抗體的制備方法【專利摘要】本發(fā)明提供能夠高效廉價生產(chǎn)重組抗體的方法。制備抗體或其片段的方法，包括：使用所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來產(chǎn)生抗體或其片段。還提供重組載體及轉化細胞，其中含有1拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA?！緦＠f明】抗體的制備方法[0001]本申請是2008年10月14日提交的200880106430.4號發(fā)明專利申請“抗體的制備方法”的分案申請?！尽?br>技術領域：
】】[0002]本發(fā)明涉及抗體的制備方法?！尽?br>背景技術：
】】[0003]使用DNA重組技術，生產(chǎn)可作為藥物使用的重組抗體時，如果使用動物細胞，可以實現(xiàn)復雜翻譯后的修飾及折疊，這些是使用原核細胞所不能做到的，所以動物細胞作為生產(chǎn)重組抗體的宿主細胞被廣泛應用。[0004]近年來，抗體、生物活性蛋白等生物類藥物大量問世。尤其是抗體藥物通常每次的施用量都在mg級，因此這就需要抗體中含有足夠量的活性成分。而這種使動物細胞高效生產(chǎn)重組抗體的技術，關系著抗體藥物的低成本化，且是向患者穩(wěn)定供應抗體藥物的保證。[0005]因此希望有更高效制備重組抗體的方法。[0006]在制備用來產(chǎn)生重組抗體的宿主細胞的時候，通常是將編碼該抗體H鏈的DNA和編碼L鏈的DNA各一拷貝導入到宿主細胞中(非專利文獻1、2)。[0007]非專利文獻1:ReffME,CarnerK,ChambersKS,ChinnPC,LeonardJE,RaabRetal.DepletionofBcellsinvivobyachimericmousehumanmonoclonalantibodytoCD20.Blood.1994Janl5;83(2):435-45.[0008]非專利文獻2:PrestaLGjChenH，0，ConnorSJ，ChisholmV，MengYGjKrummenL，etal.Humanizationofanant1-vascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibodyforthetherapyofsolidtumorsandotherdisorders.CancerRes.19970ct15;57(20):4593-9.【【
發(fā)明內容】】[0009]【發(fā)明擬解決的技術課題】[0010]另一方面，對于導入了一拷貝編碼所欲重組抗體H鏈的DNA和2拷貝以上編碼L鏈的DNA的穩(wěn)定轉化的表達細胞是否有助于提高所欲重組抗體的產(chǎn)生，目前尚無法得知。[0011]所以本發(fā)明的目的是提供一種高效生產(chǎn)抗體的方法。[0012]【解決課題的技術方案】[0013]本發(fā)明的【發(fā)明者】們，為了解決上述課題經(jīng)過不懈努力，發(fā)現(xiàn)當使用所含編碼抗體L鏈的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼H鏈的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞，可以提高抗體的產(chǎn)量，從而完成本發(fā)明。[0014]本發(fā)明的要點如下所述。[0015](I)制備抗體或其片段的方法，包括:使用所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來產(chǎn)生抗體或其片段。[0016](2)(I)的方法，其中所述所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞是導入以下載體的細胞，所述載體含I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA。[0017](3)(2)的方法，其中所述細胞是動物細胞。[0018](4)(3)的方法，其中所述動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞。[0019](5)(I)~(4)中任一項的方法，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[0020](6)(I)~(5)中任一項的方法，其中所述抗體選自:抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗⑶IIa抗體、抗VEGF抗體及抗VLA4抗體。[0021](7)制備藥物的方法，該藥物包含通過(I)~(6)中任一項的方法制備出的抗體或其片段。[0022](8)重組載體，其含有I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA。[0023](9)細胞，其中導入有(8)的載體。[0024](10)培養(yǎng)的細胞，其中所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多。[0025](11)制備抗體或其片段的方法，包括:使用以下細胞來產(chǎn)生抗體或其片段，所述細胞的特征是:與抗體H鏈或其片段相比，高表達抗體L鏈或其片段。[0026](12)(I)~(7)、(11)中任一項的方法，其中所述細胞是穩(wěn)定表達抗體或其片段的細胞。[0027](13)(9)或(10)的細胞，其穩(wěn)定表達抗體或其片段。[0028]【技術效果】[0029]可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出廉價的所欲重組抗體。