水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g07010基因CDS序列的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g07010基因CDS序列的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g07010融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒寬度。對(duì)于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因 CDS序列的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因⑶S序 列的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個(gè)重要的功能基因研究的模式植物。與其相關(guān)的遺傳學(xué)和分子 生物學(xué)研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。當(dāng)前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢(shì)正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能發(fā)掘水稻進(jìn)一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時(shí)也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學(xué)的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個(gè)有次序的、選擇性的基因表達(dá)過 程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)的精確調(diào)控中起到了關(guān)鍵性的作用。
[0004] 近些年，有關(guān)籽粒大小性狀的分子遺傳調(diào)控機(jī)制研究，已取得了一定進(jìn)展，如：研 究者們利用QTL定位了一些籽粒大小相關(guān)基因，其中GS3編碼一個(gè)膜蛋白，是籽粒大小和 器官大小的負(fù)調(diào)控因子；張啟發(fā)等（Yibo Li, Chuchuan Fan, QIfa Zhang, et al. (2011) Natural variation in GS5plays an important role in regulating grain size and yield in rice. Nature Gennetics)研究發(fā)現(xiàn)GS5編碼一個(gè)調(diào)節(jié)籽粒大小的絲氨酸羧肽酶， 是控制籽粒大小的正調(diào)節(jié)因子，過表達(dá)GS5可使水稻籽粒明顯變大；轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控籽粒 大小方面起著非常重要的作用，0sWRKY78可以調(diào)節(jié)水稻莖的伸長和種子的發(fā)育，0sWRKY78 突變體可以使莖桿變矮化影響籽粒發(fā)育；螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子能通過調(diào) 控外稃和內(nèi)稃細(xì)胞的長度影響谷粒的大小；PGLl堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)異源二 聚體作為結(jié)合DNA的bHLH的抑制子過表達(dá)后可增加籽粒長度和重量。
[0005] 目前FAR家族轉(zhuǎn)錄因子對(duì)種子大小形狀調(diào)控機(jī)制的研究及認(rèn)識(shí)很少，本發(fā)明所述 的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)水稻種子籽粒的性狀有明顯的影響，因此該轉(zhuǎn)錄因子的研究在理論上為進(jìn)一 步理解植物種子和器官發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理提供了新的線索；在實(shí)踐上也將為作物高產(chǎn)育 種提供理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因⑶S序列的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，即融合蛋白 EAR-Linker-0s06g07010〇
[0008] 其中，EAR為來自植物轉(zhuǎn)錄因子的一段具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序 列和核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 4所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的Linker由1?40個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成(例如，GGGGG、 GPPPG或Gatway載體重組位點(diǎn)編碼的氨基酸序列DPAFLYKVVPR等)。
[0010] 作為優(yōu)選，Linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所 示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0011] 上述融合蛋白中涉及的0s06g07010為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010,其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的⑶S序列為：SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
[0012] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因，以及在嚴(yán)格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供含有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因的載體、工程菌及細(xì)胞 系。
[0014] 所述載體的構(gòu)建方法如下：
[0015] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s06g07010基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，其為正向 引物 F : 5，-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGACAGTAGCCGAGAT-3'和反向引物 R : 5，-CAAGAAAGCTGG GTCTCAGACATTCTTTGCACCA-3 ^。
[0016] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進(jìn)行PCR， 獲得0s06g07010基因完整的CDS序列。
[0017] (3)將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0018] (4)以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubi promoter-EAR-Gateway表達(dá)單兀、35S promoter-asRED表達(dá) 單元和35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nEAR-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0019] (5)通過LR反應(yīng)將0s06g07010基因的CDS序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有 EAR編碼基因的植物表達(dá)載體nEAR-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄 因子 EAR-Linker-0s06g07010 基因的表達(dá)載體 ubi :EAR-0s06g07010,其全序列如 SEQ ID No. 6所示。
[0020] 上述表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿 孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey，1998，Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0021] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，具體為：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法， 將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化 后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0022] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒寬及千粒重）中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因⑶S序列的引物對(duì)，包括 正向引物 F : 5 ' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGACAGTAGCCGAGAT-3'和反向引物 R : 5 ' -CAAGAAAG CTGGGTCTCAGACATTCTTTGCACCA-3 ^。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因⑶S序列在調(diào)控水稻籽粒性狀 中的應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR (SEQ ID No. 10)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010融合 構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
[0025] 前述的應(yīng)用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的⑶S序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子抑制 基序EAR編碼基因 （SEQ ID No. 4)的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。優(yōu) 選將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR 編碼基因的下游。
[0026] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010融合構(gòu)建得 到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改 良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒寬度增加。對(duì)于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理 論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中nEAR-hyg-asRED載體圖譜。
[0028] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ubi :EAR-0s06g07010載體圖譜。
[0029] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中PCR檢測(cè)EAR-0s06g07010轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，E1581H-07、E1581H-35 為 EAR-0s06g07010 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0030] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的表型寬度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，E1581H-07、E1581H-35 為 EAR-0s06g07010 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0031] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，E1581H-07、E1581H-35 為 EAR-0s06g07010 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0032] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 0s06g07010基因⑶S序列的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0036] 10s06g07010基因 CDS序列的獲得
[0037] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s06g07010基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物 F : 5 ^ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGACAGTAGCCGAGAT-3 ' 和反向引物 R : 5 ^ -CAAGAAAGCTGGGTCT CAGACATTCTTTGCACCA-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和 R進(jìn)行PCR，獲得0s06g07010基因完整的CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0038] 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0039] 將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄 因子抑制基序EAR編碼基因（如SEQ ID No. 4所示）的下游。
[0040] 2. 1將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上
[0041] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第 一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的模板用第一 輪的 PCR 產(chǎn)物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物（attB5' adaptor :5' -GTGGGGACAAG TTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3; ,BttBSi adaptor -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAMGCTGGGT CHV )。將PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的 基因完全相同的序列。
[0042] 2. 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0043] 以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubi promoter-EAR-Gateway表達(dá)單兀、35S promoter-asRED表達(dá)單兀和 35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nEAR-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0044] 表達(dá)載體nEAR-hyg-asRED含有Gateway重組系統(tǒng)，pDONR帶有目的基因的質(zhì)粒作 為入門載體（Entery vector),通過LR反應(yīng)可完成目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0045] 通過LR反應(yīng)將0s06g07010基因的⑶S序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有EAR 編碼基因的植物表達(dá)載體nEAR-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子 EAR-Linker-0s06g07010 基因的表達(dá)載體 ubi :EAR-0s06g07010,其全序列如 SEQ ID Νο·6 所示，載體圖譜見圖2。
[0046] LR反應(yīng)體系如下：
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，其為融合蛋白EAR-Linker-0s06g07010 ; 其中，EAR為來自植物轉(zhuǎn)錄因子的一段具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 10所示；Linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所 示；0s06g07010為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列 經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求 3所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
6. 權(quán)利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
7. 用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因⑶S序列的引物對(duì)，其特征在于，包括正向 引物 F : 5，-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGACAGTAGCCGAGAT-3'和反向引物 R : 5，-CAAGAAAGCTGG GTCTCAGACATTCTTTGCACCA-3'； 其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因 CDS序列在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn) 錄因子0s06g07010融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因 轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g07010基因的 CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR編碼基因的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而 改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104418954SQ201310370029
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】趙濤, 劉斌, 劉軍, 李宏宇, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所