，然后用無(wú)菌水洗滌2 3次。準(zhǔn)確稱取酵母泥l(xiāng)g，放入15mL的離心管中，然后加入IOmL醋酸緩沖溶液搖勻，使其成懸浮狀態(tài)，并在20°C水浴中靜置20min，再將此懸浮液連續(xù)搖動(dòng)5min，使酵母重新懸浮，再靜置，在20min內(nèi)每Imin記錄I次沉淀酵母的容積，根據(jù)懸浮液靜置IOmin的沉淀容積確定凝聚性的強(qiáng)弱。本發(fā)明酵母菌的本斯值為2. 3mL，凝聚性為較強(qiáng)-適中，比法國(guó)釀酒酵母Kl和市售安琪酵母的凝聚性好，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)酵母的標(biāo)準(zhǔn)。2、發(fā)酵力的測(cè)定采用失重法測(cè)定發(fā)酵力。將活化好的釀酒酵母ZGJ-1接入已滅菌的豆芽汁液體培養(yǎng)基，25°C發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)每24h測(cè)I次重量,培養(yǎng)12d，以不接菌種的豆芽汁培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。培養(yǎng)12d后，ZGJ-1的總發(fā)酵力達(dá)到了 12. 79g/50mL。在發(fā)酵過(guò)程中失重高峰在前5d，說(shuō)明該酵母菌發(fā)酵旺盛期是前5d，發(fā)酵力為7. 36g/50mL。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用前景
本發(fā)明從江漢平原廣泛分布的一種野生柑橘-皺皮柑的汁液中分離得到了一株適應(yīng)柑橘發(fā)酵的優(yōu)良菌株。由于該菌株是從皺皮柑汁液中分離出來(lái)的，皺皮柑偏酸(PH=4. 5)、偏苦，所以該酵母菌株能夠用于生產(chǎn)耐受果汁酸度的果酒。通過(guò)鑒定該菌株為釀酒(高產(chǎn)酒)酵母菌類型。將本發(fā)明酵母菌ZGJ-1與法國(guó)釀酒酵母Kl及市售安琪酵母三種菌株產(chǎn)氣性能、產(chǎn)酒精能力、凝聚性、產(chǎn)香能力及感官評(píng)定進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明酵母菌的發(fā)酵能力強(qiáng)、發(fā)酵特性好、發(fā)酵所得柑橘果酒品質(zhì)優(yōu)，且酒體澄清透明、色澤淡黃，具有果酒的典型風(fēng)味。利用釀酒酵母ZGJ-1釀造的營(yíng)養(yǎng)型 柑橘果酒，品質(zhì)良好，已展現(xiàn)出良好的利用潛力。


圖1本發(fā)明酵母菌株ZGJ-1的菌落形態(tài)，
圖2本發(fā)明酵母菌株ZGJ-1的細(xì)胞形態(tài)(400X )。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 :高品質(zhì)果酒釀制用酵母菌ZGJ-1的分離、純化及培養(yǎng)1、將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中，在適宜溫度下，皺皮柑汁液可進(jìn)行自行發(fā)酵，酒體散發(fā)果香味，但品質(zhì)不穩(wěn)定，酒液呈淡淡酸味。初步判定野生皺皮柑中存在有釀酒用酵母菌。2、在無(wú)菌操作臺(tái)上，將此酵母菌涂布于含有滅菌豆芽汁固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，放入28°C恒溫箱中培養(yǎng)。3d后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中除了酵母菌外還伴有少量霉菌。挑取酵母菌接種在重新配制的新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d后，重復(fù)以上步驟，直到分離出酵母菌純單菌株。在培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，酵母菌長(zhǎng)勢(shì)良好，較濕潤(rùn)、透明，并伴有酒香味(見(jiàn)圖1)。根據(jù)菌落特征，確定為釀酒酵母cerevisiae系列。挑取酵母菌單菌體做裝片,在顯微鏡下可以觀察到酵母菌的形態(tài)(見(jiàn)圖2)。細(xì)胞為圓形或橢圓形，大小為5. 2MfflX 12. 7Mm。將該菌株進(jìn)一步劃線培養(yǎng)后送鑒定，命名為酵母菌ZGJ-1，保藏號(hào)為CCTCC No :2012472。實(shí)施例2 :將酵母菌ZGJ-1 (CCTCC No =2012472)用于釀造柑橘果酒1、原料處理選用成熟度高、無(wú)腐爛的新鮮柑橘IOkg為原料。清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸:T5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機(jī)打成漿一用滅菌的雙層紗布過(guò)濾于滅菌后發(fā)酵罐中—得到柑橘果漿。測(cè)出果汁的總糖度，并記錄結(jié)果。2、果膠酶處理測(cè)定柑橘果漿的原始pH，加入0. 2%的果膠酶，50°C下靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調(diào)整柑橘果漿糖度為20%，若沒(méi)有達(dá)到，則加白砂糖進(jìn)行調(diào)節(jié)。