用于原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及用途。在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物在上皮來源的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)中的用途中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物包含角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑，并且所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中不包含血清。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物能夠成功地對(duì)上皮來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，大大地提高了上皮來源的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率，并且能夠抑制癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長，例如，應(yīng)用本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物能在10天內(nèi)使上皮來源的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)成功，培養(yǎng)的成功率大部分在80％以上；并基本上能穩(wěn)定傳代至8代以上，可成功建系。
【專利說明】用于原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種用于原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及用途、原代培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)及建系最常用的技術(shù)是應(yīng)用添加了 10%的胎牛血清(可簡稱FCS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。但是目前應(yīng)用該腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞，其成功率非常低。例如，應(yīng)用10% FCS+RPMI1640培養(yǎng)原代肺癌和前列腺癌細(xì)胞，其成功率均低于10%，能傳代建系的成功率就更低。因此，目前腫瘤研究中多應(yīng)用已經(jīng)建成的細(xì)胞系。由于已建成的細(xì)胞系多經(jīng)過了長期的體外培養(yǎng)和傳代，它們 已喪失了很多腫瘤細(xì)胞原有的生物學(xué)特性，這極大地限制了腫瘤的生物學(xué)特性的研究。另外，腫瘤免疫治療現(xiàn)在進(jìn)展迅速，而自體腫瘤細(xì)胞疫苗無疑是最好的腫瘤抗原，但由于腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的困難性，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。
[0003]最近發(fā)展了應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，使腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率有所提高。但是應(yīng)用無血清或低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代癌細(xì)胞，其成功率仍十分低下，多數(shù)不超過20%，且培養(yǎng)時(shí)間多需在I月以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及用途、原代培養(yǎng)方法。
[0005]具體而言，本發(fā)明提供:
[0006](I) 一種細(xì)胞培養(yǎng)組合物在上皮來源的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)中的用途，其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物包含角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑，并且所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中不包含血清。
[0007](2)根據(jù)(I)所述的用途，其中，所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為選自干系@角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基n( stemline? Keratinocyte MediumI I)、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte-SFM)以及成分確定的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一種。
[0008](3)根據(jù)⑴所述的用途，其中，所述的無血清添加劑為選自B27添加劑(B27supplement)、不包含維生素 A 的 B27 添加劑(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加劑(N-2supplement)中的一種；優(yōu)選為B27添加劑。
[0009](4)根據(jù)(I)所述的用途，其中，以所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物的總體積計(jì)，當(dāng)所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以I倍稀釋比例使用時(shí)，所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑以
0.2-1倍的稀釋比例使用。
[0010](5)根據(jù)⑴所述的用途，其中，所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞選自肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞及食管癌細(xì)胞中的一種。[0011](6)根據(jù)(1)-(5)中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中還包含:表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β中的一種或多種；
[0012]其中，如果存在的話，所述的表皮細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為5_50ng/ml ;所述的成纖維細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為2.5-50ng/ml ;所述的轉(zhuǎn)化生長因子β的含量優(yōu)選為2-10ng/ml。
[0013](7) 一種用于原代培養(yǎng)上皮來源的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其包含:角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑，并且所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中不包含血
清。
[0014](8)根據(jù)(7)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為選自干系@角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基n( stemline? KeratinocyteMedium II)、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte-SFM)以及成分確定的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一種。
[0015](9)根據(jù)(J)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的無血清添加劑為選自B27添加劑(B27supplement)、不包含維生素 A 的 B27 添加劑(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加劑(N-2supplement)中的一種；優(yōu)選為B27添加劑。
[0016](10)根據(jù)(7)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，以所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物的總體積計(jì)，當(dāng)所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以I倍稀釋比例使用時(shí)，所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑以0.2-1倍的稀釋比例使用。