[0030]本說明書包含作為本案的優(yōu)先權基礎的日本專利申請?zhí)卦?008-103308的說明書及/或附圖中記載的內容。[0031]【附圖簡述】[0032]圖1示每質粒具有I拷貝L鏈表達單位和I拷貝H鏈表達單位的I拷貝L鏈表達質粒phGC33CAG#l和每質粒具有2拷貝L鏈表達單位和I拷貝H鏈表達單位的2拷貝L鏈表達質粒phGC3CAGl。[0033]圖2是顯示導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株和導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株的抗體(人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體)產(chǎn)量的坐標圖。[0034]圖3示由人源化抗人IL-6R抗體基因的I拷貝H鏈和I拷貝L鏈構成的I拷貝L鏈表達質粒和由I拷貝H鏈和2拷貝L鏈構成的2拷貝L鏈表達質粒。[0035]圖4是顯示導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株和導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株的抗體(人源化抗人IL-6R抗體)產(chǎn)量的坐標圖。[0036]【實施方式】[0037]以下對本發(fā)明的實施方式進行更詳細說明。[0038]本發(fā)明提供制備抗體或其片段的方法，包括:使用所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來生產(chǎn)抗體或其片段。[0039]在本發(fā)明的方法中，所述所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞例如可為導入了I拷貝編碼所欲重組抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA的轉化細胞，并且也可為產(chǎn)生所欲重組抗體或其片段的細胞。[0040]在本發(fā)明的方法中，對所欲重組抗體并沒有特定限制，可為例如:抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗⑶25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗⑶33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗CDlla抗體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等針對任何抗原的重組抗體。所述抗體不僅可為人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴等動物源單克隆抗體，也包括嵌合抗體、人源化抗體、雙特異抗體等經(jīng)人工改造的基因重組型抗體。重組抗體也可未經(jīng)聚乙二醇等各種分子結合等化學修飾。而且，對抗體類別無特定限制，對抗體免疫球蛋白類別也無特定限制，可為IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等)、IgA、IgD、IgE、IgM等任一類別，但作為藥物使用時，優(yōu)選IgG及IgM。[0041]可如下制備編碼抗體L鏈的DNA和編碼H鏈的DNA。從攜帶表達抗體的基因的雜交瘤細胞、細胞、噬菌體、核糖體等中提取mRNA。將此mRNA用逆轉錄酶通過逆轉錄反應制備cDNA。用攜帶與L鏈基因或H鏈基因互補的堿基序列的引物及cDNA，通過PCR擴增L鏈基因或H鏈基因，并通過與克隆用質粒結合來獲得各基因。[0042]在本發(fā)明的方法中，作為所欲重組抗體片段，可舉例:Fab、F(ab’)2,Fv等。[0043]可如下制備編碼抗體L鏈片段的DNA和編碼H鏈片段的DNA。從攜帶表達抗體的基因的雜交瘤細胞、細胞、噬菌體、核糖體等中提取mRNA。將此mRNA用逆轉錄酶通過逆轉錄反應制備cDNA。用攜帶與L鏈基因片段或H鏈基因片段互補的堿基序列的引物及cDNA，通過PCR擴增L鏈基因片段或H鏈基因片段，并通過與克隆用質粒結合來獲得各基因片段。[0044]本發(fā)明的發(fā)明人通過將導入了I拷貝編碼重組抗體H鏈的DNA和2拷貝以上編碼L鏈的DNA的轉化細胞用于重組抗體制造，發(fā)現(xiàn)與導入了I拷貝編碼H鏈DNA和I拷貝編碼L鏈DNA的轉化細胞相比，顯著提高所欲重組抗體的產(chǎn)量。[0045]構成抗體分子的H鏈多肽和L鏈多肽在BiP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白)的幫助下進行裝配，然后經(jīng)折疊形成完整的抗體結構。此裝配過程依賴于L鏈多肽進行(MolecularBiologyofthecell,1999，10，2209)。因此，可以認為通過提高L鏈基因數(shù)比例和L鏈多肽的比例，可以促進H鏈多肽和L鏈多肽的裝配，從而產(chǎn)量增加。[0046]可是，與此相對，當是在穩(wěn)定表達系統(tǒng)(StableExpression)中表達重組抗體的穩(wěn)定表達轉化細胞(StableTransformant)時，與瞬時表達系統(tǒng)(TransientExpression)相比，H鏈的表達量下降了，從而提示H鏈的表達量更重要(Biotechnol.Prog.，2005,21，122)。由此，對于在穩(wěn)定表達系統(tǒng)中為了提高抗體的產(chǎn)量應如何控制H鏈和L鏈的表達量比例，目前尚不清楚。[0047]編碼重組抗體的H鏈或其片段的DNA數(shù)與編碼L鏈或其片段的DNA數(shù)之比只要比I大即可，優(yōu)選1.1~5，最優(yōu)選為2。