一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用。以含有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因gdh和冰核蛋白基因的質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒，將編碼目標(biāo)蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列g(shù)dh-m中引入突變的堿基，構(gòu)建葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表面展示質(zhì)粒；從而展示在宿主細(xì)胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。本發(fā)明制備得到的葡萄糖脫氫酶展示菌株具有高穩(wěn)定性和高特異性，得到的全細(xì)胞催化劑可應(yīng)用于生物能源、食品發(fā)酵、淀粉糖、功能糖、生物醫(yī)藥、化工、環(huán)境檢測(cè)、生物傳感器和生物燃料電池等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展 示系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫 氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖脫氫酶（⑶H) (EC1. 1. 1. 47)廣泛參與生物體中的葡萄糖代謝途徑，特別是 芽孢桿菌在芽孢形成階段的關(guān)鍵酶。借助于輔酶NAD (P) +，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成 葡萄糖酸內(nèi)酯，輔酶NAD (P) +則被還原為NAD (P) H。自二十世紀(jì)八十年代起，研究人員就已 經(jīng)克隆了來(lái)源于芽孢桿菌的GDH，并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)。
[0003] 來(lái)源于芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族（short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，是由四個(gè)相同的亞基組成的四聚體蛋白，單體的分子量 約為30kDa。野生型的GDH熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都不理想，因此，在實(shí)際應(yīng)用上受到了一 定的限制。鑒于此，研究人員開始對(duì)編碼GDH的基因進(jìn)行體外定向進(jìn)化的研究，Makino和 Nagao等人采用化學(xué)誘變的方法對(duì)來(lái)源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脫氫酶進(jìn)行 了突變，得到了多株熱穩(wěn)定性提高的突變體，其中E96A的熱穩(wěn)定性最高，與野生型相比提 高了約ZCTC^Baik等人米用DNA重排技術(shù)突變來(lái)源于Bacillus licheniformis IF012200, Bacillus megaterium IF015308, Bacillus subtilis IF013719 和 Bacillus megaterium IWG3的一個(gè)突變體F20 (Q252L)，獲得了一個(gè)熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體DN46 (E170K/ Q252L)，DN46在66°C的半衰期為540分鐘，而F20僅為1. 3分鐘。⑶Η的三維結(jié)構(gòu)研究表 明，突變體通過(guò)增強(qiáng)疏水作用和減小離子的排斥作用顯著增強(qiáng)了亞基與亞基之間的相互作 用力，穩(wěn)定了酶的三維結(jié)構(gòu)，從而提高了酶的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，Vazquez-Figueroa等人 對(duì)來(lái)自于Bacillus subtilis的葡萄糖脫氫酶進(jìn)行了有理設(shè)計(jì)，得到了多個(gè)突變體，其中 K170/L252突變體的Tm值和野生型相比提高了 34. 7°C。
[0004] 在底物特異性方面，GDH對(duì)其天然底物β -D-葡萄糖的特異性并不高，對(duì)結(jié)構(gòu)類似 的木糖、半乳糖、甘露糖都有較弱的催化作用。研究人員在GDH三維結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，突 變了巨大芽孢桿菌ΙΑΜ1030中IV-GDH的C-末端區(qū)域的氨基酸殘基，得到了多個(gè)突變體，它 們對(duì)其底物特異性都有很大的影響。
[0005] 綜上所述，研究者廣泛采取隨機(jī)突變、DNA重排等基因工程的手段，在一定程度上 提高了 GDH的穩(wěn)定性和底物特異性，但是這些方法需要將表達(dá)的突變蛋白進(jìn)行純化，然后 再測(cè)定其酶活性，上述過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要昂貴的儀器設(shè)備，過(guò)程復(fù)雜且不易操作，尤其不 適用于高通量的突變體篩選。
[0006] 微生物表面展示技術(shù)是利用基因工程的手段將外源蛋白通過(guò)融合適當(dāng)?shù)腻^定蛋 白而表達(dá)在微生物細(xì)胞的表面，例如OmpA、冰核蛋白（ice-nucleation protein，INP)和凝 集素等都可以作為錨定蛋白。這種技術(shù)被廣泛用于蛋白質(zhì)工程，疫苗設(shè)計(jì)，疾病診治，工業(yè) 和環(huán)保等領(lǐng)域。由于被展示的蛋白在細(xì)胞表面具有相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，能 夠直接與底物進(jìn)行充分的反應(yīng)，而且表面展示文庫(kù)具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，因此微生 物表面展示技術(shù)在研究蛋白質(zhì)生物學(xué)功能方面具有很大的應(yīng)用前景。Tan等利用OprI作為 錨定蛋白將聚（R)的3-羥基丁酸酯（PHB)解聚酶突變體展示在大腸桿菌的表面，篩選得到 酶活性提高的突變體，研究了參與底物識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸殘基。由此可見，微生物表面展示 技術(shù)是用來(lái)研究蛋白功能和特性的一個(gè)非常簡(jiǎn)單、有效的手段。INP是丁香假單胞菌等菌株 的外膜蛋白，可催化過(guò)冷卻水結(jié)冰。外源蛋白可與INP融合，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇而錨定在 細(xì)菌表面。全長(zhǎng)的冰核蛋白包括N端、C端和中間重復(fù)序列。與其他錨定蛋白相比，外源蛋 白可以在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定的表達(dá)，而且能夠高效的展示在細(xì)菌表面。
