可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞的基于病毒的載體組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供高滴度和純度的病毒載體組合物，以及用于生產(chǎn)所述組合物的方法。本發(fā)明的方法包括多種特征，例如在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)病毒載體顆粒，和在轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)細胞后的多個收獲步驟，其提供了增強的所述病毒載體的生產(chǎn)。本發(fā)明的病毒載體組合物，由于它們的高滴度和純度，使在靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后通常發(fā)生的有害的表型變化如轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的亞群的損失，和對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的增殖、分化、重編程或功能性的影響減到最少。
【專利說明】可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞的基于病毒的載體組合物
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2011年7月27日提交的美國臨時專利申請序號61/512，289的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。
[0002]前言
本發(fā)明提供了高滴度和純度的病毒載體組合物，以及用于生產(chǎn)所述組合物的方法，和所述病毒載體組合物用于真核細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的用途。本發(fā)明的方法包括多種特征，例如在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)病毒載體顆粒，其提供了增強的所述病毒載體的生產(chǎn)。本發(fā)明的病毒載體組合物，由于它們的高滴度和純度，使在靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通常后發(fā)生有害的表型變化，如轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的亞群的損失，和對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的增殖、生存力和分化的影響減到最少。[0003]發(fā)明背景
對于藥物發(fā)現(xiàn)中的體外應(yīng)用，在體內(nèi)和離體的臨床測定法以及對于基因治療，基于病毒的載體的使用已經(jīng)成為至關(guān)重要的遞送方法。病毒載體可以分為兩個主要類別:將其本身插入受體基因組中的整合載體，以及通常形成染色體外的遺傳元件的非整合型載體。整合載體如Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)和慢病毒載體(LV)是穩(wěn)定遺傳的。非整合載體，例如腺病毒載體(ADV)和腺相關(guān)病毒(AAV)載體很快地從快速分裂的細胞丟失。影響具體載體選擇的一些因素，包括其包裝容量、其宿主范圍、其基因表達模式、其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，和其引發(fā)免疫反應(yīng)的能力(如果需要重復(fù)施用或轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是特別成問題的)。這些參數(shù)的一些可以調(diào)整或控制。一個參數(shù)是使用高度濃縮而且還高度純化的載體，以允許有效的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，并避免由于載體本身之外的內(nèi)容物而導(dǎo)致的特異性細胞應(yīng)答。
[0004]目前用于生產(chǎn)和濃縮基于病毒的載體的方法對于保存載體完整性和批次質(zhì)量不是最佳的。事實上，小規(guī)模的實驗批次通常通過基于超速離心或在即用型中心單元(central units)上離心的簡單方法進行濃縮。本文提及的這些批次，如批次A-血清(A-S)和B-血清(B-S)，和用于生產(chǎn)這些批次的方法，描述于圖4A。那些方法也濃縮細胞碎片、膜片段和由生產(chǎn)細胞分泌的和來自包含血清的培養(yǎng)基的蛋白，并且不適于在良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)下生產(chǎn)載體批次。這些批次中的一個主要缺點是:當(dāng)使用低或中等的感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)時，它們不能允許一些非增殖細胞(如神經(jīng)細胞、巨噬細胞或造血干細胞)的可重復(fù)的方式的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。雖然采用更高的M.0.1.是達到高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的線索，但是通?？茖W(xué)家們專注于載體假型(pseudotyping)或轉(zhuǎn)導(dǎo)方案優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(Janssens等，2003)。然而，由于這樣的批次B-S誘導(dǎo)細胞毒性(Selvaggi等，1997 ;Reiser，2000 ;Baekelandt等，2003)，使用這種類型的產(chǎn)品B-S的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的結(jié)果總是在轉(zhuǎn)導(dǎo)水平和對靶細胞的毒性之間的平衡。此外，通過經(jīng)典技術(shù)濃縮的發(fā)表的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的另一個缺點是所轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞，尤其是對造血干細胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后不能在分化途徑向下進展。
[0005]Merten等(2010)使用基于多個基于膜和層析步驟的下游方法，但具有使用含10%血清的培養(yǎng)基的生產(chǎn)方法，這是Merten等的方法和根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的方法之間的重要區(qū)另O。本發(fā)明提供使用表現(xiàn)出高純度水平的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的用于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的組合物和方法。這樣的組合物和方法對干細胞分化成特化細胞沒有不利影響。[0006]生產(chǎn)步驟對最終濃縮產(chǎn)品有很大的影響，因為它提供了隨后進行濃縮和純化步驟的起始材料。例如，可在具有或沒有血清，有或沒有丁酸鈉誘導(dǎo)的情況下進行生產(chǎn)，并且上清液可以在轉(zhuǎn)染48h后收獲一次或在轉(zhuǎn)染64h和88h后收獲兩次(Cooper等，2011)。這樣的收獲時間的主要缺點是沒有考慮到載體顆粒半衰期。這些條件對初始污染物(DNA和/或蛋白污染物)的含量和粗上清液的毒性含量水平有很大的影響。必須測量這些成分以表征對應(yīng)生產(chǎn)、純化和濃縮的每個批次，即本發(fā)明的批次A、B、C和D。與本發(fā)明相反，Cooper等沒有通過測量初始污染物及其在濃縮和/純化加工后的去除來表征初始產(chǎn)品和純化的最終產(chǎn)物(參見表1)。
[0007]本發(fā)明提供了最終純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比于存在于無血清細胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2%的初始蛋白污染物和小于70至90%之間的初始的DNA污染物，所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞而不顯著影響細胞生存力。
[0008]本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比于存在于無血清細胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2%的初始蛋白污染物和小于30 %的初始的DNA污染物，所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞而不影響細胞生存力。
[0009]本 申請人:在本文中證明，這些參數(shù)的每一個(血清、丁酸鈉誘導(dǎo)和載體收獲時間)修飾對靶細胞誘導(dǎo)差異的毒性水平的初始粗載體上清液組合物。
[0010]發(fā)明概述
本發(fā)明提供高滴度和純度的病毒載體組合物(也稱為病毒載體顆粒)，以及用于生產(chǎn)所述組合物的方法。本發(fā)明的病毒載體組合物，由于它們的高滴度和純度，使在靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后通常發(fā)生的有害的表型變化減到最少。
[0011]本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比于存在于無血清細胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物(粗批次A)，其包含小于2%的初始蛋白污染物和小于70%至多達98.8%的DNA污染 物。所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞而不影響細胞生存力，或所述組合物轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞而不影響細胞生存力。
[0012]在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占60-99%之間，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占55-100%之間。因此，本發(fā)明提供純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括少于40%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括少于45%的蛋白污染物。
[0013]在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占60-75%之間，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占55-65%之間(批次B)。因此，本發(fā)明提供純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括25%-40%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括35%-45%的蛋白污染物。這種純化的基于RNA的病毒載體組合物還可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化的細胞系而不影響它們的生存力。[0014]在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占70-90%之間，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占多達98% (批次C)。因此，本發(fā)明提供純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括10%-30%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括少于2%的蛋白污染物。這種純化的基于RNA的病毒載體組合物可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞、原代和干細胞而不影響它們的生存力。
[0015]在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占多達98.8%，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占多達99.9% (批次D)。因此，本發(fā)明提供純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括少于2%，優(yōu)選1.2%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒載體組合物中的初始污染物，其包括少于1%，優(yōu)選0.1%的蛋白污染物。這種純化的基于RNA的病毒載體組合物也可以用于體內(nèi)注射。
[0016]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述基于粗RNA的病毒載體是其中物理顆粒/轉(zhuǎn)導(dǎo)單元(PP/TU)包含在100:1至多達900:1之間，優(yōu)選200:1至多達900:1之間的病毒載體。在本發(fā)明的又另一個實施方案中，通過基于超離心或在即用型中心單元上的離心的簡單方法濃縮的，所述基于濃縮RNA的病毒載體是其中物理顆粒/轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(PP/TU)包含在100:1至多達600:1之間，優(yōu)選200:1至多達600:1之間的病毒載體。更進一步，所述基于RNA的載體是基于濃縮且純化的RNA的載體，其中所述物理顆粒/轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(PP/TU)包含在100:1至多達400:1之間。所述基于RNA的載體，因為它們的高滴度和純度，對細胞增殖、生存力和/或細胞(例如干細胞)的分化能力幾乎沒有或沒有影響。本文所述的方法提供用于跟蹤PP/TU比例從粗批次A到批次C和D的發(fā)展并且保證其降低或保持穩(wěn)定的方式。所述比例升高可以證明濃縮方法損害載體顆粒。
[0017]本發(fā)明進一步提供，但不限于，包含在保藏的細菌宿主中的病毒DNA構(gòu)建體，且所述細菌宿主以保藏號 CNCM 1-4487 (pEnv)、CNCM 1-4488 (pHIV-Gag/Pol)或 CNCM 1-4489(pLV.EFl.GFP)保藏在CNCM保藏中心。本發(fā)明還提供了插入在載體中的病毒來源的純化的核苷酸序列，其用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的基于RNA的載體，所述核苷酸序列是包含在以保藏號CNCM 1-448,CNCM 1-4488或CNCM 1-4489保藏在CNCM保藏中心的三個重組宿主的任一中的插入物。
[0018]根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的這種基于RNA的病毒載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核靶細胞，用于將目的核酸(轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)移到所述細胞中。本發(fā)明還提供了用于制備修飾的真核細胞的方法，其中通過根據(jù)本發(fā)明的純化的基于RNA的病毒載體組合物轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細胞而不影響它們的生存力。該轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可以用于例如用于藥物發(fā)現(xiàn)的體外應(yīng)用，在體內(nèi)和離體的臨床測定法和用于基因治療。本發(fā)明的組合物尤其良好地適用于轉(zhuǎn)導(dǎo)需要高M.0.1.(感染復(fù)數(shù))的細胞。
[0019]本發(fā)明的方法包括多種特征，例如在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)基于RNA的病毒載體顆粒，其提供了增強的所述病毒載體的生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括:(i)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞，所述細胞經(jīng)過修飾以補充在病毒載體所基于的RNA病毒基因組中的缺失，并且在合適的條件下所述培養(yǎng)生產(chǎn)細胞，以允許基于RNA的病毒載體顆粒的生產(chǎn)，其中所述轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中進行；和
