專利名稱：一種原產(chǎn)酸性蛋白酶的宇佐美曲霉誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原來產(chǎn)酸性蛋白酶的宇佐美曲霉發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的方法，屬微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角蛋白酶是一種可專一地降解角蛋白的蛋白酶類，角蛋白酶可由多種微生物產(chǎn)生，能特異性地降解角蛋白，在飼料、皮革、醫(yī)藥業(yè)、食品等工業(yè)及環(huán)境治理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。角蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶，只有當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)誘導(dǎo)子(角蛋白)時(shí)才會(huì)合成。目前已發(fā)現(xiàn)30余種微生物可分泌角蛋白酶，這些微生物主要來自于真菌、放線菌和細(xì)菌。人們對(duì)分泌角蛋白酶的真菌研究較早，其中多數(shù)為皮膚類真菌，包括須癬毛癬菌(Trichophyton men tagrophytes)lif {Dora tomyces microsporus )、會(huì)工@毛癖菌(Trichophyton rubrum)等；絲狀真菌如擬青霉Fl和Al等。宇佐美曲霉菌株usamii M1223在工業(yè)上用于生產(chǎn)酸性蛋白酶,通過添加誘導(dǎo)劑可發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)角蛋白酶的宇佐美曲霉及其發(fā)酵產(chǎn)酶方法。該菌株分類命名為宇佐美曲霉，現(xiàn)保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC N0.5335，保藏日期為2011年10月12日。

與其他方法相比，用該方法發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的原料更廉價(jià)易得，發(fā)酵方法簡(jiǎn)單。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的角蛋白酶最適溫度為50°C，最適pH為6，酶活可達(dá)到4.4U/mL。通過添加誘導(dǎo)劑產(chǎn)角蛋白酶的宇佐美曲霉菌株usamii M1223發(fā)酵產(chǎn)酶方法如下:
1.斜面種子培養(yǎng):
將宇佐美曲霉接種到察氏斜面培養(yǎng)基上，于25-35°C培養(yǎng)48-240小時(shí)，收集斜面表面的孢子制成甘油管懸液-20°C保存并計(jì)數(shù)。察氏斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g, NaNO3 2g，K2HPO4 lg，MgSO4.7H20 0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.0lg，瓊脂 20g，加水至 IOOOmL ;調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2。2.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將孢子懸液以10(Γ2000個(gè)/mL發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度接種發(fā)酵培養(yǎng)基；將發(fā)酵搖瓶在26-37°C，200rpm條件下培養(yǎng)2-7天。發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液。發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:每IOOOmL培養(yǎng)基中含有羽毛10_20g，玉米粉10_20g，熱豆餅粉10-20g，磷酸氫二鈉2-4g，氯化銨5-10g，氯化鈣5-10g。3.粗酶性質(zhì):(I)以角蛋白為作用底物，該酶最適作用溫度為50°c，最適作用pH為6.0。(2)最適作用條件下,酶活性達(dá)到4.4 U/ml。
有益效果
1.本發(fā)明能夠通過添加誘導(dǎo)底物將原先產(chǎn)酸性蛋白酶的宇佐美曲霉誘導(dǎo)產(chǎn)生角蛋白酶，具有生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單、成本低，無污染的優(yōu)點(diǎn)；
2.擴(kuò)大了角蛋白廢棄物的生物降解范圍，為多種角蛋白廢棄物的降解提供了一種優(yōu)良菌株；
3.本發(fā)明的發(fā)酵過程中利用環(huán)境廢棄物的各種羽毛作為底物，在生產(chǎn)過程中不僅能產(chǎn)生角蛋白酶，還能環(huán)保，降解產(chǎn)物還能作為生物資源再次利用，既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保；
4.本發(fā)明中的菌株所產(chǎn)角蛋白酶活性高且穩(wěn)定，適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶及角蛋白酶的酶活測(cè)定
1.將宇佐美曲霉接種到察氏斜面培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)7天，收集斜面表面的孢子制成甘油管懸液-20°C保存并計(jì)數(shù)。察氏斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g, NaNO3 2g，K2HPO4 lg, MgSO4.7H20 0.5g，KCl
0.5g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.0lg，瓊脂 20g，水 IOOOmL ;調(diào)節(jié) pH 至 7.0。2.將孢子懸液以1000個(gè)/mL發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度接種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:羽毛20g，玉米粉10g，熱豆餅粉20g，磷酸氫二鈉4g，氯化銨IOg,氯化|丐5g。3.將發(fā)酵搖瓶在30°C，200rpm條件下培養(yǎng)7天。4.發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液。5.角蛋白酶測(cè)定方法:取200μ L適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入300μ L的1%角蛋白溶液底物，50°C反應(yīng)30min，加入500 μ L4M TCA溶液終止反應(yīng)，離心取200 μ L上清，依次加入ImL 0.5Μ Na2CO3和200 μ L福林酚試劑使用液后于40°C水浴顯色20min，在680nm處檢測(cè)
吸光值。角蛋白酶酶活定義為:lmL粗酶液在上述條件下，每分鐘降解底物釋放I μ g酪氨酸定義為一個(gè)酶活單位，以U/mL表示。6.酸性蛋白酶酶活的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)工業(yè)用蛋白酶制劑測(cè)定方法(QB1805.3-93)。酸性蛋白酶酶活單位的定義:1 mL液體酶，于40°C、pH3.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I微克酪氨酸，即為I個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。經(jīng)分析原產(chǎn)酸性蛋白酶發(fā)酵液的酸性蛋白酶酶活為5000U/mL，角蛋白酶活力為
1.2 U/mL，使用本方法所用培養(yǎng)基后發(fā)酵液對(duì)酪蛋白底物降解活性為670U/mL，而角蛋白酶活可以達(dá)到4.4U/mL。實(shí)施例2:角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)
在4(T60°C條件下測(cè)定酶活，得到最適作用溫度為50°C，在pH2-lI條件下測(cè)定酶活，得到最適作用pH為6.0。SDS-凝膠電泳分析，角蛋白酶分子量大小為45KD。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)角蛋白酶的宇佐美曲霉突變菌株,分類命名為Α5/76 Τ^777 5.5/7.，現(xiàn)保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC N0.5335，保藏日期為2011年10月12日。
2.一種利用原產(chǎn)酸性蛋白酶的宇佐美曲霉菌株通過誘導(dǎo)產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵方法，其特征在于: (I)將孢子懸液以10(Γ2000個(gè)/mL發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度接種發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:每IOOOmL培養(yǎng)基中含有羽毛10-20g，玉米粉10_20g，熱豆餅粉10_20g，磷酸氫二鈉2-4g，氯化銨5-10g，氯化鈣5-10g ； (2 )將發(fā)酵搖瓶在26-37 °C，200rpm條件下培養(yǎng)2 7天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的角蛋白酶最適溫度為50°C，最適pH為6.0，酶活`可達(dá)到4.4U/mL。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)角蛋白酶的宇佐美曲霉及其發(fā)酵產(chǎn)酶方法。與其他方法相比，用該方法發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的原料更廉價(jià)易得，發(fā)酵方法簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N1/14GK103146587SQ20131009349
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日 公開號(hào)201310093491.發(fā)明者史勁松, 張旦旦, 王月, 李恒, 錢建瑛, 許正宏 申請(qǐng)人:江南大學(xué)