[0007] Quikchange定點(diǎn)突變技術(shù)是通過(guò)設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的引物，利用PCR反應(yīng)，以質(zhì) 粒為模板，在高保真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，得到含有突變位點(diǎn)的DNA雙鏈質(zhì)粒，這 種質(zhì)粒是未甲基化的，而大腸桿菌自身的質(zhì)粒DNA是甲基化的，這樣就可以通過(guò)Dpnl酶消 化去除原始模板，最后得到突變的質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化得到突變的菌株。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，效率 高,現(xiàn)已成功用于各種突變體的構(gòu)建。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展 示系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0010] 一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，以含有來(lái)源于 枯草芽抱桿菌的匍萄糖脫氫*酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒，將編碼目標(biāo) 蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列g(shù)dh-m中引入突變的堿基，構(gòu)建葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表 面展示質(zhì)粒；從而展示在宿主細(xì)胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌 表面展示系統(tǒng)。
[0011] 所述突變體，利用Quikchange定點(diǎn)突變方法，以質(zhì)粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有 突變堿基的正向和反向序列為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到突變體。（pTInaPbN-Gdh模版按照 如下文獻(xiàn)構(gòu)建 Bo Liang, Liang Li, Xiangjiang Tang, Qiaolin Lang, Hongwei Wang, Feng Li,Jianguo Shi,Wei Shen，Ilaria Palchetti，Marco Mascini，and AihuaLiu*，Microbial surface display of glucose dehydrogenase for amperometric D-glucose biosensor, Biosensors and Bioelectronics2013,45,19-24.)
[0012] 具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)制備方法，以含有來(lái) 源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒，利用 Quikchange定點(diǎn)突變方法，以質(zhì)粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有突變堿基的正向和反向序列 為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到突變體，也就是將編碼目標(biāo)蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列g(shù)dh-m 中引入突變的堿基，構(gòu)建葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表面展示質(zhì)粒；該質(zhì)粒含有在葡萄糖脫 氫酶宿主細(xì)胞菌中表達(dá)和表面展示的所有元件，突變體與負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白 N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N融合，從而展示在宿主細(xì)胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡 萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。
[0013] 具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用，所述展示系 統(tǒng)得到的全細(xì)胞可應(yīng)用于生物能源、食品工業(yè)、生物化工、生物傳感或分析檢測(cè)中。
[0014] 本發(fā)明的效果是：
[0015] 1.本發(fā)明利用冰核蛋白表面展示系統(tǒng)將葡萄糖脫氫酶突變體穩(wěn)定地展示在細(xì)菌 的表面，從而解決了胞內(nèi)酶提取過(guò)程復(fù)雜和穩(wěn)定性低的難題。
[0016] 2.本發(fā)明將定向進(jìn)化和細(xì)菌表面展示技術(shù)結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了便捷有效的葡萄糖脫 氫酶突變體篩選方法。
[0017] 3.本發(fā)明通過(guò)Quikchange定點(diǎn)突變的方法得到四株熱穩(wěn)定性提高的突變體 Q252L/E170R、Q252L/E170R/V149K、Q252L/E170R/G259A 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0018] 4.本發(fā)明細(xì)菌表面展示的葡萄糖脫氫酶突變體熱穩(wěn)定性高。其中突變體Q252L/ E170R/V149K/G259A的熱穩(wěn)定性最好，在60°C條件下的半衰期是21天。
[0019] 5.本發(fā)明通過(guò)Quikchange定點(diǎn)突變的方法得到兩株pH穩(wěn)定性提高的突變體 Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0020] 6.本發(fā)明通過(guò)Quikchange定點(diǎn)突變的方法得到三株底物特異性提高的突變體 Q252L/E170R/G259A、Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0021] 7.本發(fā)明細(xì)菌表面展示的葡萄糖脫氫酶突變體特異性好，其中突變體Q252L/ E170R/V149K/G259A對(duì)其他糖類，如木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、核 糖和阿拉伯糖均無(wú)催化活性。
[0022] 8.本發(fā)明提供一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示菌株 的制備方法。此方法簡(jiǎn)便高效，得到的菌株可用于生物能源、食品發(fā)酵、淀粉糖、功能糖、生 物醫(yī)藥、化工、環(huán)境檢測(cè)、生物分析、生物傳感器和生物燃料電池等領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的葡萄糖脫氫酶基因的突變位點(diǎn)。
[0024] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的全細(xì)胞GDH突變體的pH穩(wěn)定性效果圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的全細(xì)胞GDH突變體的溫度穩(wěn)定性效果圖。
[0026] 本發(fā)明目的、功能及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說(shuō)明。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明利用Quikchange定點(diǎn)突變方法，構(gòu)建基于冰核蛋白的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)， 將葡萄糖脫氫酶突變體展示在大腸桿菌的表面，具體為：