(?)收集包含所述基于RNA的病毒載體顆粒的上清液。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法不包括丁酸鈉誘導(dǎo)步驟。
[0020]在本發(fā)明的實施方案中，包含基于RNA的病毒載體顆粒的上清液可以在轉(zhuǎn)染后的特定時間間隔收集，所述特定時間間隔取決于所述載體顆粒在37°C的半衰期，其通常是約8-10個小時，取決于所用的生產(chǎn)細胞類型和培養(yǎng)基(Le Doux等，1999)。優(yōu)選地，所述上清液收集通過以特定時間間隔的的多個步驟(包含在3-6個之間，例如4個步驟)進行。所述時間間隔有利地等于所述載體顆粒在37°C的半衰期的約兩倍。此步驟保護載體顆粒免于在生產(chǎn)步驟期間在細胞培養(yǎng)基中降解，和免于導(dǎo)致載體顆粒廢物釋放在上清液中。
[0021]本發(fā)明的方法可以進一步任選地包括切向超濾的步驟，其包含上清液的滲濾步驟。在本發(fā)明的又另一個實施方案中，在切向超濾滲濾步驟后，本發(fā)明的方法可以進一步包括離子交換層析步驟，進行該步驟以進一步濃縮和純化病毒載體顆粒。
[0022]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述超濾在聚砜中空纖維濾芯(cartridges)上操作?？梢栽谑占锨逡汉蠛驮诔瑸V步驟之前(如果有的話)進行通過離心的澄清。該離心后獲得的截留液可以進一步用能夠降解污染性核酸的酶，如核酸酶處理。這些酶包括但不限于Benzonase (核酸酶)或DNA酶。產(chǎn)品回收后，可以通過添加例如DMEM和通過形成鹽梯度的分離，在離子交換柱上進一步純化所述病毒載體顆粒。
[0023]本發(fā)明的方法提供了純化的基于RNA的病毒載體顆粒的制品，其中所述去除的DNA污染物占存在于初始的無血清培養(yǎng)基的該污染物的70-99%之間，并且去除的細胞蛋白污染物占包含在初始的無血清培養(yǎng)基中的細胞蛋白的50-99.9%之間，并且其中PP/TU比例包含在100至900之間。批次的質(zhì)量隨著比例PP/TU降低而增加。這意味著對于有效顆粒過量的物理顆粒，對轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的表型具有負(fù)面影響。如使用本文在材料和方法中所述方法所計算，高于1000的PP/TU比例，被認(rèn)為是可接受的上限。
[0024]本發(fā)明的方法進一步提供了純化的基于RNA的病毒載體顆粒的制品，其中所述去除的DNA污染物占存在于初始的無血清培養(yǎng)基中的該污染物含量的多達71%，并且去除的細胞蛋白污染物占存在于初始的無血清培養(yǎng)基中的該污染物含量的多達56%，并且其中所述PP/TU比例包含在100和600之間。
[0025]本發(fā)明的方法導(dǎo)致生產(chǎn)出純化的基于RNA的病毒載體顆粒，所述載體顆粒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核靶細胞，而不影響所述細胞的生存力，其在體外增殖的能力，或其在分化途徑向下發(fā)展的能力(例如，當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)干細胞時)。這樣的純化的基于RNA的病毒載體顆粒在細胞的無血清系統(tǒng)中生產(chǎn)，并且它們可用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核靶細胞，所述細胞適于注射到宿主體內(nèi)。這樣的真核細胞包括，例如永生化的細胞、原代細胞、干細胞或誘導(dǎo)的多能干細胞。
[0026]因此，本發(fā)明提 供了制備遺傳修飾的真核細胞的方法，其特征在于使真核細胞與根據(jù)本發(fā)明的基于RNA的病毒載體組合物接觸的步驟。該方法可以進一步包括從無血清細胞培養(yǎng)基上清液中分離遺傳修飾的真核細胞。當(dāng)生產(chǎn)病毒載體顆粒時以及當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞例如干細胞或原代細胞(其可以需要特定的培養(yǎng)基和/或血清)時，無血清培養(yǎng)基是重要的。實際上，存在/缺少血清、丁酸鈉誘導(dǎo)或載體收獲時間中的每個參數(shù)，都可以影響初始粗載體上清液組合物，并且從而導(dǎo)致對轉(zhuǎn)染細胞的差異的毒性水平。本發(fā)明進一步提供修飾的真核細胞，其中所述細胞通過根據(jù)本發(fā)明的純化的基于RNA的病毒載體組合物轉(zhuǎn)導(dǎo)而不影響其生存力。
[0027]附圖簡述
圖1:載體生產(chǎn)圖解。使用包裝和表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞以在細胞上清液中生產(chǎn)非復(fù)制性慢病毒載體。
[0028]圖2:包含在細菌宿主中的病毒DNA構(gòu)建體，所述細菌宿主以保藏號CNCM 1-4487、CNCM 1-4488或CNCM 1-4489保藏在CNCM。圖2A:帶有g(shù)ag和pol基因的質(zhì)粒。圖2B:表達包膜的輔助質(zhì)粒。圖2C:轉(zhuǎn)基因表達質(zhì)粒。
[0029]圖3A:永生化細胞系的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定。將每孔50，000個細胞接種于24孔微孔板(Corning CellBind 24孔微孔板)并與表達GFP的慢病毒載體混合。使用從10至100的M.0.1.范圍，在4Pg/mL polybren的存在下,在ImL的總體積中，在37°C/5% CO2下過夜，以確定最佳的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件。在過夜孵育后，將上清液替換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞通過流式細胞術(shù)分析。圖3B:原代細胞的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定。將每孔50，000個細胞接種于24孔微孔板(Corning CellBind 24孔微孔板)并與表達GFP的慢病毒載體混合。使用從10至100的M.0.1.范圍，在4Pg/mL polybren的存在下，在以ImL的總體積中，在37°C /5%CO2下過夜，以確定最佳的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件。在過夜孵育后，將上清液替換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞通過流式細胞術(shù)分析。
[0030]圖4A:根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法，使用血清的常規(guī)載體生產(chǎn)方法。圖4B:根據(jù)通過SDS-PAGE凝膠分析的FCS比例的蛋白概況的評價。將15Pg的病毒上清液的總蛋白加載到SDS-PAGE凝膠上。總蛋白通過在280nm的分光光度法定量。圖4C:用于評價蛋白概況的批次滴度的總結(jié)。(I)通過流式細胞術(shù)確定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。(2)通過HIV-p24 ELISA定量物理顆粒(PP)以確定PP/TU比例。(3)通過在280nm的分光光度法定量總蛋白。
[0031]圖5A:本發(fā)明的病毒載體濃縮和純化方法。不同方法按順序(從A至D對應(yīng)批次A至D的獲得)以符合靶細胞的濃縮和純化的要求:永生化的細胞(A)、原代和干細胞(C)和體內(nèi)注射(D)。圖5B:經(jīng)過超離心和在中心單元上的離心的無血清生產(chǎn)的載體的SDS-PAGE凝膠⑶。泳道1:3xl05 TU的超離心的批次。泳道2&3:分別為3xl05 TU & 3xl06 TU的在中心單元上離心的批次。圖5C:通過SDS-PAGE凝膠分析的純化方法的表現(xiàn)。泳道1:3xl05TU的使用即用型離心單元的超濾批次(策略B)。泳道2:3xl06 TU的使用即用型離心單元的超濾批次(策略B)。泳道3:3xl05 TU的使用中空纖維的超濾批次(策略C)。泳道4:3xl05 TU的使用中空纖維隨后是使用即用型離心單元的另外的濃縮步驟的超濾批次。泳道5:3xl06 TU的使用中空纖維隨后是使用即用型離心單元的另外的濃縮步驟的超濾批次。泳道6:3x10s TU的層析批次(策略D)。泳道7:3xl06 TU的隨后使用即用型離心單元的另外的濃縮步驟的層析批次。泳道8:15xl06 TU的隨后使用即用型離心單元的另外的濃縮步驟的層析批次。
[0032]圖6:取決于本發(fā)明的純化策略的剩余雜質(zhì)。取決于所使用的濃縮和純化技術(shù)，濃縮和純化策略顯示不同的雜質(zhì)去除概況。從A至D，剩余雜質(zhì)(蛋白、DNA和非生物性病毒載體(PP))降低以達到FDA對于體內(nèi)注射的純化要求(D)。
[0033]圖7:取決于純化策略，純化的生物活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比雜質(zhì)的比活性。病毒顆粒及其污染物環(huán)境通過比活性表示。比活性是每毫克總蛋白(以TU/mg表示)，或每微克殘留DNA (以TU/^g表示)的載體的生物活性，從而給出了病毒載體在其環(huán)境中的活性的量度。隨著載體的環(huán)境中污染物減少，比活性增加。
[0034]圖8:取決于本發(fā)明的純化策略的物理顆粒/轉(zhuǎn)導(dǎo)單位比例(PP/TU)。在后期載體生產(chǎn)階段可以出現(xiàn)的一些缺陷，導(dǎo)致非感染性病毒載體的產(chǎn)生。缺乏任何生物活性的那些物理顆粒具有與生物活性顆粒的幾乎相同的物理-化學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致難以在濃縮-純化方法過程中將其消除。
[0035]圖9:取決于本發(fā)明的純化策略，純化的生物活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比雜質(zhì)的純化水平。所述純化水平表示存在于病毒載體環(huán)境中的病毒載體和雜質(zhì)(例如蛋白或DNA)之間的純化比例。隨著進入最終回收產(chǎn)品的剩余雜質(zhì)的減少，從批次A至批次D的四個批次的純化水平增加。
[0036]圖10:使用非整合型慢病毒載體(NILV)和整合型慢病毒載體(ILV)的IMR90細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。將每孔50，000個細胞接種到24孔微孔板并與5至200的M.0.1.的慢病毒載體混合，在4Pg/mL polybren的存在下,在ImL的總體積中，在37°C /5% CO2中過夜。在過夜孵育后，將上清液替換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天，通過FACS分析確定GFP表達。圖1OA:以提高的M.0.1.使用表達GFP的ILV和NILV轉(zhuǎn)導(dǎo)的MR90細胞的百分比。圖1OB:以提高的M.0.1.使用表達GFP的ILV和NILV轉(zhuǎn)導(dǎo)的IMR90細胞中的熒光強度。
[0037]圖11:在293T細胞和使用三種用于慢病毒生產(chǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞中的LDH測定。
[0038]圖12A:用表達GFP的慢病毒載體(ILV)轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天的包皮細胞中的GFP表達。批次以A、B、C和D字母表示。將每孔50，000個細胞接種到24孔微孔板并與40和150的M.0.1.的慢病毒載體混合,在4Pg/mL polybren的存在下,在ImL的總體積中，在37°C /5%CO2下過夜。在過夜孵育后，將上清液替換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，固定細胞。圖12B:用表達GFP的慢病毒載體(ILV)轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天的包皮細胞中的GFP表達。批次以A、B、C和D字母表示。將每孔50，000個細胞接種到24孔微孔板并與40和150的M.0.1.的慢病毒載體混合，在4Pg/mL polybren的存在下,在ImL的總體積中，在37°C /5% CO2下過夜。在過夜孵育后，將上清液替換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天，固定細胞。圖12C:用表達GFP的慢病毒載體(ILV)轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天通過FACS測量的包皮細胞中的GFP表達。批次以A、B、C和D字母表示。包皮細胞在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)并在一天后轉(zhuǎn)導(dǎo)。11天后，通過FACS測量所有靶細胞中的GFP強度。
[0039]圖13:轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天的細胞生存力。包皮細胞在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)并在一天后轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0040]圖14A:在用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天，通過MTT測定測量的細胞增殖。包皮細胞在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)并在一天后用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)。5天后在所有孔中細胞傳代至第三代，并且在11天后進行MTT測定。圖14B:在用批次A、B、C和D轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天，通過MTT測定測量的細胞增殖。包皮細胞在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)并在一天后用B批次轉(zhuǎn)導(dǎo)。11天后，進行MTT測定。圖14C:相比批次B，在用其它批次轉(zhuǎn)導(dǎo)后11天，通過MTT測定測量的細胞增殖。包皮細胞在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)并在一天后用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)。11天后，進行MTT測定。
[0041]圖15A:在用攜帶空盒而不含cDNA的慢病毒載體(rLV-EFl)以M.0.1.40或M.0.1.150轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時的包皮細胞生長。批次B和C的rLV-EFl來源于相同的粗收獲物。圖15B:用于轉(zhuǎn)錄組分析的rLV-EFl批次B和C的表征。(I)通過qPCR確定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。(2)使用 Quant-1T 試劑盒 PicoGreen dsDNA 試劑盒(Life Technologies)定量殘留DM0 (3)通過在280 nm的分光光度法定量總蛋白。(4)通過HIV_p24 ELISA定量物理顆粒(PP)以確定PP/TU比例。
[0042]圖16A:散點圖，表示相比于未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，在以M.0.1.150的rLV-EFl批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中差異表達，并且相比于未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，在以M.0.1.150的rLV-EFl批次C轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中未受影響的一組探針。X軸表不對于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(NT)細胞的標(biāo)準(zhǔn)化強度,并且Y軸表不對于轉(zhuǎn)導(dǎo)的(T)細胞的標(biāo)準(zhǔn)化強度。很輕的灰色調(diào)線是表示-1.5、1和1.5倍變化值的倍數(shù)變化線。圖16B:測線圖，表示在強度值的基線轉(zhuǎn)化后，如圖16A中所示的同一組探針。圖16C:散點圖，表示相比于未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，在以M.0.1.40的rLV-EFl批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中差異表達，并且相比于未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，在以M.0.1.40的rLV-EFl批次C轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中未受影響的一組探針。X軸表示對于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(NT)細胞的標(biāo)準(zhǔn)化強度，并且Y軸表示對于轉(zhuǎn)導(dǎo)的(T)細胞的標(biāo)準(zhǔn)化的強度。很輕的灰色調(diào)線是表示-1.5、1和1.5倍變化值的倍數(shù)變化線。圖16D:測線圖，表示在強度值的基線轉(zhuǎn)化后，如圖16C中所示的同一組探針。
