一種具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有天冬氨酸激酶III活性的多肽，天冬氨酸激酶III的第342位異亮氨酸殘基被除了異亮氨酸以外的任意氨基酸殘基取代。過量表達(dá)本發(fā)明的突變型天冬氨酸激酶能夠提高賴氨酸產(chǎn)量。這為優(yōu)化賴氨酸的生物合成提供了更多選擇，有助于構(gòu)建賴氨酸生產(chǎn)菌株或提高賴氨酸產(chǎn)量。
【專利說明】一種具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種具有天冬氨酸激酶活性的 多肽及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸被廣泛用于飼料添加、食品、營養(yǎng)品和藥品。近年來，全球氨基酸年產(chǎn)量達(dá) 到數(shù)百萬噸。其中天冬氨酸家族的氨基酸，如賴氨酸、蘇氨酸，得到廣泛應(yīng)用。天冬氨酸族 氨基酸可以通過微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，使用的微生物主要包括谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌。
[0003] 天冬氨酸家族氨基酸在大腸桿菌內(nèi)的生物合成需要經(jīng)過一系列生化反應(yīng)步驟。其 中至關(guān)重要的一個步驟，天冬氨酸變?yōu)榱姿崽於彼幔怯商於彼峒っ复呋?。?大腸桿菌中，天冬氨酸激酶有三種同工酶：天冬氨酸激酶I、Π 和III。天冬氨酸激酶I 和II是雙功能酶，它們同時具備高絲氨酸脫氫酶活性。天冬氨酸激酶I是由thrA基因 編碼的，其活性受蘇氨酸的抑制，它的表達(dá)受蘇氨酸和異亮氨酸抑制（F.Falcoz-Kelly et al. (1969)，Eur. J. Biochem. 8:146-152)。天冬氨酸激酶II是由metL基因編碼的，它的表達(dá) 受甲硫氨酸抑制（J.C.Patte et al.(1967)，Biochim.Biophys.Acta. 136:245-257)。天冬 氨酸激酶III是由lysC基因編碼的，它的活性和表達(dá)都受到賴氨酸的抑制（Truffa-Bachi et al. (1968)，Eur. J. Biochem. 5:73-80)。
[0004] 野生型的大腸桿菌天冬氨酸激酶III基因序列如SEQ ID NO :2所示。天冬氨酸 激酶III在以發(fā)酵法制備賴氨酸和蘇氨酸的生產(chǎn)中受到廣泛關(guān)注。過量表達(dá)天冬氨酸激酶 III，包括野生型和突變型，對提高賴氨酸產(chǎn)量有很大幫助。例如，US5661012報道了有助于 提高賴氨酸產(chǎn)量的如下幾個氨基酸位點(diǎn)的突變型：318, 323, 325, 345, 347, 349。但尋找更 多、更有效的天冬氨酸激酶仍然是十分重要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了與已公開的突變位點(diǎn)不同的天冬氨酸激酶III的突變位點(diǎn)。發(fā)明人 對大腸桿菌天冬氨酸激酶III (SEQ ID NO :1)的Ile342氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了氨基酸置換，得 到突變型的天冬氨酸激酶III。
[0006] 具體而言，本發(fā)明公開了一種具有天冬氨酸激酶III的活性的多肽，該種多肽包 括氨基酸序列SEQ ID N0 :1，或具有同樣酶活性的該序列的多肽片段或同源多肽，且在相當(dāng) 于SEQ ID N0 :1序列中的Ile342氨基酸位點(diǎn)處有氨基酸置換突變。在保留天冬氨酸激酶 的活性的前提下，上述突變位點(diǎn)處的氨基酸殘基可以用任意天然或非天然氨基酸或氨基酸 類似物替代。
[0007] 因?yàn)橥蛔冃偷奶於彼峒っ敢獞?yīng)用于賴氨酸或蘇氨酸生產(chǎn)，因此突變不能嚴(yán)重降 低天冬氨酸激酶的活性。本發(fā)明中提供的多肽至少部分地保有SEQ ID N0 :1序列所示的天 冬氨酸激酶的活性。
[0008] 用于取代上述位點(diǎn)處原有氨基酸殘基的不局限于某些特定的氨基酸。任意蛋白氨 基酸或非蛋白氨基酸都可以用來取代上述位點(diǎn)處原有的氨基酸殘基。在一些實(shí)施例中，上 述位點(diǎn)的原氨基酸殘基被其他天然的、蛋白氨基酸置換。所提到的其他蛋白氨基酸，是指 在天然多肽分子中發(fā)現(xiàn)的除異亮氨酸（lie)以外的22個氨基酸，即丙氨酸（Ala)，亮氨酸 (Leu)，天冬酰胺（Asn)，賴氨酸（Lys )，天冬氨酸（Asp )，甲硫氨酸（Met)，半胱氨酸（Cys )，苯 丙氨酸（Phe)，谷氨酸（Glu)，蘇氨酸（Thr)，谷氨酰胺（Gln)，色氨酸（Trp)，甘氨酸（Gly)， 纈氨酸（Val)，脯氨酸（Pro)，絲氨酸（Ser)，酪氨酸（Tyr)，精氨酸(Arg)，組氨酸（His)，硒 代半胱氨酸，硒代甲硫氨酸，吡咯賴氨酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，用于置換的氨基酸是 L-氨基酸。