[0017](11)根據(jù)(7)-(10)中任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)基還包含:表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β中的一種或多種；
[0018]其中，如果存在的話，所述的表皮細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為5_50ng/ml ;所述的成纖維細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為2.5-50ng/ml ;所述的轉(zhuǎn)化生長因子β的含量優(yōu)選為2-10ng/ml。
[0019](12) 一種上皮來源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其包括:使用根據(jù)(7)-(11)中任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物對(duì)所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。
[0020](13)根據(jù)(12)所述的原代培養(yǎng)方法，其中，所述的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0021]I)在體外用膠原酶對(duì)腫瘤組織進(jìn)行消化，從而得到單個(gè)腫瘤細(xì)胞；以及
[0022]2)用所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物對(duì)步驟I)得到的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到腫瘤細(xì)胞系。
[0023](14)根據(jù)(12)或(13)所述的原代培養(yǎng)方法，其中，所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞選自肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞或食管癌細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物及上皮來源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0025]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物能夠成功地對(duì)上皮來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),特別是進(jìn)行原代培養(yǎng)，并且大大地提高了上皮來源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)成功率，從而相應(yīng)地克服了現(xiàn)有技術(shù)中癌細(xì)胞難以進(jìn)行原代培養(yǎng)或培養(yǎng)成功率極低的缺陷，因此對(duì)腫瘤研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)用價(jià)值。例如，應(yīng)用本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物可使(例如)肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌的原代腫瘤細(xì)胞在10天內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增成功，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的成功率大部分在80%以上，最高可達(dá)100% ;并能穩(wěn)定傳代，成功建系。[0026]此外，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物還能夠抑制癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長，從而選擇性地培養(yǎng)癌組織中的腫瘤細(xì)胞。因此，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)組合物使原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞純度非常高，解決了現(xiàn)有的原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞中常常污染有大量間質(zhì)細(xì)胞的問題。
[0027]本發(fā)明的上皮來源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，能在10天內(nèi)使上皮來源的腫瘤細(xì)胞(包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌)原代培養(yǎng)成功，腫瘤細(xì)胞培育的成功率大部分在80 %以上，最高可達(dá)100 % ;并基本上能穩(wěn)定傳代至8代以上，可成功建系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為試驗(yàn)例I中原代培養(yǎng)的4種類型的肺癌細(xì)胞的光鏡圖(200X，即200倍)，其使用的是實(shí)施例1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的；其中，A為肺鱗癌；B為小細(xì)胞肺癌；C為大細(xì)胞肺癌；D為肺腺癌；
[0029]圖2為試驗(yàn)例I中原代培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞的光鏡圖(200X)，其使用的是實(shí)施例1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的；
[0030]圖3為試驗(yàn)例I中原代培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的光鏡圖(200X)，其使用的是實(shí)施例1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的；
[0031]圖4為試驗(yàn)例I中原代培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞的光鏡圖(400X)，其使用的是實(shí)施例1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的；
[0032]圖5為試驗(yàn)例2中原代培養(yǎng)的肺鱗癌、肺腺癌及大細(xì)胞肺癌接種于小鼠皮下的示意圖；其中A為大細(xì) 胞肺癌接種于小鼠皮下的示意圖；B為肺腺癌接種于小鼠皮下的示意圖；C為肺鱗癌接種于小鼠皮下的示意圖；
[0033]圖6為試驗(yàn)例3中肺腺癌細(xì)胞經(jīng)免疫組化檢測Ber-印4表達(dá)的光鏡圖(200 X)，其使用的是實(shí)施例1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下通過【具體實(shí)施方式】的描述并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0035]在本文中，術(shù)語“上皮來源的腫瘤細(xì)胞”通常是指由上皮細(xì)胞演化而來的腫瘤細(xì)胞，如為良性腫瘤細(xì)胞通常稱為瘤，如為惡性腫瘤細(xì)胞通常稱為癌。本文所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞主要來源于哺乳動(dòng)物。
[0036]在本文中，術(shù)語“角質(zhì)細(xì)胞”也稱為角化細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞，英文名稱為:Keratinocyte，是指細(xì)胞內(nèi)含有角蛋白的細(xì)胞，是上皮細(xì)胞的一種。所有的哺乳動(dòng)物都含有角蛋白。例如，角質(zhì)細(xì)胞所形成的天然高分子纖苧是頭發(fā)的主要成分。