[0043]圖17A:在血清的存在下，使用攜帶空盒的慢病毒載體(rLV-EFl)以M.0.1.40和M.0.1.150轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時的包皮細胞。圖17B:用于轉(zhuǎn)錄組分析的批次B-S的rLV-EFl的表征。(I)通過qPCR確定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。(2)使用Quant-1T試劑盒PicoGreen dsDNA試劑盒(Life Technologies)定量殘留DNA。(3)通過在280 nm的分光光度法定量總蛋白。(4)通過HIV-p24 ELISA定量物理顆粒(PP)以確定PP/TU比例。
[0044]圖18:測線圖，表示相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)(NT)，使用rLV-EFl批次B_S有特異性差異，并且相對NT，使用rLV-EFl批次B和C (在M.0.1.40和`150)未受影響的一組探針。在表示數(shù)據(jù)之前，對強度值應(yīng)用基線轉(zhuǎn)化。在批次B-S M.0.1.150的情況下，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)化強度，對線進行著色。
[0045]表1:使用現(xiàn)有技術(shù)濃縮方法(對應(yīng)批次B的獲得)和本發(fā)明中所述方法(A、C和D)所獲得的本發(fā)明的相關(guān)產(chǎn)品的性能的概況。此表總結(jié)了本發(fā)明中所述的取決于濃縮和純化方法的批次特征。方法B (對應(yīng)批次B的獲得)代表現(xiàn)有技術(shù)方法的狀況。使用來自此方法的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生細胞生存力和增殖問題。C和D是本發(fā)明開發(fā)的方法(對應(yīng)所獲得的批次C和D)，以解決在使用來自方法B (對應(yīng)批次B的獲得)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后觀察到的細胞生存力缺陷。在該表中，批次A被認(rèn)為是對所有百分比數(shù)據(jù)(方法回收率、蛋白和DNA去除)的參照。批次A被認(rèn)為是優(yōu)化的批次，原因是它在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)，沒有丁酸鈉誘導(dǎo)并在基于對目的病毒顆粒特異性的半衰期的不同時間收獲。
[0046]表2:在所有批次A、B、C和D中污染物和滴度，以及功效的測量。
[0047]表3:收獲時間、丁酸鈉誘導(dǎo)對轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細胞和所獲得的粗載體組合物的影響。
[0048]發(fā)明詳述
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)高滴度和純度的病毒載體組合物(本文也稱為病毒載體顆粒)的新方法。如本文所述，已開發(fā)了用于載體生產(chǎn)和濃縮的新方法(圖5A)。所述方法首先基于在無血清培養(yǎng)基中真核細胞的瞬時轉(zhuǎn)染，其導(dǎo)致稱為批次A的粗批次的生產(chǎn)(圖5A)，相比用血清生產(chǎn)的批次(如圖4中所述的批次A-S)，其展示高品質(zhì)的性能。這種粗上清液(批次A)是優(yōu)化的，因為其生產(chǎn)沒有丁酸鈉誘導(dǎo)，無血清并且在轉(zhuǎn)染后取決于載體顆粒在37°C的半衰期的特定時間收集，取決于生產(chǎn)細胞類型和培養(yǎng)基，該半衰期為約8小時(Le Doux等，1999)。生產(chǎn)步驟之后可以是通過超濾濃縮和通過離子交換層析純化載體顆粒，并且分別導(dǎo)致本文稱為批次C或D的批次，并且其展示高比例的蛋白和DNA去除(表1和2)?？梢垣@得用于小和大規(guī)模應(yīng)用的產(chǎn)品，批次C和D，并且允許有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)，而如通過現(xiàn)有可用方法測量，對細胞生存力和增殖沒有顯著影響。這種有效轉(zhuǎn)導(dǎo)需要如本文提供的，用于有效的載體生產(chǎn)、濃縮和純化，同時保持載體潛能而不引入可干擾靶細胞分裂和代謝的細胞和培養(yǎng)基內(nèi)容物的方法(圖5A)。
[0049]本發(fā)明的用于生產(chǎn)基于RNA的病毒載體的方法包括:
(i)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞，所述細胞經(jīng)過修飾以補充在載體所基于的基于RNA的病毒基因組中的缺失，并且在合適的條件下培養(yǎng)，以允許基于RNA的病毒載體顆粒的生產(chǎn)，其中所述轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中進行；和
(?)收集包含所述基于RNA的病毒載體顆粒的上清液。
[0050]取決于載體顆粒在37°C的半衰期,所述收集可以以順序方式(in a sequentialmanner)進行，其中進行中間收獲。這與現(xiàn)有技術(shù)相反；在現(xiàn)有技術(shù)中，例如，在轉(zhuǎn)染后，經(jīng)典地通過兩步進行載體收獲，如Cooper等(2011)和Merten等(2010)所述。在本發(fā)明的一個實施方案中，在轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞后的72小時過程中可以進行幾次收獲。在本發(fā)明的非限制性實施方案中，取決于轉(zhuǎn)染方法和生產(chǎn)細胞系，在轉(zhuǎn)染后可以進行3-6次之間的載體收獲。在本發(fā)明的具體實施方案中，在轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞后以特定間隔進行四次收獲。所述收獲間的間隔時間基于在生產(chǎn)細胞系的培養(yǎng)基中在37 °C的載體半衰期。所獲得的規(guī)律間隔時間是在所需要的粗載體功能滴度OlO6 TU/ml)和能夠在轉(zhuǎn)染的細胞中誘導(dǎo)毒性的污染物的存在之間的平衡。
[0051]在本發(fā)明的方法中，使用目的病毒載體轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞。病毒載體經(jīng)設(shè)計以在導(dǎo)入靶宿主細胞后，在體內(nèi)或體外表達插入病毒核酸的目的核酸(本文也稱為轉(zhuǎn)基因)。這種向靶宿主細胞的導(dǎo)入可以用于，例如，在藥物發(fā)現(xiàn)或基因治療應(yīng)用中。
[0052]轉(zhuǎn)染定義為故意將核酸導(dǎo)入細胞的方法。該術(shù)語嚴(yán)格地用于在真核細胞中的非病毒方法。在將gag-pol和env表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞以在上清液中獲得病毒載體時，在病毒載體生產(chǎn)過程中使用轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)定義為故意將核酸導(dǎo)入細胞的方法。該術(shù)語用于在真核細胞中的基于病毒方法。從生產(chǎn)細胞收獲病毒載體并且與真核細胞接觸以獲得最終轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。
[0053]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述病毒載體基于屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒{Retrovir idiae)科的病毒，其包括包膜的RNA病毒，包括例如慢病毒(LV)和Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)載體。所述純化方法的開發(fā)需要準(zhǔn)確的載體的物理、化學(xué)和生物性質(zhì)的知識。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體源自屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒，其包括具有復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)的包膜RNA病毒，具有約150nm的流體動力學(xué)直徑(Salmeen等，1975)。由于尺寸大,所述病毒顆粒具有低擴散性(10_8 cm2/s);通過蔗糖密度梯度超離心確定，其密度為約1.15-1.16 g/cm3 (Coffin等，1997)。它們由60-70%蛋白、30-40%脂質(zhì)(來源于生產(chǎn)細胞的質(zhì)膜)、2_4%碳水化合物和1% RNA組成(Andreadis等，1999)。逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒由兩個相同拷貝的單鏈正義RNA，以及整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶組成，包含在由脂質(zhì)雙層膜包圍的蛋白衣殼內(nèi)。脂質(zhì)雙分子層上散布著糖蛋白的突出物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是在廣泛的PH值內(nèi)帶負(fù)電荷的顆粒，因為它們的等電點出現(xiàn)在非常低的PH值。包膜蛋白和脂質(zhì)雙分子層可能是在病毒表面的負(fù)電荷的主要貢獻者(Rimai 等，1975)。
[0054]待轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細胞的類型將取決于已經(jīng)選擇用于實施本發(fā)明的病毒載體。這些細胞包括任何容易轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞，例如，如293T或HeLa細胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)使用源自逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒載體，例如Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)和慢病毒載體(LV)時，可以使用293T細胞。將與目的病毒載體結(jié)合使用的細胞類型是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0055]生產(chǎn)細胞經(jīng)工程化以瞬時或穩(wěn)定地表達任何病毒蛋白，其中所述病毒蛋白的表達對于病毒載體的組裝和包裝導(dǎo)入病毒顆粒是必需的。在本發(fā)明的實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體，由細胞系生產(chǎn)，所述細胞系經(jīng)工程化以表達所述載體(其編碼轉(zhuǎn)基因)和輔助構(gòu)建體(編碼病毒蛋白)，如圖1中所述。為了盡量減少重組事件和復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組序列分成三個不同的構(gòu)建體(圖2A-C)。
[0056]第一個構(gòu)建體,gag-pol載體,編碼結(jié)構(gòu)蛋白和病毒酶。分別地,gag編碼基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼(CA)和核蛋白(NC)結(jié)構(gòu)，并且pol編碼反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)酶類。最優(yōu)選地，病毒gag和pol基因源自逆轉(zhuǎn)錄病毒,優(yōu)選慢病毒,并且最優(yōu)選源自HIV。
[0057]第二個構(gòu)建體，env載體，編碼包膜蛋白，從所述包膜蛋白通過二硫鍵衍生出表面(SU)和跨膜(TM)組分。TM組分通過跨膜區(qū)段錨定，并且無法從載體去除而不將其破壞(Coffin等，1997)。env基因可以源自任何病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒。env可以是雙嗜性包膜蛋白，其允許轉(zhuǎn)導(dǎo)人和其它物種的細胞，或可以是單嗜性包膜蛋白，其僅能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠和大鼠細胞。另外，可以期望通過將包膜蛋白與抗體或用于靶向特定細胞類型的受體的特定配體連接來靶向重組病毒。例如，通過將目的序列(包括調(diào)節(jié)區(qū))連同另一個基因(其編碼在特定靶細胞上受體的配體)插入病毒載體，所述載體現(xiàn)在是靶特異性的?？梢酝ㄟ^例如，插入糖脂或蛋白，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制成靶特異性的。經(jīng)常通過使用靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的抗體實現(xiàn)靶向。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，或可以無需過度實驗即可容易地確定實現(xiàn)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送到特異性靶的特定方法`。源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的env基因的實例包括但不限于:莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GALV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和勞氏肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其它env基因，例如水皰性口炎病毒(VSV)(蛋白G)。
[0058]提供病毒env核酸序列的載體連接到調(diào)節(jié)序列，例如啟動子或增強子。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)序列是病毒啟動子。所述調(diào)節(jié)序列可以是任何真核啟動子或增強子，包括，例如莫洛尼鼠白血病病毒啟動子-增強子元件，人巨細胞病毒增強子(如在示例性實施例中所使用)。在某些情況下，如莫洛尼鼠白血病病毒啟動子-增強子元件，這些啟動子-增強子元件位于LTR序列內(nèi)或與其相鄰。
[0059]第三個構(gòu)建體，轉(zhuǎn)基因載體，提供了對于病毒的生命周期的所需的順式作用病毒序列(圖2C)。這樣的序列包括psi包裝序列、反轉(zhuǎn)錄信號、整合信號、病毒啟動子、增強子和多腺苷酸化序列。這種第三載體還含有用于將轉(zhuǎn)移到靶細胞的異源核酸序列的克隆位點。合適的載體的示意圖顯示在圖2C中，使用GFP作為轉(zhuǎn)基因，但其可以替換為任何目的基因或序列，例如shRNA (短發(fā)夾RNA)或miRNA (微小RNA)。
[0060]這個構(gòu)建體可以包含其它表達元件，如野生型WPRE序列(Zufferey等，1999),cPPT/CTS元件(Manganini等，2002)。使用編碼β -內(nèi)酰胺酶的基因選擇用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細菌，以產(chǎn)生質(zhì)粒。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞后，轉(zhuǎn)錄從真核啟動子(RSV U3)起始到多聚腺苷酸化位點(HIV1 R)并且不包括編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因。內(nèi)酰胺酶蛋白或其相應(yīng)的RNA都沒有在生產(chǎn)細胞中表達，或被包被到載體顆粒中。
[0061]通過使用轉(zhuǎn)基因替換逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制所需的基因組區(qū)域消除病毒致病性。這保證了包裝到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組只編碼轉(zhuǎn)基因和對于包裝和反轉(zhuǎn)錄所需的序列。