[0009] 在另外一些實(shí)施例中，用于取代突變位點(diǎn)處原有的氨基酸殘基的可以是非蛋白氨 基酸，即不存在于天然多肽中的氨基酸。非蛋白氨基酸包括氨基己二酸，氨基己 二酸，α-氨基丁酸，α-氨基異丁酸，β-丙氨酸，4-氨基丁酸，5-氨基戊酸，6-氨基己酸， 8_氨基辛酸，9-氨基壬酸，10-氨基癸酸，12-氨基十二烷酸，α -氨基辛二酸，β -環(huán)己基丙 氨酸，瓜氨酸，脫氫丙氨酸，α -環(huán)己基甘氨酸，炔丙基甘氨酸，焦谷氨酸，4-苯甲酰苯丙氨 酸，δ -羥賴氨酸，4-羥脯氨酸，別異亮氨酸，羊毛硫氨酸（Lan)，正亮氨酸，正纈氨酸，鳥氨 酸，苯甘氨酸，哌啶酸，肌氨酸，1，2, 3, 4-四氫異喹啉-3-羧酸，別蘇氨酸，噻唑烷-4-羧酸， Y -氨基丁酸（GABA)，異半胱氨酸，二氨基丙酸，2, 4-二氨基丁酸，3, 4-二氨基丁酸，聯(lián)苯丙 氨酸，4-氟苯丙氨酸等。
[0010] 非蛋白氨基酸還包括蛋白氨基酸的衍生物，例如，高甲硫氨酸，高絲氨酸，高脯氨 酸，高蘇氨酸，高色氨酸，高酪氨酸，高組氨酸，高賴氨酸等。
[0011] 在一些實(shí)施例中，SEQ ID N0 :1序列所示的天冬氨酸激酶在342氨基酸位點(diǎn)處被 如下氨基酸置換：Ala，Leu，Asn，Lys，Asp，Met，Cys，Phe，Glu，Thr，Gln，Trp，Gly，Val，Pro， Ser, Tyr, Arg,或 His〇
[0012] 在優(yōu)選的實(shí)施例中，天冬氨酸激酶的342位點(diǎn)處的氨基酸殘基被Ala置換。
[0013] 需要指出的是，本發(fā)明所述的天冬氨酸激酶的序列不只限于SEQ ID N0 :1所示的 序列。與SEQ ID N0 :1具有序列同源性的并具有同樣酶活性的多肽序列都在本發(fā)明所述的 天冬氨酸激酶涵蓋的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明同樣適用于來源于其它微生物種屬或其它大腸 桿菌菌株的天冬氨酸激酶。
[0014] 與SEQ ID N0 :1具有序列同源性的多肽序列，可以在除本發(fā)明中公開的相當(dāng)于SEQ ID N0 :1序列的342突變位點(diǎn)以外的一個或多個氨基酸位點(diǎn)處與SEQ ID N0 :1序列相比出 現(xiàn)氨基酸置換、氨基酸刪除或插入。并且，對于同源的多肽序列，在至少部分保留天冬氨酸 激酶活性的前提下，也可以在其他氨基酸位點(diǎn)處進(jìn)行氨基酸置換、氨基酸刪除或插入。通常 來說，在保留天冬氨酸激酶活性的前提下，SEQ ID N0:1序列中除342以外的任意氨基酸位 點(diǎn)，都可以進(jìn)行氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，SEQ ID N0 :1序列中的1，2, 3, 5,10, 20, 30， 40,50個氨基酸位點(diǎn)，都進(jìn)行了氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，SEQ ID N0 :1序列中的50， 60，70，80，90，100個氨基酸位點(diǎn)，都進(jìn)行了氨基酸置換。
[0015] 與SEQ ID NO: 1序列相比含有一個或多個氨基酸插入的多肽視為SEQ ID N0 :1序 列的同源序列。氨基酸插入可以發(fā)生在SEQ ID NO: 1序列的任意位點(diǎn)。同樣地，與SEQ ID NO :1序列相比含有一個或多個氨基酸刪除的多肽視為SEQ ID NO :1序列的同源序列。氨 基酸刪除可以發(fā)生在SEQ ID N0 :1序列的除342以外的任意位點(diǎn)。
[0016] SEQ ID NO :1 序列的同源序列有至少 75%，80%，85%，90%，95%，99% 與 SEQ ID NO :1 序列相同。序列比對使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法或計算機(jī)軟件。