[0048]所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞舉例如下:[0049]?導入了含有編碼H鏈或其片段DNA的載體(如I個)和含有比該載體數(shù)多的編碼L鏈或其片段DNA的載體(如2個以上)的細胞；[0050]?導入了在同一載體內含有I拷貝編碼H鏈或其片段的DNA及I拷貝編碼L鏈或其片段的DNA的載體和I個以上的含有I拷貝編碼L鏈或其片段DNA的載體的細胞；[0051]?導入了在同一載體內含有I拷貝編碼H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA的細胞，優(yōu)選為導入了在同一載體內含有I拷貝編碼H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA的細胞。[0052]當I拷貝編碼H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA中至少有I拷貝DNA在其他載體上的時候，這些載體的導入順序并沒有特別限制，既可以分別導入,也可以同時導入。[0053]本發(fā)明中表達抗體用的細胞也沒有特定的限制，可為真核細胞(動物細胞、植物細胞、酵母等)、原核細胞(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)等任何細胞，優(yōu)選為CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞等動物細胞，尤其優(yōu)選為CHO細胞。另外，為了制備所欲抗體，優(yōu)選適合導入所欲基因的細胞(如CHOdhfr細胞等)。例如，通過基因工程操作可以培養(yǎng)整合了編碼所欲抗體的基因的COS細胞或CHO細胞。[0054]作為本發(fā)明的方法中可以使用的載體，例如將大腸桿菌用作宿主時，為了讓載體在大腸桿菌(如JM109、DH5a、HBlOUXLlBlue)等中大量擴增、制備，優(yōu)選攜帶能夠使載體在大腸桿菌中擴增的“ori”，再具有轉化的大腸桿菌的篩選基因(如可通過若干藥劑(氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素)判別的耐藥性基因)。作為載體的例子，可舉出M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，當以cDNA的亞克隆、酶切為目的時，除上述載體外，還有例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等載體。當以生產(chǎn)本發(fā)明的抗體或其片段為目的使用載體時，表達載體尤其有用。作為表達載體，例如，以在大腸桿菌中表達為目的時，載體除了具有能在大腸桿菌中擴增上述特征之外，以JM109、DH5a、HBlOUXLl-Blue等用作宿主時，優(yōu)選具有能使在大腸桿菌中優(yōu)效表達的啟動子，如IacZ啟動子(Ward等，Nature(1989)341，544-546;FASEBJ.(1992)6，2422-2427)、araB啟動子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)或T7啟動子等。這樣的載體，除上述載體外，還可例舉pGEX_5X_l(Pharmacia公司制)、“QIAexpresssystem”(Qiagen公司制)、pEGFP或pET(此時，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)等。[0055]另外，載體中也可以含有多肽分泌用信號序列。作為多肽分泌用信號序列，如果是要在大腸桿菌細胞周質中產(chǎn)生時，可以使用PelB信號序列(Lei,S.P.etal.J.Bacteriol.(1987)169，4379)。而向宿主細胞中導入載體，可以使用氯化鈣法、電穿孔法等。[0056]除了以大腸桿菌作宿主以外，可用于本發(fā)明的方法中的載體還包括:源于哺乳動物的表達載體(如pcDNA3(Invitrogen公司制)、pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8或INPEP4(Biogen-1DEC公司制))、源于昆蟲細胞的表達載體(如“Bac至BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCOBRL公司制))、源于植物的表達載體(如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、源于動物病毒的表達載體(如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源于逆轉錄病毒的表達載體(如pZIpneo)、源于酵母的表達載體(如“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen公司制)、pNVl1、SP-QOI)、源于枯草芽孢桿菌的表達載體(如pPL608、pKTH50)等。[0057]以在CHO細胞、COS細胞、NIN3T3細胞等動物細胞中表達為目的的時，優(yōu)選具有使在細胞內表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR啟動子、EFlα啟動子(Mizushima等，NucleicAcidsRes.(1990)18，5322)、CMV啟動子(Niwa等，Gene.(1991)108，193)、小鼠β珠蛋白啟動子(mBGP)等，更優(yōu)選具有用于篩選細胞轉化的基因(如可通過藥劑(新霉素、G418等)判別的抗藥性基因)。