[0062]三個逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的分離允許具有來自其它病毒的表面蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的假型化(pseudotyping)，從而擴大了病毒嗜性。在非限制性實施方案中，如本文中所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)用水皰性口炎病毒G蛋白(VSV-G)假型化(Clapham，P.等，1984)。用VSV-G蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)由與廣泛分布的質(zhì)膜的脂質(zhì)組分相互作用進入細胞，從而允許非常廣譜的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Verhoeyen等,2004和Yee等，1994)。由于包膜結(jié)構(gòu)的改變，假型化可對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)和純化具有很大的影響，從而影響在下游方法中使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的物理-化學(xué)膜性質(zhì)。
[0063]生產(chǎn)細胞可以用載體構(gòu)建體，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行轉(zhuǎn)染。這樣的技術(shù)包括，例如，磷酸鈣技術(shù)、DEAE-葡聚糖技術(shù)、電穿孔、基于滲透性休克的方法、顯微注射或基于使用脂質(zhì)體的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可以用鈣沉淀法轉(zhuǎn)染細胞。當(dāng)293T細胞是所選擇的生產(chǎn)細胞時，這樣的方法是優(yōu)選的，但也可使用等效的細胞。
[0064]轉(zhuǎn)染后，將細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育足夠的時間，以允許有效的病毒顆粒生產(chǎn)。無血清培養(yǎng)基被定義為用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的基本上不含源自動物的血清的生長培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的(Bruner等，2010)。轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)時間將取決于多種因素的組合，包括例如，所用的病毒載體的類型和所選擇的生產(chǎn)細胞系。在轉(zhuǎn)染后的時間間隔期間，即孵育時間，可以進行多次載體收獲。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可以進行4次載體收獲。為了確定最有 生產(chǎn)力的孵育條件，可以進行小批量實驗，以確定用于生成滴度最高和最純批次的病毒顆粒的最佳條件。
[0065]含有病毒載體顆粒的初始培養(yǎng)物上清液在本文中稱為批次A。本發(fā)明的方法可以進一步包括批次A產(chǎn)品的切向超濾滲濾步驟，用于病毒載體顆粒的進一步純化。這樣的超濾滲濾步驟是一種類型的膜過濾，其中靜水壓力向液體施加相對半透膜的壓力。懸浮固體和高于膜截止分子量的溶質(zhì)被截留，而水和低于膜截止分子量的溶質(zhì)穿過膜。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，超濾技術(shù)使用聚砜中空纖維濾芯，通過切向流超濾進行。該技術(shù)允許監(jiān)測和調(diào)整壓力，以保證維持載體完整性和生存力。這樣的步驟提供用于載體顆粒的濃縮，并且充當(dāng)用于從所收集的批次去除初始污染物(如宿主細胞蛋白和核酸)的純化步驟。這樣的批次在本文中稱為批次C。
[0066]在本發(fā)明的又另一個實施方案中，在切向超濾和/或滲濾步驟后，本發(fā)明的方法可以進一步包括離子交換層析步驟，可以進行該步驟以進一步濃縮和純化病毒載體顆粒。這樣的批次在本文中稱為批次D。
[0067]本發(fā)明涉及批次A的組合物在容許性(permissive)的永生化細胞系(例如HCT116)上的應(yīng)用。進一步地，本發(fā)明涉及批次C或D的組合物在基因治療應(yīng)用中的應(yīng)用，證實了與如圖4中所述批次B-S的現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)品相比，由于載體的制備條件或細胞培養(yǎng)的條件，其不誘導(dǎo)或輕微誘導(dǎo)細胞表型的變化。如本文所述，對無血清的粗批次使用超濾不僅允許濃縮載體顆粒，而且還允許通過從收集的批次去除多于70%的初始污染物(如宿主細胞蛋白質(zhì)和用于轉(zhuǎn)染的DNA)而將其純化(表2和3)。由于下游濃縮和純化步驟直接受到載體生產(chǎn)過程中細胞培養(yǎng)方法改變的影響，優(yōu)選的是，細胞培養(yǎng)和濃縮/純化步驟是并行進行的。從生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)基中去除血清對超濾和層析步驟具有強烈影響，因為初始蛋白和DNA內(nèi)容物在使用或不施用血清生產(chǎn)的粗批次中是完全不同的。Merten等(2010)使用基于多個基于膜和層析步驟的下游方法，但具有使用含10%血清的培養(yǎng)基的生產(chǎn)方法，這是根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的方法與Merten等(2010)的現(xiàn)有技術(shù)方法之間的重要區(qū)別。在Merten等(2010)的粗上清液中，初始總蛋白濃度為約6mg/ml,而在無血清的本發(fā)明中是0.14mg/ml，相差40倍。如本文中所述的，分別在超濾和層析分離后，在批次C和D中的蛋白最終濃度小于0.061mg/ml和0.01mg/ml,而在對用血清生產(chǎn)的批次進行多個基于膜和層析的步驟后，其達到1.5mg/ml的平均值(Merten等，2010)，分別相差25和150倍。
[0068]粗批次中缺少血清可以解釋在本發(fā)明和使用這些方法對病毒或載體純化的初步研究(Grzenia等,2008)中獲得的載體濃度和污染物去除中得到的差異。Grzenia等觀察到因為某些較小的損壞的病毒顆粒和病毒片段有可能沉積在膜表面上而產(chǎn)生的難題。純化的效率似乎在于膜的截止分子量、離子強度、跨膜壓(TMP)和載體大小之間的平衡。本發(fā)明證明，可以干擾純化方法的另一個參數(shù)基于可以影響從粗批次去除宿主DNA和蛋白的初始培養(yǎng)基內(nèi)容物。如本文所述，細胞培養(yǎng)、濃縮和純化步驟的組合可允許病毒顆粒(如基于慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒)的高回收率，其與高純度相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的具有高質(zhì)量水平的載體，允許iPS (誘導(dǎo)的多能干細胞)的生成而沒有由于血清內(nèi)容物或培養(yǎng)基污染物而對重編程過程中的細胞增殖的影響，如WO 2007/09666和WO 2009/13971中所公開。
[0069]本發(fā)明基于在本發(fā)明方法的每個步驟后(對應(yīng)于批次A、C和D的獲得)，與物理顆粒(PP)或能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的生物顆粒(TU)的顆粒定量相關(guān)的蛋白和DNA含量的研究，與常規(guī)使用的現(xiàn)有技術(shù)濃縮方法(對應(yīng)批次B的獲得)的比較。平行地評價了轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中的毒性和增殖，以確定濃縮和純化方法對細胞的表型影響。
[0070]本發(fā)明提供了含有可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的高滴度和高度純化的病毒顆粒的組合物。本發(fā)明的組合物提供當(dāng)需要使用大的培養(yǎng)基體`積或高感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)時，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)精致的或脆弱的細胞(如原代細胞和干細胞)的方式。因此，該組合物適合用于非整合型慢病毒載體(NILV)對精致且脆弱的細胞的應(yīng)用，這通常需要高M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0071]本發(fā)明證實，用于藥物開發(fā)和基因治療應(yīng)用的基于病毒的顆粒的有效生產(chǎn)，需要開發(fā)穩(wěn)健的濃縮操作和純化步驟，以及使用合適培養(yǎng)基以培養(yǎng)細胞，并重新懸浮將用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的載體批次。如本文所證明，靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不僅依賴于細胞類型(永生化的，原代和干細胞)，或起源的組織，還依賴于載體的特性(滴度、純度水平、蛋白和DNA含量)。
[0072]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制品不僅由病毒顆粒本身限定，也通過它們接近的環(huán)境限定，影響最終病毒載體制品的質(zhì)量水平，并且如本文所證實的，影響轉(zhuǎn)導(dǎo)水平和細胞生存力。
[0073]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是在含有蛋白和DNA污染物的DNA培養(yǎng)基中的蛋白、脂類和RNA的復(fù)雜大分子裝配物。因此，對這樣的環(huán)境的評價會是困難的。大部分困難來自在出芽過程中，生產(chǎn)細胞成分(主要是蛋白)在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)和病毒顆粒內(nèi)的摻入。所有這些特性大大地提高了確定在上清液中的哪些樣品成分與載體相關(guān)，并且哪些成分實際上是污染物的難度。最相關(guān)的上清液污染物是(i)非感染性的物理顆粒(PP)，(?)細胞或病毒蛋白，和(iii) DNA0
[0074]蛋白雜質(zhì)是在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上清液中最豐富的污染物。它們大多來自于生產(chǎn)細胞蛋白分泌，并且脅迫蛋白的比例在進行無血清方法時增加。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在出芽過程中摻入宿主細胞蛋白，使污染物和載體相關(guān)蛋白之間的區(qū)別變得復(fù)雜。在本研究中，所述病毒顆粒和它們的蛋白環(huán)境通過它們的比活性表示。比活性是每毫克總蛋白的載體生物活性(以TU/mg表示)，因此給出了在細胞培養(yǎng)基組合物中病毒載體活性的量度。在如本發(fā)明中所述的純化過程中，比活性隨污染物減少而增加。
[0075]在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上清液中也發(fā)現(xiàn)了 DNA污染物。關(guān)于核酸污染的關(guān)注來自于在靶細胞中細胞轉(zhuǎn)化事件，以及在體內(nèi)治療中細胞炎癥的可能性。污染DNA極限通常取決于轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)和應(yīng)用。污染DNA的不同來源是宿主生產(chǎn)細胞和來自于在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)中使用的瞬時轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。因此，可以在純化方法中引入DNA酶(例如來自德國Merck的Benzonase?)以降低DNA污染。細胞培養(yǎng)基中的病毒顆粒和它們DNA通過它們的比活性表示。比活性是每微克殘留DNA的載體生物活性(以TU/^g表示)。如先前所述，在如本發(fā)明中所述的純化過程中，比活性隨污染物減少而增加。
[0076]如同野生型病毒，并非制品中所有生產(chǎn)的病毒顆粒都是感染性的。事實上，一些缺陷出現(xiàn)在載體生產(chǎn)階段的后期。通常，顆粒裝配、殼體化、病毒RNA包裝或出芽可導(dǎo)致一些實體上的異常。因此，通常與感染性載體一同產(chǎn)生沒有RNA鏈，具有破壞的衣殼蛋白或不存在衣殼蛋白，或具有缺失包膜蛋白的病毒顆粒。那些沒有任何生物活性的物理顆粒具有與生物活性顆粒的幾乎相同的物理-化學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致難以將其消除。根據(jù)本發(fā)明，物理顆粒對感染性或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的比例(PP/TU)如果包含在下列之間，則認(rèn)為該比例是優(yōu)化的:
900:1和200:1，對于粗批次A，優(yōu)選小于600 ；
600:1和200:1，對于批次C，優(yōu)選300:1或更少；
400:1和100:1，對于批次0，優(yōu)選小于300:10
[0077]如對于方法B所觀察到的(對應(yīng)批次B的獲得)，濃縮步驟之前和之后PP/TU比例的增加，意味著該方法破壞了載體顆粒。由于多個原因，此比例代表純度的相關(guān)指數(shù)。首先，其給出了粗上清液中載體狀態(tài)的描述，并且其演變顯示了用于濃縮和純化載體的方法對它們完整性的影響。隨著其增加，該方法破壞顆粒。雖然很多研究獲得了大于1000或更高的比例，但在本發(fā)明中描述的方法中，粗滴度顯示PP/TU比例包含在500和900之間。Merten等(2010)在包含10%血清并且轉(zhuǎn)染后收獲兩次(各24小時)的批次中給出了 2333的比例。此數(shù)值按照下述公式計算:
PP/TU= (4.9xl04 ng P24/ml xlO7 PP/ng P24) / 4.3xl03 IG/ml，如Merten 等(2010)中的計算。一納克的P24表示IO7 PP，并且Merten等提供了在整合的基因組中計算的每毫升有效的滴度。此更高的比例證明一些載體在37°C下的生產(chǎn)階段中降解，并且血清內(nèi)容物增強了這種載體降解。這種差異突出了血清和收獲時間是使用顯示小于900:1的PP/TU的適宜批次開始濃縮和提純步驟的關(guān)鍵點。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，第一次收獲時間在轉(zhuǎn)染后24小時和36小時之間。任何后續(xù)的收獲可以在前面收獲后12小時完成。具有更高比例的粗批次在濃縮和純化步驟后不導(dǎo)致所需的最終產(chǎn)品。
[0078]包含現(xiàn)有技術(shù)中描述的載體的組合物包含污染物，其可以對靶細胞表型具有有害影響，并且可以影響由所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制品轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細胞表達或高表達目的轉(zhuǎn)基因的能力。這些表型的變化可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)后發(fā)生，并且可影響轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中的細胞增殖或細胞生存力。本發(fā)明提供幾個穩(wěn)健和可升級的純化方法，允許與精致且難控制的靶細胞以及體內(nèi)臨床前實驗要求相容的，污染蛋白和DNA濃度以及物理顆粒對感染性顆粒的比例的顯著下降。
實施例
[0079]提供下面的實施例以幫助更好地理解本發(fā)明，盡管本發(fā)明不限于這些實施例。
[0080]材料和方法
質(zhì)粒構(gòu)建。為了生產(chǎn)重組病毒粒子或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，使用了三種載體。第一載體提供了編碼病毒gag和pol基因的核酸(圖2A)。如上文所討論的，這些序列分別編碼組特異性抗原和反轉(zhuǎn)錄酶，(以及成熟和反轉(zhuǎn)錄所必需的整合酶和蛋白酶-酶類)。第二載體提供了編碼病毒包膜(env)的核酸(圖2B)。第三載體提供了病毒的生命周期所需的順式作用病毒序列(圖2C)。這個第三載體還含有用于將轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細胞的異源核酸序列的克隆位點。合適的載體的示意圖示于圖2C中，使用GFP作為轉(zhuǎn)基因，但可以將其替換為任何目的基因或序列，例如shRNA或miRNA。