[0017] 本發(fā)明還包括包含相當(dāng)于SEQ ID N0 :1序列中342氨基酸突變位點(diǎn)的，有天冬氨 酸激酶活性的SEQ ID N0 :1序列的一個片段，以及所述多肽片段的同源多肽。上述帶有天 冬氨酸激酶活性的多肽片段，與SEQ ID N0:1序列或其同源序列的不同之處在于，在N-末 端和/或C-末端有一個或多個氨基酸缺失。例如，在至少部分保留天冬氨酸激酶活性的前 提下，SEQ ID NO: 1序列的片段可以在N-末端和/或C-末端有5個，10個，15個，20個，30 個，40個，或50個氨基酸缺失。同樣地，在至少部分保留天冬氨酸激酶活性的前提下，SEQ ID N0 :1序列的同源序列的片段可以在N-末端和/或C-末端有5個，10個，15個，20個， 30個，40個，或50個氨基酸缺失。
[0018] 本發(fā)明還公開了一段多聚核苷酸，其編碼一段本發(fā)明所述的有天冬氨酸激酶活性 的多肽，該多肽包括在342氨基酸位點(diǎn)處有氨基酸置換的SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列、 帶有天冬氨酸激酶活性的該序列的多肽片段，或它們的同源序列。例如，多聚核苷酸可以具 有如SEQ ID N0:2所示的序列，其中編碼Ile342氨基酸位點(diǎn)的密碼子被修改，以造成在上 述位點(diǎn)處的氨基酸置換。本發(fā)明還包括由于使用了不同的簡并密碼子而造成的與上述序列 不同的多聚核苷酸序列，以及針對不同宿主而進(jìn)行了編碼子優(yōu)化的、編碼同樣或同源的多 肽序列的多聚核苷酸序列。
[0019] 本發(fā)明還公開了一個表達(dá)載體，該載體包含一段多聚核苷酸序列，所述的序列編 碼本發(fā)明所述的有酶活性的天冬氨酸激酶，或天冬氨酸激酶的多肽片段，以及它們的同源 多肽。表達(dá)載體是指一個多聚核苷酸構(gòu)建物，一般由DNA分子組成，能夠?qū)崿F(xiàn)載體上一段多 聚核苷酸的基因轉(zhuǎn)移、在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和基因表達(dá)。所述多聚核苷酸相對于宿主細(xì)胞 可以是異源的，也可以是同源但經(jīng)過修飾的。表達(dá)載體的復(fù)制可以通過整合到宿主細(xì)胞基 因組中進(jìn)行復(fù)制，或通過游離型載體(如質(zhì)粒）進(jìn)行復(fù)制。游離型載體帶有可以在宿主細(xì)胞 中自我復(fù)制的復(fù)制子序列。
[0020] 在本發(fā)明所公開的方法中使用的表達(dá)載體，可以是高拷貝數(shù)質(zhì)粒，以實(shí)現(xiàn)在宿主 細(xì)胞中表達(dá)高水平天冬氨酸激酶的目的，也可以是中拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。表達(dá)載體 一般帶有用于篩選轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。通常使用的標(biāo)記基因?yàn)榭箍股鼗?，例如抗氨芐 青霉素、卡那霉素或四環(huán)素的基因。標(biāo)記基因的選擇可以根據(jù)所用的宿主細(xì)胞和載體來決 定。
[0021] 本發(fā)明所述的表達(dá)載體是能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明所述的多聚核苷酸表達(dá)的載體。通常來 說，表達(dá)載體包含對想要表達(dá)的多聚核苷酸序列起作用的調(diào)節(jié)序列，例如啟動子和增強(qiáng)子。 表達(dá)載體中的啟動子可以是組成型的，也可以是誘導(dǎo)型的。調(diào)節(jié)序列可以依據(jù)所用的宿主 菌、預(yù)期的多肽表達(dá)水平等進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，所構(gòu)建的表達(dá)載體用于在原核生物 細(xì)胞中表達(dá)天冬氨酸激酶。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所構(gòu)建的表達(dá)載體用于在細(xì)菌中表達(dá)天冬 氨酸激酶，例如大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。
[0022] 本發(fā)明所述的表達(dá)載體還包括能夠?qū)崿F(xiàn)將本發(fā)明所述的天冬氨酸激酶以融合蛋 白的形式表達(dá)的載體。融合蛋白是指包含至少兩段在天然狀態(tài)下不相連的多肽或多肽片段 的雜合蛋白。表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體，在所要表達(dá)的多肽的N-末端或C-末端增加一段 氨基酸序列。增加的氨基酸序列可能但不局限于提供如下作用，例如增強(qiáng)天冬氨酸激酶在 宿主細(xì)胞中的表達(dá)，或者有利于天冬氨酸激酶的純化。