具備這種特點的載體有，例如:pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、p0PRSV、p0P13等。因為已知攜帶了多聚A的mRNA在細胞內穩(wěn)定，優(yōu)選具有用于將多聚A添加到基因的多聚A信號(如小鼠β球蛋白多聚A信號、牛生長激素多聚A信號、SV40多聚A信號等)。[0058]作為本發(fā)明的細胞,既可用瞬時表達(TransientExpression)系統(tǒng)表達抗體或其片段；也可用穩(wěn)定表達(StableExpression)系統(tǒng)表達,但優(yōu)選用穩(wěn)定表達系統(tǒng)表達。[0059]瞬時表達系統(tǒng)是指將環(huán)狀質粒通過磷酸鈣法、電穿孔法、脂質體法等轉移到細胞內，使其表達的方法。由于環(huán)狀質粒插入染色體的效率低，目的基因存在于染色體外的情況多。因此，用環(huán)狀質粒表達目的基因難以長時間維持。[0060]穩(wěn)定表達系是指將經(jīng)限制酶處理等制成的線狀質粒通過磷酸鈣法、電穿孔法、月旨質體法等轉移到細胞內，使其表達的方法。線狀質粒比環(huán)狀質粒插入染色體的效率高，目的基因在染色體上維持的效率也提高。因此，可以長期維持目的基因的表達。另外，質粒如果導入了耐藥性基因，就可以進行藥劑篩選，從而能夠高效篩選出目的基因在染色體上維持的細胞。作為穩(wěn)定表達系統(tǒng)使用的動物細胞有例如=CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞等，優(yōu)選CHO細胞。[0061]此外，當以能穩(wěn)定表達基因且擴增細胞內基因拷貝數(shù)為目的時，可例舉向缺失了核酸合成通路的CHO細胞中導入具有彌補所述缺失的DHFR基因的載體(例如pCHOI等)，并通過甲氨蝶呤(MTX)進行擴增的方法，另外，當以瞬時表達基因為目的時，可例舉用攜帶SV40復制起點的載體(pcD等)轉化COS細胞(其染色體上攜帶有表達SV40T抗原的基因)的方法。而作為復制起點，可以使用源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起點。另外，為在宿主細胞系統(tǒng)中擴增基因拷貝數(shù)，表達載體中可以含有以下選擇標記物，如:氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因和二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。[0062]本發(fā)明還提供含有I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA的重組載體。[0063]本發(fā)明的載體可用于在宿主細胞中保持編碼重組抗體或其片段的DNA，或用于表達重組抗體或其片段?？赏ㄟ^向宿主細胞中導入I拷貝編碼重組抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼L鏈或其片段的DNA來促進H鏈多肽抗體分子的裝配，從而能夠提高由宿主細胞的所欲重組抗體或其片段的生產(chǎn)。[0064]其次，本發(fā)明提供導入有本發(fā)明的載體的宿主細胞。對導入有本發(fā)明的載體的宿主細胞沒有特定限制，可以使用例如:大腸桿菌或各種動物細胞等。本發(fā)明的宿主細胞可以作為例如制備或表達本發(fā)明的抗體或其片段的產(chǎn)生系統(tǒng)使用。作為用于制備多肽的產(chǎn)生系統(tǒng)，有體外及體內產(chǎn)生系統(tǒng)。作為體外產(chǎn)生系統(tǒng)可以例舉使用真核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用原核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。[0065]使用真核細胞時，可將例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞用作宿主。作為動物細胞，已知哺乳類細胞(如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、C0S、3T3、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela,Vero)、兩棲類細胞(如非洲爪蟾卵母細胞(Valle,etal.,Nature(1981)291,358-340))或昆蟲細胞(如Sf9、Sf21、Tn5)。CHO細胞中尤其適于使用缺陷DHFR基因的CHO細胞一dhfr-CH0(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1980)77,4216-4220)或CHOK-1(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1968)60,1275)。在動物細胞中，如果以大量表達為目的時，尤其優(yōu)選CHO細胞。向宿主細胞中導入載體的方法可包括例如:磷酸鈣法、DEAE右旋糖酐法、使用陽離子核糖體DOTAP(BoehringerMannheim公司制)的方法、電穿孔法、脂質體法等。[0066]作為植物細胞，已知如源于煙草(Nicotianantabacum)的細胞作為多肽生產(chǎn)系統(tǒng)，可對其進行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細胞，已知例如:酵母(如酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)))、霉菌(如曲霉菌屬(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillusniger)))。