[0081]病毒載體制造方法。細胞系和培養(yǎng)條件。病毒載體使用人胚腎(HEK293T)細胞系生產(chǎn)。人結(jié)腸癌(HCT116 ;ATCC N0 CCL-247)粘附細胞系用于感染性顆粒的定量。所有細胞由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)提供并且在補充10% FCS (胎牛血清(fetalcalf serum)或胎牛血清(fetal bovine serum, FBS))、1%青霉素/鏈霉素和1%超谷氨酰胺(ultraglutamine (PAA))的 Dulbecco 氏改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM, Gibco, Paisley,UK)中，在37°C，在空氣中5% CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)。對于病毒載體上清液的生產(chǎn)，DMEM僅補充1%青霉素/鏈霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)。
[0082]病毒載體生產(chǎn)。病毒載體生產(chǎn)在10層CellSTACK (6320cm2，Corning)中進行。HEK293T細胞以9.5xl03個活細胞/cm2接種在補充有10% FCS、1%青霉素/鏈霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)的DMEM中，并放置在37°C，空氣中5% CO2的潮濕氣氛中。接種后4天，在轉(zhuǎn)染細胞前，棄去上清液并替換為補充有1%青霉素/鏈霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)不含F(xiàn)CS的新鮮DMEM。
[0083]三重轉(zhuǎn)染混合物由下列三種質(zhì)粒組成:pENV、pGagPol、pLV-EFl-GFP。使用無菌水將最終濃度調(diào)整到40mg/ml-l。然后在軟校驗(soft checking)下將CaCl2 (2.5M)滴加到質(zhì)粒-水混合物中以達到500mM的終濃度。然后，將所獲得的混合物滴加到等體積的Ifepes緩沖的鹽水(HBS 2X)中，并在室溫孵育20分鐘。孵育后，將轉(zhuǎn)染的混合物添加到細胞培養(yǎng)基，并在37°C在空氣中5% CO2的潮濕氣氛中孵育24小時。
[0084]轉(zhuǎn)染后24小時，棄去上清液并且替換為無補充的新鮮DMEM，并且將細胞在37°C在空氣中5% CO2的潮濕氣氛中孵育。培養(yǎng)基交換后，收集幾次上清液(轉(zhuǎn)染后32h、48h、56h和72h)。添加一些新鮮且無補充的培養(yǎng)基，并且在進一步收獲前，將細胞在37°C在空氣中5% CO2的潮濕氣氛中孵育。
[0085]每次收獲物通過在3000g離心5分鐘澄清，然后通過0.45Mm孔徑無菌濾器單元(Stericup, Millipore)微濾。然后，將整組收獲物混合以提供粗收獲物。
[0086]LDH細胞毒測定。還使用LDH細胞毒性測定試劑盒II (PromoKine)測量由編碼慢病毒載體(Ientivector)顆粒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后從293T生產(chǎn)細胞釋放的LDH酶(乳酸脫氫酶)。293T細胞上清液用作“低對照”，同時通過細胞裂解液裂解293T細胞，以代表“高水平對照”。然后，根據(jù)制造商的方案，對作為樣品的每個粗上清液回收物進行LDH測定，以評估293T細胞在不同慢病毒載體生產(chǎn)過程期間的死亡率。LDH細胞毒性測定試劑盒II利用WST試劑(水溶性四唑)用于檢測從損傷的細胞釋放的LDH。該測定使用酶偶聯(lián)反應(yīng)；LDH氧化乳酸以生成NADH，NADH然后與WST反應(yīng)以產(chǎn)生黃色。然后，用分光光度計(GlomaxMultiDetection System, Promega reference)在 450nm 光密度定量 LDH 活性。對于每個測試的粗上清液以單次(simplicate)重復(fù)該測定。
[0087]病毒載體濃縮和純化。粗收獲物的濃縮和純化首先通過切向流超濾使用聚砜中空纖維濾芯進行。然后，以連續(xù)模式滲濾，將上清液相對DMEM或TSSM緩沖液滲濾20倍滲濾體積。一旦進行滲濾，回收截留液并進一步在一次性超濾單元上濃縮。
[0088]然后，通過添加終濃度72U/ml的Benzonase (250υ/μ1)和終濃度?μΜ的MgCl2(1.0mM)，使用benzonase處理中空纖維過濾(HFF)截留液，然后在37°C孵育20分鐘。
[0089]然后，使用AKTA提純器系統(tǒng)(GE Healthcare)，通過離子交換層析(IEX)在Sartobind Q75 (Sartorius) —次性膜上進一步純化經(jīng)過HFF后的材料。離子交換膜用5倍柱體積的無補充的DMEM (或TSSM)以2ml/min平衡。然后，使用進樣環(huán)路將病毒上清液以2ml/min加載到膜上。收集通流物。將以下分步梯度應(yīng)用到AKTA系統(tǒng)上:0M、0.5M、1.2M和2M NaCl。將洗脫級分(elution pic，用1.2M NaCl分步梯度收集)立即IOX稀釋到下列緩沖液中:20mM Tris + 1.0% w/v鹿糖+ 1.0% w/v甘露醇，pH7.3,并進一步在一次性超濾單元上濃縮。
[0090]使用qPCR的功能性顆粒定量。進行轉(zhuǎn)導(dǎo)單位滴定測定，如下所述。將HCT116細胞以每孔12500細胞和250μ?補充有10% FCS ;1%青霉素/鏈霉素和1%超谷氨酰胺的DMEM上清液(完全培養(yǎng)基)接種到96孔板上。24小時后，對于每個載體樣品和rLV-EFl-GFP內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品用完全培養(yǎng)基進行5次連續(xù)稀釋。在8Pg/mL Polybrene? (Sigma)的存在下,通過這些連續(xù)稀釋物轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。對于每個`樣品系列，添加一孔未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞用作對照。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，用胰蛋白酶處理細胞，并且每`份細胞沉淀用250μ? PBS重懸。然后，將100 μ L細胞懸浮液置于比色皿中，并且使用Versafluor (Biorad)測量以RFU (相對熒光單位)計的熒光強度。使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(其滴度先前通過FACS確定)，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml (TU/mL)確定滴度。
[0091]通過p24 ELISA測定的物理顆粒定量。使用Perkin Elmer提供的HIV-1 p24 ELISA試劑盒，直接對病毒上清液進行P24核心抗原檢測。根據(jù)供應(yīng)商的說明使用該試劑盒。使用針對HIV-1 p24的生物素化多克隆抗體，隨后使用鏈霉親和素-HRP (辣根過氧化物酶)綴合物，使捕獲的抗原形成復(fù)合物。通過與鄰苯二胺-HCl (OPD)(其產(chǎn)生與捕獲的p24的量成正比的黃顏色)一起孵育，檢測所得的復(fù)合物。使用微孔板讀數(shù)器確定每個微孔板的孔的吸光度，并且相對HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定。從p24的量計算在每毫升物理顆粒中表達的病毒滴度，已知Ipg的p24對應(yīng)IO4個物理顆粒。
[0092]殘留DNA定量。根據(jù)供應(yīng)商的說明，使用Quant-1T試劑盒PicoGreen dsDNA試劑和試劑盒(Life Technologies)確定在每個樣品中殘留DNA的量。使用稀釋在樣品稀釋緩沖液(DMEM或TSSM)中的質(zhì)粒完成校準(zhǔn)曲線。該反應(yīng)本身包括在96孔板中，將25μ1樣品與25μ1 TE緩沖液和50μ1的PicoGreen?染料的工作溶液混合。然后，避光孵育反應(yīng)5分鐘以允許染料結(jié)合雙鏈DNA。然后，在讀板器上在435/535 nm的激發(fā)/發(fā)射下測量樣品的熒光。
[0093]總蛋白定量。每個樣品中的蛋白的總量使用DCTM蛋白試劑盒(Biorad)確定，其方法衍生自Lowry法。根據(jù)供應(yīng)商的說明使用該試劑盒。使用稀釋在樣品稀釋緩沖液(DMEM或TSSM)中的BSA完成校準(zhǔn)曲線。該測定是基于蛋白與堿性酒石酸銅溶液和福林試劑反應(yīng)。如同Lowry測定，導(dǎo)致顯色有兩個步驟:在堿性介質(zhì)中蛋白和銅之間的反應(yīng)和后續(xù)的通過銅處理的蛋白對福林試劑的還原。
[0094]SDS-PAGE凝膠電泳。樣品在95 °C在“樣品緩沖液4X” (Biorad)和“還原劑20X”(Biorad)中變性5分鐘。變性后，將樣品置于“Criterion XT Bis-Tris 4-12%凝膠”(Biorad)的孔中。將分子量標(biāo)記物“Precision Plus Protein Dual Color Standard”置于樣品旁邊。在“XT MOPS緩沖液”(Biorad)中進行遷移。遷移后，將凝膠用水清洗多次，隨后，用“Biosafe Coomassie Stain^(Biorad)染色。最終，進行多次水清洗以獲得所期望的對比度。
[0095]細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。細胞培養(yǎng)。人胚肺成纖維細胞系(IMR90)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(N。CCL-186)獲得并且在補充10%胎牛血清(FCS ；Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM ;Gibco，Carlsbad，CA，USA)中，在37°C，在包含5% CO2的潮濕空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0096]使用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)IMR90細胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時，IMR90細胞以50000個細胞/孔接種在6孔板中。然后，用TU標(biāo)準(zhǔn)化的攜帶eGFP的慢病毒載體以從5至200的不同M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。5小時后去除轉(zhuǎn)導(dǎo)上清液。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天，收獲細胞并且通過流式細胞術(shù)分析eGFP表達。
[0097]細胞增殖測定。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基溴化四氮唑(MTT ；Sigma)比色染料還原法測量細胞增殖。將MR90細胞以每孔1.5xl03個細胞的密度接種到96孔板中的包含10% FCS的DMEM中。將細胞培養(yǎng)24小時，隨后，使用不同純化水平的病毒載體，對于每個病毒載體以40和150的Μ.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5或14天，向每孔中添加20μ1在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT ；5 mg/ml ；Sigma)，并在37°C培養(yǎng)另外2.5小時。然后，棄去培養(yǎng)基并且將深藍色結(jié)晶溶解在各孔中ΙΟΟμ I的二甲亞砜(DMSO)中。然后，將各孔均質(zhì)化，隨后使用分光光度平板讀數(shù)器(Glomax MultiDetection System, Promega)測量在 560nm 的光密度(OD)。對于每個測試的病毒載體一式三份重復(fù)增殖測定。
[0098]LDH細胞毒性測定。LDH細胞毒性測定試劑盒II (PromoKine)用于測量從轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞釋放的LDH酶(乳酸脫氫酶)。將人成纖維細胞以每孔1.5xl03個細胞的密度接種到96孔板中的包含10% FCS的DMEM中，并且然后血清限于2% FCS進行24小時。然后，使用不同純化水平的病毒載體，對于每個病毒載體以40和150的M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天，按照制造商的方案進行LDH測定。LDH細胞毒性測定試劑盒II利用WST試劑(水溶性四唑)用于檢測從損傷的細胞釋放的LDH。該測定使用酶偶聯(lián)反應(yīng)；LDH氧化乳酸以生成NADH，NADH然后與WST反應(yīng)以生成黃色。然后，用分光光度計(Glomax MultiDetectionSystem, Promega reference)在450nm光密度定量LDH活性。對于每個測試的病毒載體一式三份重復(fù)該測定。[0099]用于微陣列分析的空盒載體生產(chǎn)。生產(chǎn)不同純度的無cDNA的攜帶空盒的慢病毒載體(rLV-EFl)用于微陣列研究。rLV-EFl載體的批次B和C從相同的粗收獲物純化。在10%胎牛血清(B10WEST)的存在下完成額外的生產(chǎn)以生成批次B，下文中稱為批次B-S。
[0100]包皮細胞的培養(yǎng)。人包皮成纖維細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(N° CRL-2097)獲得并且在補充10%胎牛血清(B10WEST)、1%青霉素/鏈霉素(PAA)和2mM谷氨酰胺(PAA)的EMEM (Earl氏最小必需培養(yǎng)基，GIBC0)中培養(yǎng)。在37°C在5% CO2的存在下保持細胞，并以5000個細胞/cm2每周傳代兩次。本發(fā)明不限于原代細胞,例如人包皮成纖維細胞。
[0101]用于轉(zhuǎn)錄組分析的包皮細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時，將人包皮成纖維細胞以5000個細胞/cm2接種到T25培養(yǎng)瓶中。在Polybrene? (Sigma)的存在下，使用批次B、C和B-S的rLV-EFl載體以M.0.1.40和150以5mL的終體積轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，一式四份。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照僅接受4Pg/mL Polybrene?。約16小時后,去除轉(zhuǎn)導(dǎo)上清液。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后54小時,用胰蛋白酶處理細胞，用IxPBS清洗，離心并且將沉淀保持在_80°C。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，獲取圖像。
[0102]RNA提取。根據(jù)制造商的說明，使用TRIZol? Plus RNA純化系統(tǒng)(LifeTechnologies)從細胞沉淀中提取總RNA樣品。使用Nanodrop 1000分光光度計(NanodropTechnologies)確定總 RNA 濃度和純度。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer (AgilentTechnologies, USA)檢查RNA質(zhì)量和完整性，并且使其符合Agilent微陣列的要求。
[0103]DNA微陣列實驗。根據(jù)制造商的方案，在Biochips Platform of Genopole,University of Toulouse, INSA, UPS, I NP, CNRS & INRA (法國圖盧茲)進行微陣列實驗。簡而言之，添加來自用于質(zhì)量控制檢查的單色RNA Spike-1n試劑盒(AgilentTechnologies)的外源RNA的稀釋物后，使用Agilent Low Input Quick Amp試劑盒將IOOng總RNA轉(zhuǎn)化為cRNA，擴增并進行花菁3-標(biāo)記。將1650ng花菁3-標(biāo)記的cRNA在65°C，IOrpm下雜交17小時，以雜交到Agilent全人基因組寡核苷酸微陣列4x44K第2版，其包含靶向27958個基因的44000個探針。將雜交的陣列清洗，并在Agilent高分辨率掃描儀G2505C上掃描雜交的陣列，并且使用Feature Extraction 10.10 (AgilentTechnologies)分析圖像。在基于Feature Extraction QC報告的質(zhì)量控制后，每個條件下保留3或4個重復(fù)。