[0023] 本發(fā)明還公開了包含所述多聚核苷酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。多種不同的宿主細(xì) 胞可以用于表達(dá)本發(fā)明所述的天冬氨酸激酶。真核生物細(xì)胞(例如酵母或動物細(xì)胞）和原 核生物細(xì)胞都可以用于重組表達(dá)本發(fā)明所述的天冬氨酸激酶。宿主優(yōu)選原核生物細(xì)胞。優(yōu) 選細(xì)菌作為宿主。例如，宿主可以是以下種屬的細(xì)菌：大腸埃希氏菌，沙雷氏菌，短桿菌，棒 狀桿菌等。優(yōu)選大腸桿菌作為宿主菌。可以用于賴氨酸和蘇氨酸生產(chǎn)的大腸桿菌菌株包括 K-12, JM109, GT3 等。
[0024] 用于發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的宿主菌可以含有完整的L-賴氨酸生物合成途徑，能夠獨(dú) 立生產(chǎn)賴氨酸。例如，含有編碼SEQ ID N0 :1多肽的基因序列的野生型大腸桿菌可以用作 宿主菌。但使用野生型菌株生產(chǎn)賴氨酸產(chǎn)量極低。向上述宿主菌中轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述的編碼 天冬氨酸激酶突變型的多聚核苷酸，能夠明顯提高賴氨酸的產(chǎn)量。另外，宿主菌也可以不包 含天冬氨酸激酶III基因，或者不包含具有活性的天冬氨酸激酶III基因。向這種宿主菌 中轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述的多聚核苷酸，能夠使構(gòu)建的重組菌生產(chǎn)賴氨酸、蘇氨酸。
[0025] 本發(fā)明所提到的宿主細(xì)胞，可以包含其他有利于提高賴氨酸產(chǎn)量的基因突變、 基因刪除或基因插入，以及對基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾。例如賴氨酸生物合成途徑中一 些酶的突變和中心代謝途徑中一些酶的突變。例如二氫吡啶二羧酸合成酶（SEQ ID N0: 3) ，它催化天冬氨酸-β -半醛和丙酮酸的脫水縮合反應(yīng)，這是天冬氨酸家族氨基酸生物 合成途徑分支為賴氨酸生物合成途徑的第一個專屬酶。該酶由dapA基因 （SEQ ID Ν0: 4) 編碼，它的活性也受到賴氨酸的抑制（Blickling，S.and Knablein，J. (1997)Biol. Chem. 378:207-10)。EP0733710提到了 2種有助于提高賴氨酸產(chǎn)量的二氫吡啶二羧酸合成 酶的突變型。
[0026] 表達(dá)載體可以根據(jù)所用的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。例如，適用于大腸桿菌的表達(dá)載 體包括：pBluescript 系列載體，pUC 系列載體（如 pUC18, pUC19, pBR322, pBR329, pQE70， pQE60, pQE-9, pNH8A， pNH16A， pNH18A， pNH46A， ptrc99a， pKK223-3, pKK233-3, pDR540， pRIT5, pLG338, pKC30, pHSG299, pHSG399, pRep4, pACYC177, pACYC184, pRSFlOlO, pBW22 等)。適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體包括：大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭載體(如 PEC-XT99A，pEC-XC99E，pET-XK99E等）。還有一些其他的表達(dá)載體可供選擇，如Kirchner et al·，2003, J.Biotechnol·，104:287-299,和"Cloning Vectors，'（Pouwels et al. (eds.) Elsevier, Amsterdam New York Oxford, 1985)中所表述的載體。表達(dá)載體可以用任何適 合的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，例如Maniatis et al.在Molecular Cloning, A laboratory Manual (1982, Cold Spring Harbor Laboratory) 一書中闡述的一些方法，比如：電轉(zhuǎn)，顯微 注射，基因槍，或化學(xué)轉(zhuǎn)化法(如磷酸鈣法)。
[0027] 本發(fā)明還公開了一種生產(chǎn)L-賴氨酸或L-蘇氨酸的方法，包括：（i)在合適的培養(yǎng) 基里和在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)有天冬氨酸激酶活性的多肽， 該多肽由SEQ ID N0 :1序列組成，或由具有同樣酶活性的SEQ ID N0 :1序列片段或其同源 多肽組成，且在相當(dāng)于SEQ ID N0:1序列的Ile342氨基酸位點(diǎn)處有突變；（ii)從上述培養(yǎng) 液中提取L-賴氨酸或L-蘇氨酸。