[0067]使用原核細胞時幼使用細菌細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。細菌細胞可例舉大腸桿菌(E.coli)(如:JM109、DH5a、HBlOl等)，其他的還已知枯草芽孢桿菌。[0068]通過用目的基因轉化這些細胞，并體外培養(yǎng)轉化細胞，得到了目的基因編碼的多肽。培養(yǎng)可按照眾所周知的方法進行。例如，動物細胞的培養(yǎng)液可以使用例如:DMEM、MEM、RPMI1640、MDM。此時，可以聯(lián)用胎牛血清(FCS)等血清補液，也可以進行無血清培養(yǎng)。培養(yǎng)時的PH值優(yōu)選約6~8。培養(yǎng)通常在約30~40°C進行約15~200小時，可根據(jù)需要進行培養(yǎng)基的更換、通氣、攪拌。[0069]可通過培養(yǎng)所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來由此細胞較以往高表達抗體或其片段。培養(yǎng)所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞，可用一般的細胞(優(yōu)選動物細胞)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。這當中一般包含氨基酸、維生素類、脂類因子、能源、滲透壓調節(jié)劑、鐵源、PH緩沖劑。這些成分的含量一般在氨基酸0.05~1500mg/L、維生素類0.001~10mg/L、脂類因子O~200mg/L、能源I~20g/L、滲透壓調節(jié)劑0.1~10000mg/L、鐵源0.1~500mg/L、pH緩沖劑I~10000mg/L、微量金屬元素0.00001~200mg/L、表面活性劑O~5000mg/L、生長輔因子0.05~10000μg/L及核苷0.001~50mg/L，這樣一個范圍內比較合適，但并無限制，可根據(jù)培養(yǎng)細胞的種類、所欲重組抗體或其片段的種類等適宜決定。[0070]除了上述成分以外，也可以添加如微量金屬元素、表面活性劑、生長輔因子、核苷坐寸ο[0071]具體例示含如下成分的培養(yǎng)基:[0072]氨基酸類:如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等，優(yōu)選L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等；[0073]維生素類:i_肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、煙酸、P-氨基安息香酸、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12、抗壞血酸等，優(yōu)選生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12、抗壞血酸等；[0074]脂類因子:氯化膽堿、酒石酸膽堿、亞油酸、油酸、膽固醇等，優(yōu)選氯化膽堿等；[0075]能源:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，優(yōu)選葡萄糖等；[0076]滲透壓調節(jié)劑:氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，優(yōu)選氯化鈉；[0077]鐵源類:EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等，優(yōu)選氯化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等；[0078]pH緩沖劑:碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，優(yōu)選碳酸氫鈉等。[0079]除上述成分外，也可添加如下成分:[0080]微量金屬元素:硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、偏硅酸鈉等，優(yōu)選硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等；[0081]表面活性劑:吐溫80、PluronicF68等；及[0082]生長輔因子:重組型胰島素、重組型IGF-1、重組型EGF、重組型FGF、重組型TOGF、重組型TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視黃酸、鹽酸腐胺等，優(yōu)選亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF-1、鹽酸腐胺等；[0083]核苷:脫氧腺苷、脫氧胞啶、脫氧鳥苷、腺苷、胞啶、鳥苷、尿苷等。[0084]此外，在上述培養(yǎng)基適宜例中，也可以含有抗生素(鏈霉素、青霉素G鉀及慶大霉素等)和pH指示劑(酚紅等)。[0085]培養(yǎng)基的pH根據(jù)所培養(yǎng)細胞的不同而不同，通常為pH6.8~7.6，多數(shù)情況下以pH7.0~7.4適宜。