[0104]微陣列數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。來自Feature Extraction的原始數(shù)據(jù)集導(dǎo)入GeneSpring? GX 12軟件(Agilent Technologies)并使用第75百分位方法標(biāo)準(zhǔn)化。然后，在導(dǎo)入Feature Extraction數(shù)據(jù)時,通過歸因于GeneSpring?的旗標(biāo)值(flag value,對于每個探針，下列旗標(biāo)之一受影響:“檢測的”、“未檢測的”或“妥協(xié)的”)過濾探針。保留檢測到的并在至少一個條件下在多于60%的重復(fù)中未被妥協(xié)的探針(消除未檢測到的或妥協(xié)的點)。使用強度值向所有樣品的中值的基線轉(zhuǎn)化，以用于測線圖表示。這意味著，對于每個探針，計算來自所有樣品的log加和值的中值，并從每個樣品減去該中值。為了鑒定在每種條件和對照條件之間差異表達的探針，進行具有Benjamin1-Hochberg多重檢驗校正的獨立的t檢驗，并且校正的？值〈0.05。對于上調(diào)和下調(diào)的探針，保留具有≥1.5的倍數(shù)變化(FC)絕對值的探針作為差異表達的探針。具有〈1.3的倍數(shù)變化絕對值的探針被認(rèn)為是非差異的。
[0105]結(jié)果在不同細胞類型上的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。當(dāng)需要穩(wěn)定的基因過表達或沉默時，所進行的第一個測定是選擇所需感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)以獲得最佳的基因調(diào)整。并非所有細胞對逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體都表現(xiàn)出相同的容許性(permissivity)。使用增加量的表達GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞，以確定細胞完全轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件并鑒定相應(yīng)的基因表達水平。在圖3A和3B中，觀察到隨著M.0.1.增加，首先轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的數(shù)目增加到靶細胞的95-100%，并且其次GFP的表達水平增強。在永生化的細胞系中，在原代細胞中，和在干細胞中觀察到此現(xiàn)象。此結(jié)果顯示用慢病毒載體對所有測試的細胞的基因遞送的劑量效應(yīng)，以及對于一種細胞類型所用的M.0.1.不能轉(zhuǎn)用到另一種細胞類型。每個細胞類型需要特定的M.0.1.。
[0106]慢病毒載體滴度定量。通常病毒的滴度，并且特別是基于慢病毒的載體的滴度，依賴于用于滴定的方法和細胞。能夠?qū)崿F(xiàn)從細胞進入到基因整合和基因表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的步驟的載體顆粒的定量依賴于載體本身和細胞特征。
[0107]關(guān)于用于載體滴定的細胞，因為證明了所有細胞類型的容許性是不等價的，重要的是保證靶細胞易于成為容許性的，如圖3A和3B中顯示。另一點是必須容易地監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，用于對任何轉(zhuǎn)基因和載體隨時間的可靠定量。這里，在每個滴定實驗中，在使用根據(jù)上述材料和方法的載體的連續(xù)稀釋物轉(zhuǎn)導(dǎo)HCTl 16之后，通過FACS (表示為每ml轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的數(shù)目，TU/ml)和qPCR (表示為每ml整合的基因組的數(shù)目，IG/ml)對標(biāo)準(zhǔn)的表達GFP的慢病毒載體以效率單位進行定量。這兩個結(jié)果給出了用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效顆粒的相對數(shù)量，但取決于PCR本身和用于擴增的靶序列，它們各自的絕對數(shù)沒有給出相同滴度。這些數(shù)據(jù)顯示在不存在標(biāo)準(zhǔn)化方法的情況下，難以基于功能性滴度精確地比較這些不同的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)化方法應(yīng)當(dāng)包括具有已知滴度的參考批次和確定的靶細胞類型。
[0108]平行地，使用P24 ELISA試劑盒量化總顆粒的測定，以估計總載體顆粒，即使是那些不含有任何基因組RNA和/或不含包膜蛋白的顆粒。兩個滴度都是有用的，以確定反映總顆粒的物理顆粒PP與給出真實轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的生物滴度之間的比例。這個比例給出了載體純度和完整性的 估計。使用另一比例反映載體完整性或感染性，并且表示為每ng P24 (IngP24對應(yīng)IO7PP)的IG數(shù)。
[0109]病毒載體生產(chǎn)方法。根據(jù)本發(fā)明，使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣程序，通過向293T細胞的三重轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)基于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的載體。在轉(zhuǎn)染后24小時(Sena-esteves等,2004),使用無血清培養(yǎng)基清洗細胞，并且在24小時后收集病毒上清液并過濾。現(xiàn)有技術(shù)的載體通常在包含血清的培養(yǎng)基中生產(chǎn)，并通過超離心或在由不同供應(yīng)商提供的中心單元上的離心濃縮。在本發(fā)明中，取決于表達載體構(gòu)建體，在圖5A中稱作批次A的粗批次顯示約IO6 TU/ml的平均滴度。在本文所述濃縮步驟后，滴度達到高達例如IO7-1O8 TU/ml。通過這些標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)的這些小規(guī)模批次顯示幾個缺點。首先，由于這些簡單方法的受限的容量，難以放大規(guī)模。其次，所述方法限于濃縮并且不允許培養(yǎng)基內(nèi)容物的顯著去除。為了避免蛋白和血清成分的存在，根據(jù)本發(fā)明的方法，在將批次A進行超濾和/或?qū)游鲆詽饪s和純化載體批次之前，在無血清培養(yǎng)基中收獲載體上清液。這是重要的，因為在一些情況下，載體需要以高M.0.1.在體外和體內(nèi)使用，尤其對于非整合型慢病毒載體(圖1OA和10B)。
[0110]血清對載體滴度的影響。本發(fā)明提供了用于在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)高滴度的病毒上清液的優(yōu)化的穩(wěn)健方法。通過使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣方法，通過在0、5和10% FCS (胎牛血清)中的293T細胞中的瞬時三重轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)慢病毒載體rLV-EFl-GFPiFl α (人延伸因子I α )啟動子是普遍存在的強啟動子。收獲病毒上清液并且將15Pg總蛋白加載到SDS-PAGE凝膠上以分析總蛋白含量。結(jié)果顯示無血清生產(chǎn)的粗上清液包含較低量的蛋白，與血清的缺少直接相關(guān)。平行地，確定含血清和無血清的情況下PP和TU之間的比例。證明在所有條件下滴度(TU/mL)和PP/TU比例保持穩(wěn)定?？傊瑹o血清生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體沒有降低載體生產(chǎn)效率(圖4C)，但是降低了樣品的總蛋白含量(圖4B和表1)。
[0111]細胞感染后載體顆粒的順序收獲。本發(fā)明描述了對于轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細胞的誘導(dǎo)毒性的比較，其是否依賴于丁酸鈉的誘導(dǎo)(轉(zhuǎn)染后18小時)以及在轉(zhuǎn)染后72小時期間的收獲的數(shù)目。這些實驗顯示在任何粗上清液中功能性滴度高于IO6 TU/ml，并且強調(diào)了上清液收獲的數(shù)目和丁酸鈉誘導(dǎo)對所導(dǎo)致的生產(chǎn)細胞毒性的強烈影響。在一方面， 申請人:注意到，回收的數(shù)量和是否用丁酸鈉誘導(dǎo)對粗上清液的滴度具有的影響小，對于通過5個步驟收獲的無丁酸鈉誘導(dǎo)的病毒載體生產(chǎn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的生產(chǎn)改進2倍(參見表3，TU/生產(chǎn))。另一方面，在無丁酸鈉誘導(dǎo)且無血清的情況下生產(chǎn)，通過根據(jù)載體顆粒半衰期調(diào)整的多個步驟收獲的粗上清液中釋放的總DNA濃度是最低的，相比于用丁酸鈉誘導(dǎo)且收獲時間固定在轉(zhuǎn)染后64小時和88小時的生產(chǎn)下降7倍。這些結(jié)果通過直接對粗上清液進行的LDH細胞毒性測定得到證實，并顯示在無丁酸鈉誘導(dǎo)且無血清的情況下生產(chǎn)，通過根據(jù)載體顆粒半衰期調(diào)整的多個步驟收獲粗上清液時，轉(zhuǎn)染細胞的裂解是有限的。同時，在粗上清液中的總DNA濃度和細胞毒性水平通過丁酸鈉誘導(dǎo)和收獲時間固定在轉(zhuǎn)染后64小時和88小時而提高，顯示細胞裂解在這些生產(chǎn)條件下增強。當(dāng)僅通過在細胞洗滌后40小時和64小時的兩個步驟收獲無丁酸鈉誘導(dǎo)的粗上清液時，所誘導(dǎo)的毒性達到82 %和48 %，但使用中間收獲時，對轉(zhuǎn)染細胞的毒性不超過30%，對于前三次收獲的平均值為13.3%，并且對于最后一次收獲為16.4% (表3)。因此，通過以規(guī)律間隔的多個(包括在3個和6個之間)步驟實現(xiàn)的粗上清液的回收，是獲得所請求保護的純化的基于RNA的病毒載體組合物的起始點。在轉(zhuǎn)染后的特定時間進行不同收獲，所述特定時間與載體顆粒在37°C的半衰期相關(guān)，所述半衰期是約8小時，取決于生產(chǎn)細胞類型和細胞培養(yǎng)基(Le Doux等，1999)。通過與載體半衰期相關(guān)的多個步驟的收獲，無丁酸鈉誘導(dǎo)且無血清，是生產(chǎn)粗上清液，即根據(jù)本發(fā)明的批次A的最佳條件。這些結(jié)果強調(diào)初始粗上清液組合物在很大程度上受到生產(chǎn)方法本身的影響，并且這個起始組合物在毒性方面對轉(zhuǎn)染的靶細胞具有很大影響。
[0112]載體濃縮和純化。根據(jù)本發(fā)明的方法包括兩種類型的濃縮和/或純化批次(C和D)，與無血清生產(chǎn)方法相關(guān)(對應(yīng)批次A的獲得)。這些方法與基于超速離心法或在中心單元上的離心法的標(biāo)準(zhǔn)和常用濃縮方法(對應(yīng)于批次B的獲得)進行比較。不同批次對應(yīng)不同的純化策略，從沒有純化到基于超濾和層析的幾個純化步驟。四種純化方法在污染物去除方面具有遞增的品質(zhì)(圖6和7)。
[0113]對應(yīng)于獲得批次A的方法A:此類批次不包括任何純化步驟并且對應(yīng)澄清后的收獲物。此類批次通常展示一種或多種下列特征:(i)約IO6 TU/ml的平均最終滴度，取決于表達質(zhì)粒構(gòu)建體(表1);高達650ng/ml的平均最終DNA污染物濃度；(iii)高達20(^g/ml的平均最終蛋白污染物濃度；和(iv)包含500和900之間或更低的平均最終PP/TU比例(表1和2)。
[0114]當(dāng)所需的工作M.0.1.可以較低時，使用此方法生產(chǎn)的病毒載體適合用于轉(zhuǎn)導(dǎo)一些容許性的永生化的細胞系。在對其它批次的污染物去除表征研究中，將這個批次用作參照(即，這個批次的污染物代表100%的生產(chǎn)方法雜質(zhì))(表1和圖6)。所有下列數(shù)據(jù)與此參照粗批次相關(guān)。因為無血清和丁酸鈉誘導(dǎo)，以及基于病毒顆粒特異性的半衰期選擇的不同收獲時間，批次A是優(yōu)化的批次。
[0115]對應(yīng)于獲得批次B的方法B:此方法對應(yīng)于已經(jīng)經(jīng)過濃縮步驟的澄清后收獲物(無血清培養(yǎng)基)，所述濃縮通過使用即用型離心單元的超濾進行。此濃縮的批次以與如圖4A中相同但無血清的方法產(chǎn)生。此類批次通常展示一種或多種下列特征:(i)最終載體滴度在Ixl07-lxl08 TU/ml之間；(ii)相比批次A，根據(jù)本發(fā)明的有效載體的方法回收率在約47% ； (iii)相比批次A的濃縮系數(shù)為95 (表2) ; (iv)相比批次A，DNA去除為約71%的初始污染物；(V)相比批次A，蛋白去除為約56%的初始污染物(圖6);和(vi)在約500或更多的平均最終PP/TU (圖8)。此比例比從粗批次獲得的那些增加，表明這些濃縮方法在方法本身期間破壞了病毒顆粒，即使無血清也是如此。此現(xiàn)象在血清的存在下被放大。
[0116]相比先前發(fā)表的使用包含血清的粗批次的基于病毒的載體，有利地生產(chǎn)這種產(chǎn)品。其顯示與在文獻中描述的使用超離心(圖5B)的產(chǎn)品相同的特征。該方法的優(yōu)點是當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞所需要滴度比通過方法A所提供的滴度更高時，濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。此方法基于使用基于即用型離心單元的超濾技術(shù)的粗收獲的濃縮或基于超離心。在粗上清液中無血清生產(chǎn)的兩種產(chǎn)品在加載到SDS-PAGE凝膠上后均展示相同的蛋白概況(圖5B)。使用例如胎牛血清(FCS)，用這些技術(shù)濃縮的載體的蛋白概況顯示于圖4B，并且揭示了拖尾的條帶，其中特定的病毒蛋白無法通過其大小或通過其低強度區(qū)分。此結(jié)果促使本發(fā)明人使用此方法B，對無血清生產(chǎn)的載體批次進行濃縮，以能夠比較下游濃縮和純化方法對獨立于血清的存在的載體顆粒本身的結(jié)果。
[0117]對于在中心單元上的離心，操作模式是通過通常的流過濾，使用利用離心力用于壓力設(shè)置。因此，該技術(shù)不允許壓力監(jiān)測，所述壓力檢測是對于載體完整性和生存力的關(guān)鍵點。此技術(shù)中使用的膜的類型相比其它膜的類型增加非特異性吸附。因此，不僅載體，而且雜質(zhì)也被濃縮。事實上，達到了低純化水平(對于DNA和蛋白分別在I和3之間，以及I和2之間)(參見圖9作為實例)。平行地，此方法對于生物活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非常有破壞性，如通過從方法A (在圖8的實驗中在200和350之間)到方法B (在圖8的實驗中，至多達650)增加的PP/TU比例所示。盡管PP/TU比例的如此增加，但這些基于超離心或在中心單元上的超濾的現(xiàn)有技術(shù)方法在文獻中大量使用。當(dāng)所需的工作M.0.1.需要是高M.0.1.時，此方法B適于轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化的細胞系，但不適于轉(zhuǎn)導(dǎo)脆弱的和原代細胞或干細胞，所述細胞可以進行具有功能性表型需要的分化或重編程過程。
[0118]在這里認(rèn)為，在缺少基于離子強度、pH和壓力的受控操作條件下進行超濾不會允許有效的分離，即使對于大小差別少一個數(shù)量級的蛋白質(zhì)也是如此。此最后一點是關(guān)鍵的，并且強調(diào)由于慢病毒載體的巨大尺寸(120nm)，理想的超濾步驟將不僅濃縮載體顆粒，還通過去除污染物(例如宿主細胞蛋白和DNA)而將其純化。因此，已開發(fā)了下列稱為C的方法以提高批次A的滴度，同時保持批次的質(zhì)量和純度。
[0119]對應(yīng)于獲得批次C的方法C:此方法對應(yīng)已經(jīng)經(jīng)過濃縮和滲濾步驟的澄清后收獲物(無血清培養(yǎng)基)，所述濃縮和滲濾通過使用中空纖維的超濾進行。此類批次通常展示一種或多種下列特征:(i)最終滴度在Ixl07-lxl08 TU/ml之間；(ii)相比批次A，根據(jù)本發(fā)明的有效載體的方法回收率在約69% ; (iii)濃縮系數(shù)為約25，且但通常在20到40之間(表2和3) ； (iv)相比批次A，DNA去除為約82%的初始污染物(從70%到90%) ； (v)相比批次A，蛋白去除高達98%的初始污染物(圖9);和(vi)在200和600之間的平均最終PP/TU比例(圖8)。
[0120]在此，比例PP/TU在批次A和C之間保持穩(wěn)定，顯示獲得批次C的方法沒有如同其對于來自方法B的批次(對應(yīng)所獲得的批次B)所做的那樣破壞病毒顆粒(圖8)。