[0028] 所利用的培養(yǎng)基必須適合特定宿主細(xì)胞的需要?？梢岳玫奶荚词翘呛吞妓?物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素；油和脂肪，例如大豆油，向 日葵油，花生油和椰子脂肪；脂肪酸，例如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸；醇，例如甘油和乙醇； 以及有機(jī)酸，例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫牡词怯袡C(jī)含氮化合 物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽抽提物，玉米漿，大豆粉和尿素；或無機(jī)化合物，如硫酸銨， 氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)或混合使用。磷源可以是磷酸二氫鉀或磷 酸氫二鉀或?qū)?yīng)的鈉鹽。培養(yǎng)基還可以含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除以上提 到的物質(zhì)外，可以添加必需的促生長物質(zhì)如氨基酸和維生素。所說的添加物可以一次或分 批添加到培養(yǎng)基中。
[0029] 培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞可以采用普遍使用的發(fā)酵方法。例如，細(xì)胞可以 進(jìn)行分批培養(yǎng)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，或連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方法在Encyclopedia of Bioprocess Technology - Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Volumesl-5, Flickinge r, M. C. , Drew, S. ff. (eds.), 1999John ffiley&Sons. 一書中有全面描述。培養(yǎng)溫度可以是 20。C到42。C，優(yōu)選30。C到40。C，優(yōu)選30。C到37。C。培養(yǎng)基的pH可以是5.0到 9. 0,優(yōu)選6. 0到8. 0,例如7. 0。培養(yǎng)時間可以從幾個小時到幾天。例如，如果采用分批培 養(yǎng)，培養(yǎng)時間可以是12h到36h ;如果采用連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間可以長達(dá)21天或更長。
[0030] 從培養(yǎng)液中提取產(chǎn)品（L-賴氨酸或L-蘇氨酸）可以采用公知的方法，例如 US5342766中所述的使用離子交換樹脂的方法。
[0031] 本發(fā)明所公開的經(jīng)過突變的具有天冬氨酸激酶活性的多肽或多肽片段有助于提 高賴氨酸和蘇氨酸的生物合成產(chǎn)量。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以構(gòu)建用于氨基酸生產(chǎn)的基因 工程菌，包括谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌。表達(dá)本發(fā)明所述的突變型天冬氨酸激酶的宿主菌， 在合適的培養(yǎng)基里可以生產(chǎn)L-賴氨酸和L-蘇氨酸。
[0032] 本發(fā)明公開了新的大腸埃希氏菌天冬氨酸激酶III的突變型，其突變位點(diǎn)與已報 道的突變型不同。過量表達(dá)本發(fā)明的突變型天冬氨酸激酶能夠提高賴氨酸產(chǎn)量。這為優(yōu)化 賴氨酸的生物合成提供了更多選擇，有助于構(gòu)建賴氨酸生產(chǎn)菌株或提高賴氨酸產(chǎn)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為天冬氨酸激酶和/或二氫吡啶二羧酸合成酶表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 生物保藏信息
[0035] 大腸桿菌（Escherichia coli)CAT lysl303根據(jù)《布達(dá)佩斯協(xié)議》于2013年3月22 日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO ：M2013100〇