3、主發(fā)酵在滅菌的發(fā)酵瓶中，加入5^10% (最佳7%)的本發(fā)明酵母菌ZGJ-1，按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20土1°C條件中靜置發(fā)酵9_12d，即得柑橘果酒發(fā)酵液。4、果酒品質(zhì)的測(cè)定結(jié)果用本酵母菌所釀造的果酒，其酸度(以檸檬酸計(jì)，mol/L)為0. 28、糖度(以葡萄糖計(jì)，g/L)為5. O、酒度(％vol)為12 (若發(fā)酵液繼續(xù)保溫發(fā)酵3d，酒度可達(dá)到18)，符合果酒國(guó)標(biāo)要求。該釀造果酒的品質(zhì)指標(biāo)也明顯優(yōu)于皺皮柑自行發(fā)酵15d后的果酒品質(zhì)(酸度為0. 26、糖度為5. 0和酒度為4)。實(shí)施例3 :柑橘果酒釀造時(shí)果膠酶添加量的確定1、選用成熟度高、無(wú)腐爛的新鮮柑橘為原料；清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸T5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機(jī)打成漿一用滅過(guò)菌的雙層紗布過(guò)濾于發(fā)酵瓶中一得到柑橘果漿。測(cè)出果汁的總糖度，并記錄結(jié)果。2、果膠酶處理測(cè)定柑橘果漿的原始pH，分裝在滅菌的發(fā)酵瓶中并編號(hào)，分別加入含量為0. 1%、0. 2%、0. 3%和0. 4%的果膠酶。將發(fā)酵瓶放在50°C恒溫箱內(nèi)靜置澄清4h，然后分別取上清液在波長(zhǎng)610nm處測(cè)定透光率，并記錄結(jié)果。若透光率越大，則表明過(guò)果汁的澄清度越高。由表I知添加0.2%的果膠酶，透光率可達(dá)到95%，果汁清澈。故本發(fā)明所采用果膠酶添加量為0. 2%。表I不同果膠酶用量下發(fā)酵液的粘度
權(quán)利要求
1.一種柑橘果酒釀造酵母菌，保藏號(hào)為CCTCC NO: 2012472;具備發(fā)酵能力強(qiáng)、產(chǎn)酒高、產(chǎn)香好的特點(diǎn)。
2.一種柑橘果酒生產(chǎn)方法，其步驟為 ⑴原料處理選用成熟度高、無(wú)腐爛的柑橘為原料，清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸3-5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機(jī)打成漿一用滅菌的雙層紗布過(guò)濾于發(fā)酵瓶中一得到柑橘果漿，測(cè)出果漿的總糖度，并記錄結(jié)果； ⑵果汁澄清及果膠酶處理測(cè)定柑橘果漿的原始PH，分裝在已滅菌的發(fā)酵瓶中，加入0.2%的果膠酶，50°C靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調(diào)整柑橘果漿糖度為20%，若沒(méi)有達(dá)到，則添加白砂糖進(jìn)行微調(diào)； ⑶將保藏號(hào)為CCTCC NO: 2012472的釀酒酵母ZGJ-1用豆芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，然后進(jìn)一步在250mL滅菌的三角瓶?jī)?nèi)進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)培，最終制備種子液； ⑷主發(fā)酵在含澄清已滅菌的果汁發(fā)酵瓶中，按照比例為5 10%加入上述擴(kuò)培后的種子液，同時(shí)按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20± 1°C條件中靜置發(fā)酵9-12d，過(guò)濾即得柑橘果酒發(fā)酵原液； (5)果酒品質(zhì)的指標(biāo)測(cè)定發(fā)酵完后，用pH酸度計(jì)測(cè)酸度、糖度計(jì)測(cè)糖度、用酒精計(jì)測(cè)乙醇含量； (6)發(fā)酵產(chǎn)出的原酒液經(jīng)后酵2°C貯藏2個(gè)月即得成品柑橘果酒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種柑橘果酒生產(chǎn)方法，其特征在于步驟中，上述果膠酶最佳加入量為0. 2% ;上述種子制備液最佳加入量為7%。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種柑橘果酒釀造酵母菌，保藏號(hào)為CCTCC NO2012472，及其用它釀造高品質(zhì)柑橘果酒的生產(chǎn)方法。其步驟為原料處理、果汁澄清(果膠酶處理)、發(fā)酵種子制備、主發(fā)酵、過(guò)濾除渣得原酒液，再經(jīng)后酵2℃貯藏2個(gè)月即為成品柑橘果酒。利用本發(fā)明釀造的柑橘果酒顏色為淡黃色，酒體澄清透明、有光澤；具有純正獨(dú)特的柑橘果香，口味清爽細(xì)膩，酒體和諧豐滿，余味悠長(zhǎng)，具備柑橘果酒的典型特征。此發(fā)明將為果農(nóng)在柑橘深加工方面打開(kāi)一條致富之路。
文檔編號(hào)C12N1/18GK103045495SQ20121056188
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者彭宇, 孫美玲, 楊艷燕, 楊登想, 楊燁, 劉芳, 柴靜 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)