[0028] 1.利用Quikchange定點(diǎn)突變方法突變葡萄糖脫氫酶的特定位點(diǎn)；
[0029] 2.將葡萄糖脫氫酶突變體展示在大腸桿菌的表面；
[0030] 3.測(cè)定葡萄糖脫氫酶突變體展示菌株全細(xì)胞的酶活性、穩(wěn)定性和底物特異性。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 葡萄糖脫氫酶突變體的獲得：
[0033] 1.野生型葡萄糖脫氫酶展示載體的構(gòu)建：將編碼枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillus)中葡萄糖脫氫酶的基因 gdh與含有INP的表達(dá)質(zhì)粒pTInaPb-N連接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，挑取轉(zhuǎn)化子，提取測(cè)序鑒定正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，命名為 pTInaPbN-Gdh，待用。
[0034] 2.單點(diǎn)突變體Q252L的構(gòu)建
[0035] 突變PCR :以pTInaPbN-Gdh質(zhì)粒DNA為模板，根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成引物（表 1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到編碼葡萄糖脫氫酶突變體的基因。
[0036] PCR反應(yīng)體系為：無(wú)菌水32. 5 μ L，模板DNA1 μ L，5 X PrimeSTAR HS緩沖液 (Mg2+plus) 10 μ L，dNTP 混合液（各 2. 5mmol/L) 4 μ L，引物 Q252L 正向（20pmol/μ L) 1 μ L， 引物 Q252L 反向（20pmol/yL)lyL，TaKaRaPrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5yL。反應(yīng)條件 為：95°C預(yù)變性 5min，94°C 10s，60°C 15s，72°C 7.5min，18 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。
[0037] 1)酶切：將反應(yīng)完成的PCR產(chǎn)物取出，按1 : 50的比列加入Dpnl酶，37°C酶切6 個(gè)小時(shí)。
[0038] 2)取出，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)，在含有卡那霉素的LB平板上涂布，37°C過(guò) 夜培養(yǎng)。
[0039] 3)轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，挑取單克隆送去測(cè)序。
[0040] 3.雙點(diǎn)突變體的構(gòu)建：雙點(diǎn)突變體Q252L/E170R的構(gòu)建是在單點(diǎn)突變體Q252L基 礎(chǔ)上，利用E170R的引物（表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)，引入E170R的突變位點(diǎn)。
[0041] 4.三點(diǎn)突變體的構(gòu)建：三點(diǎn)突變體Q252L/E170R/V149K和Q252L/E170R/G259A的 構(gòu)建是在雙點(diǎn)突變體Q252L/E170R基礎(chǔ)上，分別利用V149K和G259A的引物（表1)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，分別引入V149K和G259A的突變位點(diǎn)。
[0042] 5.四點(diǎn)突變體的構(gòu)建：四點(diǎn)突變體Q252L/E170R/V149K/G259A的構(gòu)建是在三點(diǎn)突 變體Q252L/E170R/V149K基礎(chǔ)上，利用G259A的引物（表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)，引入G259A的 突變位點(diǎn)。
[0043] 表lQuikchange定點(diǎn)突變方法所用到的PCR引物
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于：以 含有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒， 將編碼目標(biāo)蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列g(shù)dh-m中引入突變的堿基，構(gòu)建葡萄糖脫氫酶突 變體細(xì)菌表面展示質(zhì)粒；從而展示在宿主細(xì)胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶 突變體細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。
2. 按權(quán)利要求1所述的具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)， 其特征在于：利用Quikchange定點(diǎn)突變方法，以質(zhì)粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有突變堿基 的正向和反向序列為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到突變體。
3. -種權(quán)利要求1所述的具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系 統(tǒng)制備方法，其特征在于：以含有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋 白基因的質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒，利用Quikchange定點(diǎn)突變方法，以質(zhì)粒pTInaPbN-Gdh為模 版，帶有突變堿基的正向和反向序列為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到突變體，也就是將編碼目標(biāo) 蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列g(shù)dh-m中引入突變的堿基，構(gòu)建葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表 面展示質(zhì)粒；該質(zhì)粒含有在葡萄糖脫氫酶宿主細(xì)胞菌中表達(dá)和表面展示的所有元件，突變 體與負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N融合，從而展示在宿 主細(xì)胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。
4. 一種權(quán)利要求1所述的具有高穩(wěn)定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系 統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于：所述展示系統(tǒng)得到的全細(xì)胞可應(yīng)用于生物能源、食品工業(yè)、生物化 工、生物傳感或分析檢測(cè)中。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104120102SQ201310152468
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月27日
【發(fā)明者】劉愛驊, 梁波, 唐湘江 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所