[0036] 實(shí)施例1 :野生型大腸桿菌天冬氨酸激酶III基因（lysC)的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu) 建
[0037] 以大腸桿菌BL21 (北京博邁德生物科技有限公司）基因組DNA為模 板，以引物 1:AGGAGTTAATGAATGTCTGAAATTGTTGTCTC(SEQ ID N0:5)和引物 2: ACTGAAAGCTTTTACTCAAACAAATTACTAT (SEQ ID 勵：6)為引物，進(jìn)行？0?反應(yīng)。
[0038] PCR反應(yīng)得到約1. 4kb DNA產(chǎn)物。電泳純化該P(yáng)CR產(chǎn)物，與pMD18-T載體（TaKaRa) 連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109(北京博邁德生物科技有限公司）。對轉(zhuǎn)化子做菌 落PCR檢驗(yàn)lysC基因在質(zhì)粒中的方向，所用引物為引物3 :GAGTTAGCTCACTCATTAGG(SEQ ID NO :7)和引物2 (SEQ ID NO :6)。如果lysC基因與載體上lac啟動子方向一致，會產(chǎn)生約 1. 4kb的PCR產(chǎn)物。選擇lysC基因與載體上lac啟動子方向一致的質(zhì)粒，命名為pUC-lysC。
[0039] 實(shí)施例2 :突變型lysC基因的構(gòu)建和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040] 以 pUC-lysC 為模板，以引物 1 (SEQ ID NO :5)和引物 4 :GTCTACCGAAATATTATGCC (SEQ ID NO :8)為引物，擴(kuò)增lysC基因片段I (約lkb);以引物2 (SEQ ID NO :6)和引物 5 :GGCATAATAITTCGGTAGACTTAGCCACCACGTCAGAAGTGAGC (SEQ ID NO :9)為引物，擴(kuò)增 lysC 基因片段Π (約0.3kb)。
[0041] 電泳純化兩個PCR產(chǎn)物。以等摩爾量混合lysC基因片段I和II，作為模板，以引 物1 (SEQ ID N0:5)和引物2 (SEQ ID N0:6)為引物，進(jìn)行重疊 PCR。PCR反應(yīng)液體積為 50 μ 1，成分如下：
[0042] lysC 片段 I 和 II :每個 0· 05pmole
[0043] 引物：每個 50pmole
[0044] TaKaRaTaq DNA Polymerase (TaKaRa) ：2.5U
[0045] 10 XPCR Buffer :5 μ 1
[0046] dNTPs :每種 lOnmole
[0047] 重疊 PCR反應(yīng)得到一個約1. 4kb的產(chǎn)物。電泳純化PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體 (TaKaRa)連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109。對轉(zhuǎn)化子做菌落PCR檢驗(yàn)lysC基因在 質(zhì)粒中的方向，所用引物為引物3 (SEQ ID NO :7)和引物2 (SEQ ID N0 :6)。選擇lysC基 因與載體上lac啟動子方向一致的質(zhì)粒，用通用引物M13F (-47)和M13R (-48)進(jìn)行測序， 確認(rèn)在編碼氨基酸殘基342位點(diǎn)處有預(yù)設(shè)的Ile - Ala突變。將該質(zhì)粒命名為pUC-lysC342 (圖 1A)。
[0048] 實(shí)施例3 :野生型二氫吡啶二羧酸合成酶（dapA)的克隆
[0049] 以大腸桿菌 BL21 基因組 DNA 為模板，以引物 6 :ACTGAAAGCTTAGGAGGTAATGAATGTTC ACGGGAAGTATTGT (SEQ ID NO :10)和引物 7 :ACTGACATAT GTTACAGCAA ACCGGCATGC (SEQ ID NO :11)為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0050] PCR反應(yīng)得到約0. 9kb DNA產(chǎn)物。電泳純化該P(yáng)CR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接。將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109。對轉(zhuǎn)化子做菌落PCR檢驗(yàn)，所用引物為引物3 (SEQ ID NO :7)和引物 6 (SEQ ID NO :10)，或引物 3 (SEQ ID NO :7)和引物 7 (SEQ ID NO :11)。無 論使用哪組引物，如果dapA基因成功與載體相連，會產(chǎn)生約0. 9kb的PCR產(chǎn)物。選擇含有 dapA基因的質(zhì)粒，命名為pUC-dapA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，dapA基因相對于lac啟 動子可能有兩種連接方向。任意一種方向都可以滿足本實(shí)施例和實(shí)施例4的需要。