[0121]該方法的優(yōu)點是將來自澄清的粗收獲的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒的濃縮和純化組合。與用于批次B的濃縮技術(shù)相比，該技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的破壞較少。在獲得批次C的方法中使用的超濾技術(shù)與用于獲得批次B的技術(shù)非常不同。事實上，在獲得批次C的方法中使用的方法基于使用中空纖維使用超濾技術(shù)對粗收獲的濃縮。此技術(shù)的操作模式通過切向流過濾，使用泵壓用于壓力設(shè)置。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的教導(dǎo)，該技術(shù)允許監(jiān)測和調(diào)整壓力用于維持載體完整性和生存力。例如，在所有的過程中，入口流載體上清液必須維持在低水平，并且跨膜壓力必須低和完全穩(wěn)定。相比用于獲得批次B的方法，此技術(shù)中使用的膜的類型不增加非特異性吸附。因此，這種更溫和的方法允許與高雜質(zhì)去除相關(guān)的高載體回收率。此外，使用此技術(shù)獲得的低剪切力允許PP/TU比例從對于澄清的粗收獲物(批次A)獲得的PP/TU比例降低到約300或低于(參見，例如圖8)。這種破壞性較小的技術(shù)允許強力去除大部分雜質(zhì)(相比批次A，分別為初始DNA和蛋白污染物的82%和98%)，并且允許提高純化水平，相比批次B對于DNA和蛋白分別從1.7增加到4，和從1.1增加到32 (圖9)。因此，在回收率、雜質(zhì)去除和有益濃縮系數(shù)(20)之間的良好妥協(xié)，使得通過此方法生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成為轉(zhuǎn)導(dǎo)精致的細胞(如原代細胞或干細胞)的良好工具，即使當(dāng)需要高工作M.0.1.時也是如此。
[0122]對應(yīng)于獲得批次D的方法D:此獲得批次D的方法包括用于獲得通過濃縮步驟增強的批次C的方法的步驟，然后任選地通過使用即用型離心單元的超濾、benzonase處理和基于層析的純化進行富集。此類批次通常展示一種或多種下列特征:(i)最終滴度在IxIO7-1xIO8 TU/ml之間；(ii)相比批次A，(根據(jù)本發(fā)明的純化的病毒DNA載體)方法回收率在約12% ； (iii)濃縮系數(shù)為約7 (5至10之間)(表2) ; (iv)相比批次A，DNA去除為約98.8%的初始污染物(從80-99%) ； (V)相比批次A，蛋白去除為約99.9%的初始污染物(從80-99%)(圖6);和(vi)平均最終PP/TU比例在100和400之間(圖8)。
[0123]該方法D的優(yōu)點是達到對于體內(nèi)注射的要求，具有至少90%和至多達99.9%的初始污染物的蛋白去除，以及至少90%和至多達99.9% 98.7%的初始污染物的DNA去除(圖6)。IEX(離子交換)層析步驟允許生物活性和非活性顆粒的分離，以達到迄今所述的少于300的最低PP/TU比例(參見，例如圖8)。此高純化導(dǎo)向的方法允許將蛋白的純化水平從20-40提高到120-160 (參見例如圖9)。此方法顯示本文所述所有方法的最高比活性，意味著使用此純化方法，雜質(zhì)的去除是最有效的(參見，例如圖7)。根據(jù)方法D生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體從而適用于體內(nèi)注射到哺乳動物或動物中。
[0124]使用即用型單元的額外的濃縮(如方法B中所用)可以添加到方法C和D的末端，以增加最終滴度。但是，這種額外的濃縮步驟可以導(dǎo)致PP/TU比例的增加，因為即用型離心單元對于載體是破壞性的，這是由于因所述單元的化學(xué)性質(zhì)而導(dǎo)致的對支持物的非特異性吸附。
[0125]如本文所述，已經(jīng)根據(jù)用于獲得批次A至D的方法生產(chǎn)了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。已對批次制品進行了比較，以評價轉(zhuǎn)導(dǎo)對細胞毒性、生存力和增殖的后果。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將用于永生化細胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)或用于動物體內(nèi)注射，這樣的比較是重要的(表2和圖6-9)。
[0126]用顯示不同的濃度和純度水平的載體的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。即使慢病毒載體是遞送基因或shRNA進入動物或哺乳動物細胞的最有效的手段，有幾個問題仍然是使用這樣的載體的障礙，包括基因遞送的再現(xiàn)性、細胞生存力或毒性、劑量效應(yīng)監(jiān)測或在永生化細胞、原代細胞和干細胞中獲得的結(jié)果之間的同質(zhì)性。事實上，如在圖3中所述，基因轉(zhuǎn)移效率需要特定的開發(fā)，以確定關(guān)于實驗?zāi)繕?biāo)和靶細胞適用的M.0.1.。一些細胞(U937，原代淋巴細胞，造血干細胞，THP1)比需要其它細胞(293T, DA0Y,HCT116)更高的M.0.1.。很常見地，原代細胞比永生化細胞的容許性低，但是一些建成的細胞如THP1、Jurkat或U937的確需要高于50的M.0.1.。由于慢病毒載體的誘導(dǎo)的毒性，這些M.0.1.被視為難以應(yīng)用(Yamada等，2003)。用非整合型慢病毒載體(NILV)的轉(zhuǎn)導(dǎo)強調(diào)了此問題，這是由于它們需要高M.0.1.以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞的事實，如圖10所示。事實上，NILV載體需要40的M.0.1.以轉(zhuǎn)導(dǎo)63%的靶細胞，而ILV以10的M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)100%的靶細胞。此外，用NILV，必須使用150的M.0.1.以達到相比于在M.0.1.5的ILV相同水平的表達。人或動物造血干細胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)也需要高M.0.1.以將它們重新植入人或動物，用于基因治療或動物模型開發(fā)。原代細胞也需要在高M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在適宜的水平表達靶基因以逆轉(zhuǎn)表型或疾病。本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)在靶細胞中的表達水平和所獲得的細胞生存力之間的最佳平衡。如本文所證明，降低濃縮的載體上清液中的蛋白和DNA含量是保護細胞抵抗細胞阻滯和死亡的方式。這對于用ILV和NILV向iPS的細胞重編程也是重要的考慮，以避免重編程過程中污染物的干擾。
[0127]本發(fā)明提供了對這些問題的解決方案，并帶來了關(guān)于此明顯毒性的補充信息。已使用或不使用額外純化步驟生產(chǎn)了具有不同濃縮級別的慢病毒載體。已根據(jù)所使用的不同方法實現(xiàn)了載體濃縮，所述方法基于通常使用的技術(shù)(如圖4A中闡釋，基于超離心或使用中心單元的離心)或切向流過濾(如圖5A中的闡釋)。超離心或在中心單元中的離心濃縮了慢病毒載體，并且還濃縮了來自于產(chǎn)生病毒的細胞的培養(yǎng)基的細胞碎片、膜片段和蛋白。下面所述數(shù)據(jù)顯示濃縮的批次 B和C均導(dǎo)致相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且誘導(dǎo)非常不同的細胞表型后果。
[0128]粗載體組合物。在對293T細胞進行三重-轉(zhuǎn)染以在沒有血清的情況下生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體時，這些細胞停止生長并可以在上清液中分泌脅迫蛋白和毒性成分。圖1lA顯示產(chǎn)生病毒的細胞在三重-轉(zhuǎn)染后展示高LDH生產(chǎn)率。此結(jié)果強調(diào)，在載體生產(chǎn)期間，在培養(yǎng)基中存在由生產(chǎn)細胞分泌的毒性蛋白。當(dāng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞時，尤其在精致的原代細胞中，在粗制備物中和在濃縮的批次中的這種不希望的材料可誘導(dǎo)細胞擾動，并且可以在體內(nèi)施用后導(dǎo)致在實驗動物模型中的免疫原性反應(yīng)。如表3所示，此粗載體組合物清楚地受到轉(zhuǎn)染后載體收獲的數(shù)目和時間的影響。在24小時的間隔收獲載體上清液而不考慮載體半衰期時，載體收獲物的LDH效應(yīng)增大。當(dāng)例如，如表3所述，以12-16小時的間隔重復(fù)4次收獲時，LDH效應(yīng)低于30%，但當(dāng)載體收獲以24小時的間隔重復(fù)時，分別達到80%和48%。因此，通過多個收集步驟(包括3-6次收集之間)以特定間隔進行的粗上清液的回收，提供了用于獲得純化的基于RNA的病毒載體組合物(即回收的粗上清液)的方法。選擇在轉(zhuǎn)染后特定時間的多個收集步驟，這取決于載體顆粒在37°C的半衰期，其是約8小時，取決于生產(chǎn)細胞類型和細胞培養(yǎng)基(Le Doux等，1999)。因此，除了在載體生產(chǎn)過程中無血清之外，該基于在載體生產(chǎn)過程的收獲的時間和次數(shù)的第二參數(shù)允許生產(chǎn)高質(zhì)量的粗起始材料，其最大限度地減少蛋白濃縮和細胞毒性。在此，證明圖5A中總結(jié)的步驟的組合能夠減少靶細胞中的不期望的效果。此方法包括無血清培養(yǎng)基、順序收獲和超濾。
[0129]純度對細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。研究了在轉(zhuǎn)導(dǎo)后幾天，對原代細胞、包皮細胞(ATCC-CRL-2097)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。生產(chǎn)了上面描述的稱為批次A、B、C和D的四個批次，并且用于以分別為40和150的中等和高M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞，以評價載體本身和載體環(huán)境的漸變效果。首先，檢查細胞以確定是否它們可以表達報告基因GFP并且將在轉(zhuǎn)導(dǎo)后5和11天的使用不同批次的GFP表達的結(jié)果分別展示在圖12A和12B中。這些數(shù)據(jù)顯示，使用所有批次的所有轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞均以高水平表達GFP報告基因。然后，GFP表達水平看起來獨立于純化級別。一旦載體進入活的靶細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不受限制并且轉(zhuǎn)基因表達是有效的。平行地，這些圖片顯示在所有孔中的細胞數(shù)目非常不同，即使在轉(zhuǎn)導(dǎo)前兩天鋪板相同數(shù)目的細胞。
[0130]純度對細胞增殖和生存力的影響。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后6和11天,觀察使用所有載體類型轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。在每種情況下，以M.0.1.40和150對包皮細胞進行相同的實驗，以評價所獲得的細胞質(zhì)量。如圖13中所示，可見載體純度對細胞生存力的影響，因為用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的數(shù)目表示僅6%的在相同條件下用批次C轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的數(shù)目。這一結(jié)果通過使用比色MTT測定而得到證實，所述比色MTT測定評估轉(zhuǎn)導(dǎo)后靶細胞的生存力和增殖率。圖14A顯示使用批次B的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了與所用M.0.1.成正比的生長遲緩。在M.0.1.40和150分別觀察到40%和70%的生長阻滯。此生長阻滯可以解釋之前觀察的用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)后細胞的低數(shù)量。事實上，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后細胞培養(yǎng)11天后包括一次傳代，結(jié)果顯示細胞的數(shù)目很大程度上受到在M.0.1.40和150的批次B的影響，但在M.0.1.40，當(dāng)用批次C或D轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞時，細胞數(shù)量是穩(wěn)定的。在更高的M.0.1.，細胞數(shù)量受到的影響程度小于用B批次的情況。在批次C和D之間沒有觀察到顯著的差異，表明對于體外實驗，在超濾后達到的純化水平足以包含細胞免于細胞生長阻滯。在圖14B和14C中，測定了使用批次A、B、C和D轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的增殖率，并 且證實批次C保護細胞免于先前觀察到的生長阻滯。用批次B-S的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)顯示與在使用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞時獲得的相比，放大的細胞停滯，強調(diào)無血清和超濾的組合是關(guān)鍵的。
[0131]純度對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響。為了根據(jù)純度水平并且獨立于任何轉(zhuǎn)基因評價載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，使用rLV-EFl (無cDNA)批次B和C以M.0.1.40和150轉(zhuǎn)導(dǎo)包皮成纖維細胞，所述批次B和C衍生自相同的粗收獲物，并且其特征總結(jié)在圖15B中。如圖15A所示，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后觀察細胞48小時。相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，以M.0.1.40用批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞可見輕微的生長遲緩，但以相同M.0.1.的批次C轉(zhuǎn)導(dǎo)后沒有明顯的生長差異。在M.0.1.150，相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，使用批次B可見強的增殖停滯，而使用批次C僅觀察到可觀察的中度生長遲緩。為了探討在轉(zhuǎn)錄水平的基本變化，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后54小時收集這些細胞。提取RNA并用于進行允許幾乎所有人轉(zhuǎn)錄物的定量的Agilent全人基因組微陣列。將來自用rLV-EFl批次B和C以M.0.1.40和150轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的RNA水平與來自未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的RNA進行比較。統(tǒng)計學(xué)分析后，對于每次比較，保留上調(diào)或下調(diào)1.5倍或更多的探針。通過使這些數(shù)據(jù)交叉，可對于每個M.0.1.鑒定出批次B相對未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的差異表達的一組基因，所述基因?qū)τ谂蜟相對未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞未被影響。這兩組基因在散點圖和輪廓圖上表示，對于M.0.1.150在圖16A和B中，且對于Μ.0.1.40在圖16C和D中。如所證明的，在批次B轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中相對未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的所選基因的轉(zhuǎn)錄水平變化在Μ.0.1.150比在Μ.0.1.40 (其中變化是輕微的)更明顯。這些數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)使用不同純度水平的載體時，對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)錄組的不同影響。