[0037]在本文中，術(shù)語“血清”的英文名稱為Serum，指的是血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。血清的組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問題。主要如下:第一，血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來許多困難；第二，血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；第三，不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。[0038]在本文中，術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”的英文名稱為:Serum FreeMedium(也可簡稱為SFM)，無血清培養(yǎng)基是無菌的液體培養(yǎng)基，并且不含血清。通常包含必需和非必需氨基酸、有機(jī)和無機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)等。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應(yīng)器剪切力，提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，作為脂類和其他生長因子的載體等。目前無血清培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物和無脊動(dòng)物細(xì)胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。隨著無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，目前市場上各主要生物技術(shù)公司均推出了用于培養(yǎng)多種類型的細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的商業(yè)化產(chǎn)品，因此目前現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的用于培養(yǎng)各種不同類型的細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基主要來源于商購渠道。但是本發(fā)明不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，當(dāng)體外培養(yǎng)某一特定類型的細(xì)胞時(shí)，也可采用根據(jù)現(xiàn)有科技文獻(xiàn)、專利文獻(xiàn)或其它資料公開的各種常用的無血清培養(yǎng)基配方，或自行配制的與商購渠道獲得的無血清培養(yǎng)基的主要組分相同或相似的無血清培養(yǎng)基。
[0039]在本文中，術(shù)語“角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基”(或稱為培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基)指的是一種專門為培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞用的無血清培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)人或動(dòng)物的正常角質(zhì)細(xì)胞。角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基可通過商購?fù)緩将@得，例如，可得自美國Invitrogen公司(現(xiàn)為Life Technology子公司)、美國Combo公司、美國Gibco公司或者上海艾研生物技術(shù)有限公司等，但是本發(fā)明不限于此；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，當(dāng)體外培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞時(shí)，也可采用根據(jù)現(xiàn)有科技文獻(xiàn)、專利文獻(xiàn)或其它資料公開的各種常用的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基配方，或自行配制的與商購渠道獲得的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的主要組分相同或相似的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。例如，也可使用現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中公開的各種常用的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。例如，科技文獻(xiàn)“Pittelkow, M.R.and Scott,R.E.NewTechniques for the Cultureof Human Skin Keratinocytes and In VitroPerspectives on Their Usefor Grafting of Patients with Extensive Burns.MayoClinic Proceedings.61:771-777(1986).”中公開的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，此外，本領(lǐng)域人員所公知的是，還可在常用的MCDB153培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過添加氨基乙醇、磷酸乙醇胺、碘甲腺氨酸鈉并降低鈣離子濃度等措施自行配制角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
[0040]在本文中，術(shù)語“神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑”(或稱為培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的無血清添加劑)指的是一類專門為使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞過程中需添加的添加劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的是，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑通?？砂?但不限于):B27添加劑、N-2添加劑等。隨著無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，目前市場上各主要生物技術(shù)公司也推出了神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑的商業(yè)化產(chǎn)品，因此目前現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑主要來源于商購渠道。例如，可得自美國Invitrogen公司(現(xiàn)為Life Technology子公司)、美國Combo公司、美國Gibco公司等。但是本發(fā)明不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，當(dāng)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，也可采用根據(jù)現(xiàn)有科技文獻(xiàn)、專利文獻(xiàn)或其它資料公開的各種常用的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑配方，或自行配制的與商購渠道獲得的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑的主要組分相同或相似的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑。
[0041]在本文中，術(shù)語“B27添加劑”也稱為B27添加物、B27?添加劑、B27?添加物、神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B-27，或簡稱為B27、B-27、B27?、B-27?等，是一種神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中常用的無血清添加劑，適合應(yīng)用于大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，例如，可用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長和保持其短期或長期活性。此外，B27還可以與Neurobasal?培養(yǎng)基或Neun)basal?-A培養(yǎng)基組合使用，用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)而不需要再添加飼養(yǎng)層細(xì)胞。B27為多種蛋白質(zhì)、激素以及維生素的混合物，可通過商購?fù)緩将@得，例如，可得自(例如)美國Invitrogen公司(現(xiàn)為Life Technology子公司)、美國Gibco公司等。但是本發(fā)明不限于商購?fù)緩将@得的B 27 ;本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，也可以采用根據(jù)現(xiàn)有科技文獻(xiàn)、專利文獻(xiàn)或其它資料公開的與商購渠道獲得的B27的主要組分相同或相似的添加劑配方。例如，包括但不限于以下科技文獻(xiàn):“Svendsen CN, Fawcett JW, Bentlage C,Dunnett SB.1ncreased survival of rat EGF—generated CNSprecursor cells usingB27supplemented medium.Exp Brain Res.1995 ；102 (3):407-14.”。