[0051] 實(shí)施例4 :突變型dapA基因的構(gòu)建
[0052] 以 pUC-dapA 為模板，以引物 8 :GACCGGCGCTAACGTTACTGCGGAAGCC (SEQ ID NO :12) 為引物，進(jìn)行定點(diǎn)誘變PCR。PCR反應(yīng)液體積為50 μ 1，成分如下：
[0053] pUC-dapA 質(zhì)粒：100ng
[0054] 引物 8 :50pmole
[0055] Pfu DNA Polymerase (北京博邁德生物科技有限公司）：5U
[0056] Taq DNA Ligase (NEB) ：40U
[0057] lOXPfu Buffer ：4μ 1
[0058] lOXTaq DNA Ligase Buffer ：5μ 1
[0059] dNTPs :每種 lOnmole
[0060] PCR反應(yīng)條件如下：
[0061] 94° C，5min
[0062] 94° C，lmin (循環(huán)開始）
[0063] 55。C, lmin
[0064] 65。C，8min (30 個循環(huán)）
[0065] 65。C, lOmin
[0066] 向PCR反應(yīng)液中加入10U Dpnl(NEB)，于37° C反應(yīng)lh。取10 μ 1酶切處理后的 PCR反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
[0067] 提取多個轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用通用引物M13F (-47)和M13R (-48)進(jìn)行測序，檢驗(yàn) dapA基因中編碼氨基酸殘基81位點(diǎn)處是否有預(yù)期的Ala - Val突變。將成功引入突變的 質(zhì)粒命名為pUC-dapA81 (圖1B)。
[0068] 實(shí)施例5 :LysC342/DapA81共表達(dá)載體的構(gòu)建
[0069] 用Hindlll和Ndel酶切pUC_dapA81質(zhì)粒，獲得帶有dapA基因的DNA片段（約 lkb);用同樣的酶切pUC-lysC342質(zhì)粒，獲得帶有l(wèi)ysC基因和質(zhì)粒骨架部分的DNA片段(約 4kb)。將兩片段連接，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109 (圖1)。
[0070] 用引物1(SEQIDN0:5)和引物7(SEQIDN0:11)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR。如 果dapA基因與lysC基因成功連接，會產(chǎn)生約2. 2kb的PCR產(chǎn)物。選擇成功連接的質(zhì)粒，命 名為 pUC-lysC342-dapA81 (圖 1C)。
[0071] 實(shí)施例6 :用含有突變型天冬氨酸激酶的宿主菌生產(chǎn)賴氨酸
[0072] 將質(zhì)粒 pUC-lysC、pUC_lysC342 和 pUC-lysC342_dapA81 分別轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌 K-12substr. MG1655 (DSM-18039)。得到的菌株 MG1655/pUC-lysC、MG1655/pUC-lysC342 (即大腸桿菌 CAT lysl303,保藏號 CCTCC M2013100)和 MG1655/pUC-lysC342-dapA81 被接 種于種子培養(yǎng)液中，于30° C培養(yǎng)12h。以2.0%接種量將種子菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液。于 30° C培養(yǎng)2h，加入ImM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)36h。
[0073] 其中，種子培養(yǎng)液（100mL)中含有：
[0074] 蔗糖：0. 32g ;
[0075] 硫酸銨：0. 55g ;
[0076] 酵母粉：0. 3g ;
[0077] 蛋白胨：0. 6g;