[0132]血清對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響。為了評價在有血清生產(chǎn)后載體培養(yǎng)基組合物的影響在10%血清的存在下生產(chǎn)rLV-EFl載體(無cDNA)，并且使用方法B濃縮，獲得批次B-S，其特征總結(jié)在圖17B中。使用這個批次以M.0.1.40和M.0.1.150轉(zhuǎn)導(dǎo)包皮細胞。如圖17A所示，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后觀察細胞48小時。批次B-S轉(zhuǎn)導(dǎo)后，相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，可見生長阻滯。此生長阻滯在更高的M.0.1.相比M.0.1.40更強。顯著地，在批次B-S轉(zhuǎn)導(dǎo)后可以觀察到聚集體，并且其體積隨M.0.1.增加。這些細胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后54小時收集用于RNA提取和微陣列雜交。令人驚訝地，注意到，在胰蛋白酶處理過程中，用批次B-S轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞比用批次B或C轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞或未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞更難以剝離。使用Agilent全人基因組微陣列對來自用批次B-S以中等或更高M.0.1.轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的RNA水平與來自未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的RNA進行比較。統(tǒng)計學(xué)分析后，對于每次比較，保留上調(diào)或下調(diào)1.5倍或更多的探針。為了鑒定與使用血清生產(chǎn)的載體相關(guān)的探針，本發(fā)明人選擇了使用批次B-S (以M.0.1.40和150)相對未轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件差異表達，且使用批次B和C (以M.0.1.40和150)未被影響的探針。相應(yīng)組的基因顯示在如圖18中所示的測線圖中。這些數(shù)據(jù)證實了使用有血清生產(chǎn)的批次的轉(zhuǎn)導(dǎo)的存在對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)錄組的影響對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)錄組的影響。
[0133]純度對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響。為了根據(jù)純度水平并且獨立于任何轉(zhuǎn)基因評價載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，使用無cDNA的病毒載體(rLV-EFl)批次B和C以M.0.1.40和150轉(zhuǎn)導(dǎo)包皮成纖維細胞，所述批次B和C衍生自相同粗收獲物。如圖15A所示，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后觀察細胞48小時。以M.0.1.40用批次B可見輕微的生長遲緩，但以相同M.0.1.使用批次C沒有生長差異。在M.0.1.150，用批次B可見強的增殖停滯，而本發(fā)明人對批次C僅觀察到中度生長遲緩。為了探討在轉(zhuǎn)錄水平的基本變化，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后54小時收集這些細胞。提取RNA并用于進行允許幾乎所有人轉(zhuǎn)錄物的定量的Agilent全人基因組微陣列。將來自用無cDNA的病毒載體(rLV-EFl)批次B和C以Μ.0.1.150轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的RNA水平與來自非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的RNA進行比較。統(tǒng)計學(xué)分析后，對于每次比較，保留上調(diào)`或下調(diào)1.5倍或更多的探針。如圖16A-16D (散點圖Μ.0.1.40和Μ.0.1.150)，通過使這些數(shù)據(jù)交叉，對于每個Μ.0.1.可以鑒定用批次B —組差異表達的基因，所述基因?qū)τ谟门蜟未被影響。
[0134]目前，復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)如病毒和載體的下游處理是本領(lǐng)域中的主要挑戰(zhàn)之一，特別是當(dāng)對抗性細胞或使用非整合型慢病毒載體需要高Μ.0.1.時。在這些情況下，對于給定數(shù)量的靶細胞，達到高Μ.0.1.只有兩種可能:提高添加到靶細胞的粗上清液的體積，如果可能的話；或者將所述載體上清液濃縮。很多時候，科學(xué)家避免使用高Μ.0.1.，因為他們擔(dān)心整合到靶基因組DNA中的載體拷貝數(shù)太多。取決于靶細胞，生產(chǎn)細胞提供的污染物的作用其實不是可預(yù)測的。通常，相比存在于包含載體的培養(yǎng)基中的污染物，使用者更多地將所觀察到的毒性歸于載體本身。
[0135]研究了獲得高質(zhì)量逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體的步驟組合的應(yīng)用性。對合適的操作條件進行了初步測試和優(yōu)化，以載體回收和，以及，在對靶細胞的作用方面的產(chǎn)品品質(zhì)作為目標(biāo)。如圖11所示，無血清載體生產(chǎn)顯示相同水平的粗生產(chǎn)而不破壞滴度，但導(dǎo)致生產(chǎn)細胞中的一些毒性。超濾也驗證為用于逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的濃縮和部分純化的良好的方法。如所示，不僅對于粗載體上清液濃縮，而且對于在超濾或陰離子交換層析步驟之后的純化載體的濃縮，在中心單元上的超濾或超離心都是無效的方法。事實上，為了增加載體滴度，將批次C和D進行在中心單元上的離心并且觀察到PP/TU的比例增加，顯示其可能由于載體對膜的非特異性吸附而影響逆轉(zhuǎn)錄病毒感染性。此處選擇的和描述為方法C的超濾方法是基于使用中空纖維使用超濾技術(shù)對粗收獲物的濃縮。此技術(shù)的操作模式通過切向流過濾，使用泵壓用于壓力設(shè)置。該技術(shù)允許監(jiān)測和控制壓力，這是對于維持載體完整性和生存力的重點。相比對于批次B使用的膜，此技術(shù)中使用的膜的類型不增加非特異性吸附。出人意料的是，確定了工作壓力、溫度和流速是成功的超濾方法的關(guān)鍵點。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述流速包括在400和600ml/min之間并且TMP (跨膜壓力)在6和9psi之間。
[0136]因此，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞的慢病毒載體的濃縮和純化包括規(guī)模放大和安全性之外的關(guān)鍵參數(shù):細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后的生存力和細胞狀態(tài)。載體上清液必須被認(rèn)為是載體本身和細胞污染物例如宿主細胞蛋白和DNA (其可以誘導(dǎo)對靶細胞的破壞作用)的混合。本文包括的是限定能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞而不影響細胞生存力和增殖的載體的其它參數(shù):
(i)對于粗批次，在300和900之間的平均PP/TU比例。此比例在濃縮步驟過程中的增加是對載體破壞的指標(biāo)，并且預(yù)示存在可以干擾轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶細胞生存力的載體碎片；
(ii)相比批次A，在濃縮后，DNA去除為約82%的初始污染物，并且總是在70%和99%之間；和
(iii)相比在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)的批次A，在濃縮后，蛋白去除多達90%的初始污染物。
[0137]基于血清在生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)基中的使用(其誘導(dǎo)不同于方法A的產(chǎn)品組成)，鑒定為顯示臨床應(yīng)用所需特征的載體的產(chǎn)品(Merten等，2010)不同于產(chǎn)品A、C和D。事實上，蛋白組成和比例PP /TU在它們的條件下在濃縮前分別比在批次A中高25和5倍。兩個參數(shù)均對下游濃縮/純化方法具有影響，因為在它們的條件下，在濃縮后，最終蛋白濃度比在本發(fā)明的批次C和D中高150倍。其它專用于臨床基因治療試驗的批次的分析在文獻中已經(jīng)描述，但是沒有在PP/TU和污染物含量及其在生存力和增殖方面對靶細胞的影響之間建立聯(lián)系。
[0138]批次C和D的產(chǎn)品能夠在100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中達到高表達效率，并在中等M.0.1.具有低于30%的毒性，且在高M.0.1.具有低于40%的毒性，但在相同的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)品B導(dǎo)致比批次C低2倍的細胞增殖。(圖13和14)。用批次A對細胞增殖獲得的結(jié)果相比用批次B獲得的那些結(jié)果是等效的，可能由于用粗批次達到這些M.0.1.需要的體積大。
[0139]蛋白和DNA去除在本文中分別通過DNA和蛋白比活性表示，其理想地高于IO7 TU/I^g DNA和IO9 TU/mg蛋白，以防止靶細胞生存力或增殖的喪失。因此，應(yīng)當(dāng)關(guān)注宿主細胞蛋白去除。例如，對應(yīng)批次B的獲得的方法B允許僅56%的宿主蛋白的去除，而方法C去除98%的初始蛋白。因此，即使宿主細胞蛋白似乎經(jīng)過所有的膜，但可由于在膜上的非特異性吸附和隨后的膜結(jié)垢而導(dǎo)致差的蛋白去除。然后，在具有載體的回收級分中發(fā)現(xiàn)這些污染蛋白。
[0140]本文所述結(jié)果可以解釋科學(xué)家不愿使用高M.0.1.和通常的載體批次B，由于經(jīng)常觀察到細胞毒性，尤其當(dāng)使用原代或干細胞時。但是，有時低或中等M.0.1.不足以導(dǎo)致高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，如在圖3A和3B中對造血干細胞所證實的。轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的早期步驟可在一些靶細胞受到限制，導(dǎo)致低整合的載體拷貝數(shù)并且從而需要高M.0.1.和調(diào)整的批次C或D。
[0141]此毒性在細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后消除了靶細胞亞群或抑制細胞分化。本發(fā)明顯示使用濃縮的并且純化的載體可以繞開這些關(guān)鍵缺點。顯然，超速離心和在即用型單元上的離心(批次B)是不適宜的，因為它們誘導(dǎo)對靶細胞的破壞作用。使用基于超濾的方法(批次C)需要初步的技術(shù)開發(fā)，但是允許適用于細胞完整性和增殖的高質(zhì)量批次。并且，此技術(shù)容易升級以用于大規(guī)模生產(chǎn)。如本文所證明，來自培養(yǎng)基的污染物的確對原代精致的細胞產(chǎn)生影響。當(dāng)批次C載體用在功能性測定中用于基因靶驗證或用于藥物篩選時，對于永生化細胞系也可以考慮此方面。在生理或代謝方面，所選擇的對濃縮的但沒有充分純化的載體批次具有抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞不代表正常細胞群體。另一個真正產(chǎn)生的問題在于，在遺傳修飾的永生化細胞和原代模型中觀察到的缺乏基因功能或藥物作用的重現(xiàn)性，即使是在使用相同的慢病毒工具進行轉(zhuǎn)導(dǎo)時也是如此。
[0142]因此，本發(fā)明的產(chǎn)品通過以轉(zhuǎn)導(dǎo)單位表示的載體和物理顆粒之間的比例和培養(yǎng)基組成的重要性得到驗證，其限制了對原代和干細胞增殖和生存力的影響，或?qū)@些細胞的代謝的影響，從而允許基因功能和細胞分化的可重現(xiàn)的研究。[0143]根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果顯示了載體及其培養(yǎng)基在用于基因治療、體外和體內(nèi)基因靶驗證、藥物篩選或治療性診斷(theragnostic)的靶細胞中，以及在考慮細胞完整性以研究基因或分子效應(yīng)或其組合的各個領(lǐng)域中的關(guān)鍵作用。
【權(quán)利要求】
1.純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比如存在于無血清細胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2%的初始蛋白污染物和小于70%至多達90%，優(yōu)選小于30%的初始DNA污染物，所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞而不影響細胞生存力。
2.權(quán)利要求1的基于RNA的病毒載體組合物，其中所述基于粗RNA的病毒載體是其中物理顆粒/轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(PP/TU)包括在100:1至多達900:1之間，優(yōu)選100:1至多達600:1之間，更優(yōu)選100:1至多達400:1之間的病毒載體。
3.權(quán)利要求1或2的基于RNA的病毒載體，其中所述病毒載體對細胞增殖、生存力和/或細胞的能力，例如干細胞分化或例如原代細胞重編程為多能細胞的能力，具有很少至沒有影響。
4.包含在細菌宿主中的病毒DNA構(gòu)建體，所述細菌宿主以保藏號CNCM1-4487或CNCM1-4488或CNCM 1-4489保藏在CNCM保藏中心。
5.權(quán)利要求1至3中任一項的基于RNA的病毒載體的用途，其用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核靶細胞以將目的核酸(轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)移到所述細胞中。
6.用于制備修飾的真核細胞的方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的純化的基于RNA的病毒載體組合物轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細胞而不影響它們的生存力。
7.用于生產(chǎn)基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的方法，其包括: (i)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞，所述細胞經(jīng)過修飾以補充在病毒載體所基于的RNA病毒基因組中的缺失，并且在合適的條件下培養(yǎng)所述生產(chǎn)細胞，以允許病毒載體顆粒的生產(chǎn)，其中所述轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中進行； (?)收集包含所述基于RNA的病毒載體顆粒的上清液。
8.權(quán)利要求7的方法，其不包括丁酸鈉誘導(dǎo)的步驟。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述上清液收集通過以特定時間間隔的包括在3個和6個之間的多個步驟進行。
10.權(quán)利要求7-9中任一項的方法，其中在所述上清液收集之后，通過離心澄清。
11.權(quán)利要求7-10中任一項的方法，其進一步包括切向超濾和滲濾的步驟，所述超濾優(yōu)選在聚砜中空纖維濾芯上操作。
12.權(quán)利要求7-11中任一項的方法，其進一步包括離子交換層析的步驟。
13.可通過根據(jù)權(quán)利要求7-12中任一項的方法獲得的純化的基于RNA的病毒載體組合物。
14.權(quán)利要求13的基于RNA的病毒載體組合物，其中去除的DNA污染物占70至99%之間，優(yōu)選多達71%的存在于初始無血清培養(yǎng)基的這種污染物，并且去除的細胞蛋白污染物占50至99.9%之間， 優(yōu)選多達56%的包含在初始無血清培養(yǎng)基中的細胞蛋白，并且其中所述PP/TU比例包括100:1至900:1之間，優(yōu)選100:1和600:1之間。
15.制備遺傳修飾的真核細胞的方法，其包括使真核細胞接觸權(quán)利要求1-3，13或14中任一項的基于RNA的病毒載體組合物。
16.修飾的真核細胞，其中所述細胞通過根據(jù)權(quán)利要求1-3，13或14中任一項的基于純化的RNA的病毒載體組合物轉(zhuǎn)導(dǎo)而不影響其生存力。
【文檔編號】C12N7/02GK103842500SQ201280047202
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月27日
【發(fā)明者】P.布耶, H.韋尼奧, R.加永, Y.莫阿爾 申請人:韋克塔里斯公司