[0042]在本文中，術(shù)語“N-2添加劑”也稱為N2添加劑，指的是化學(xué)成分確定的，不含血清的，基于Bottenstein’s的NI配方的添加劑。N-2添加劑主要用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。它主要被推薦用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的原代細(xì)胞培養(yǎng)中有絲分裂后期神經(jīng)元的生長和表達(dá)。N-2添加劑可以替代Bottenstein’ s的NI添加劑?，F(xiàn)有技術(shù)中通常用于添加了生長因子bFGF及EGF的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。N-2添加劑可通過商購?fù)緩将@得，例如，可得自(例如)美國Invitrogen公司(現(xiàn)為Life Technology子公司)、美國Gibco公司等。但是本發(fā)明不限于商購?fù)緩将@得的N_2添加劑；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，也可以采用根據(jù)現(xiàn)有科技文獻(xiàn)、專利文獻(xiàn)或其它資料公開的與商購渠道獲得的B27的主要組分相同或相似的添加劑配方。例如在美國Invitrogen公司生產(chǎn)的濃縮倍數(shù)為100的N-2添加劑的配方如表1所示:
[0043]表1
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)組合物在上皮來源的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)中的用途，其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物包含角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑，并且所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中不包含血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為選自干系@角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基n( stemline? Keratinocyte Medium II)、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte-SFM)以及成分確定的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述的無血清添加劑為選自B27添加劑(B27supplement)、不包含維生素 A 的 B27 添加劑(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加劑(N-2supplement)中的一種；優(yōu)選為B27添加劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，以所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物的總體積計(jì)，當(dāng)所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以I倍稀釋比例使用時(shí)，所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑以0.2-1倍的稀釋比例使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞選自肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞及食管癌細(xì)胞中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中還包含:表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β中的一種或多種； 其中，如果存在的話，所述的表皮細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為5-50ng/ml ;所述的成纖維細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為2.5-50ng/ml;所述的轉(zhuǎn)化生長因子β的含量優(yōu)選為2-10ng/ml。
7.一種用于原代培養(yǎng)上皮來源的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組合物,其包含:角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑，并且所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物中不包含血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為選自干系@角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基II ( Stemline? Keratinocyte Medium II)、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte-SFM)以及成分確定的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的無血清添加劑為選自B27添加劑(B27supplement)、不包含維生素 A 的 B27 添加劑(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加劑(N-2supplement)中的一種；優(yōu)選為B27添加劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，以所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物的總體積計(jì)，當(dāng)所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以I倍稀釋比例使用時(shí)，所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)用無血清添加劑以0.2-1倍的稀釋比例使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)基還包含:表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β中的一種或多種； 其中，如果存在的話，所述的表皮細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為5-50ng/ml ;所述的成纖維細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為2.5-50ng/ml;所述的轉(zhuǎn)化生長因子β的含量優(yōu)選為2-10ng/ml。
12.—種上皮來源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其包括:使用根據(jù)權(quán)利要求7-11中任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物對(duì)所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的原代培養(yǎng)方法，其中，所述的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟: 1)在體外用膠原酶對(duì)腫瘤組織進(jìn)行消化，從而得到單個(gè)腫瘤細(xì)胞；以及 2)用所述的細(xì)胞培養(yǎng)組合物對(duì)步驟I)得到的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到腫瘤細(xì)胞系O
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的原代培養(yǎng)方法，其中，所述的上皮來源的腫瘤細(xì)胞選自肺癌細(xì)胞、乳腺 癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞或食管癌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103966167SQ201310045008
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月5日
【發(fā)明者】高全立 申請(qǐng)人:高全立