[0078] 磷酸二氫鉀：0. 3g ;
[0079] 硫酸鎂：0· Olg ;
[0080] 硫酸亞鐵：0. Olg ;
[0081] 異亮氨酸：0.004g;
[0082] 維生素 B1 :0· 003g。
[0083] 其中，發(fā)酵培養(yǎng)液（100mL)中含有：
[0084] 葡萄糖：14g;
[0085] 蔗糖：lg;
[0086] 硫酸銨：3. 3g ;
[0087] 磷酸二氫鉀：0· 42g ;
[0088] 硫酸鎂：0. 05g ;
[0089] 硫酸亞鐵：0· Olg ;
[0090] 玉米漿：1. 6g;
[0091] 異亮氨酸：0.02g;
[0092] 尼克酰胺：1.0mg;
[0093] 維生素 Bl:3.0mg;
[0094] 碳酸鈣：2. 8g。
[0095] 賴氨酸濃度的測定方法（比色法）如下：
[0096] 將發(fā)酵原液稀釋到大約30mg/dl賴氨酸鹽酸鹽濃度，取稀釋后的液體lmL置于 25mL的干燥試管中；再分別取30mg/dl賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒸餾水lmL，分別置于不同 的干燥試管中；分別在各個試管(分別加入了待測液、標(biāo)準(zhǔn)液、空白水）中加入lmL茚三酮溶 液；混合均勻后，用鋁箔將試管封口；將以上各個試管置于l〇〇°C沸水浴中加熱，自沸水沸 騰起計時10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，取出試管，置于冷水中冷卻后，分別準(zhǔn)確吸取8mL蒸餾水于 各個試管中，混勻；然后，在分光光度計上測定475nm的吸光值。空白樣以空白試驗(yàn)試管的 液體作為參照，所得吸光值按照茚三酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算出發(fā)酵液稀釋后的賴氨酸的 濃度。根據(jù)稀釋度得到發(fā)酵原液中賴氨酸鹽酸鹽濃度。
[0097] 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)36h后，經(jīng)測定，產(chǎn)酸水平如表1所示。
[0098] 表1、賴氨酸產(chǎn)量測定結(jié)果
[0099]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有天冬氨酸激酶ΠΙ活性的多肽，其特征在于，天冬氨酸激酶III的第342位 異亮氨酸殘基被除了異亮氨酸以外的任意氨基酸殘基取代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，天冬氨酸激酶III的第342位異亮氨酸殘 基被丙氨酸殘基取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述天冬氨酸激酶III具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
4. 一種具有天冬氨酸激酶III活性的多肽，其特征在于，在如權(quán)利要求1-3中任一項所 述的多肽的基礎(chǔ)上插入、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基。
5. -種多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸編碼如權(quán)利要求1-4中任一項所述 的多肽。
6. -種表達(dá)載體，其特征在于，包含如權(quán)利要求5所述的多聚核苷酸。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含如權(quán)利要求5所述的多聚核苷酸或如權(quán)利要求6所 述的表達(dá)載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)菌為大腸桿菌，保藏號為 CCTCC M2013100。
10. 如權(quán)利要求7-9中任一項所述的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)賴氨酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/54GK104099308SQ201310113874
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】周豪宏, 劉馳, 龐振華, 陳祖華, 吳亞斌, 李乃強(qiáng) 申請人:上海凱賽生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司, 凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司