[0086]培養(yǎng)基可使用市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，如:D-MEM(Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基)、D-MEM/F-121:1混合物(Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL301(JRHbiosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、ISCHO-V(IrvineScientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等。[0087]此外、培養(yǎng)基也可為無血清培養(yǎng)基。[0088]當細胞是CHO細胞時，可使用本領域技術人員公知的方法培養(yǎng)CHO細胞。例如，通?？稍跉庀郈O2濃度為O~40%(優(yōu)選為2~10%)的霧氣氛下，于30~39°C(優(yōu)選約37°C)下進行培養(yǎng)。[0089]適于產(chǎn)生所欲重組抗體或其片段的細胞的培養(yǎng)時間通常為I天~3個月、優(yōu)選為I天~2個月，更優(yōu)選為I天~I個月。[0090]另外，作為各種動物細胞培養(yǎng)用裝置，可用例如:發(fā)酵槽式槽培養(yǎng)裝置、氣升式培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)皿式培養(yǎng)裝置、旋轉皿式培養(yǎng)裝置、微載體式培養(yǎng)裝置、流動層式培養(yǎng)裝置、中空纖維式培養(yǎng)裝置、旋轉瓶式培養(yǎng)裝置、填充槽式培養(yǎng)裝置等進行培養(yǎng)。[0091]培養(yǎng)可以使用分批培養(yǎng)(batchculture)、流加培養(yǎng)(fed-batchculture)、連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)等中任一種方法,但優(yōu)選流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)、更優(yōu)選流加培養(yǎng)。[0092]另一方面，作為體內產(chǎn)生抗體或其片段的系統(tǒng)可例舉使用動物的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用植物的產(chǎn)生系統(tǒng)。向這些動物或植物中導入目的基因，在動物或植物體內產(chǎn)生多肽，并回收。本發(fā)明中所述“宿主”包括這些動物、植物。[0093]用動物作宿主時，有用哺乳類動物、昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為哺乳類動物，可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(VickiGlaser,SPECTRUMBiotechnologyApplications,1993)。此外，使用哺乳動物時，還可以使用轉基因動物。[0094]轉基因動物的制造方法眾所周知。例如，可采用Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:7380-7384(1980)中記載的方法得到轉基因動物。具體而言，將目的基因導入哺乳動物全能細胞中，并使所述細胞在個體中發(fā)生。通過在得到的個體中篩選出體細胞和生殖細胞中整合了導入基因的個體來制造目的轉基因動物。作為導入基因的全能細胞，除受精卵或早期胚胎之外，還可例舉由具有多能性的ES細胞的培養(yǎng)細胞等。[0095]例如，可將目的基因(本發(fā)明中指的是，編碼抗體H鏈或其片段的DNA和編碼抗體L鏈或其片段的DNA)制成與編碼乳汁中固有產(chǎn)生的多肽(如山羊β酪蛋白等)的基因的融合基因。接著，將含所述融合基因的基因片段注入山羊胚胎，再將此胚胎移植給雌山羊?？蓮挠墒芗{所述胚胎的山羊生出的轉基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中得到目的多肽(本發(fā)明中是指，抗體或其片段)。為增加由轉基因山羊產(chǎn)生的含多肽乳汁，還可以給轉基因山羊使用適當?shù)募に?Ebert,K.Μ.etal.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。[0096]此外，作為昆蟲，可使用利用蠶。當使用蠶時，通過用插入有編碼目的多肽的基因(本發(fā)明中指的是，編碼抗體H鏈或其片段的DNA和編碼抗體L鏈或其片段的DNA)的桿狀病毒感染蠶，就能夠從這個蠶的體液中獲得目的多肽(Susumu，M.etal.，Nature(1985)315,592-594)。[0097]另外，使用植物時，可使用例如煙草。當使用煙草時，將編碼目的多肽的基因(本發(fā)明中指的是，編碼抗體H鏈或其片段的DNA和編碼抗體L鏈或其片段的DNA)插入到植物表達用載體(如PM0N530)中，再將這個載體導入到像農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)這樣的細菌中。用這種細菌感染煙草(如煙草(Nicotianatabacum)),就可以從該煙草的葉子中獲得所欲多肽(本發(fā)明中是指，抗體或其片段XJulianK.-C.Maetal.，Eur.J.1mmunol.(1994)24，131-138)。[0098]本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)細胞，所述細胞所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多。培養(yǎng)細胞如前所述。[0099]其次本發(fā)明還提供一種制備抗體或其片段的方法，包括:使用以下細胞來產(chǎn)生抗體或其片段，所述細胞的特征是:與抗體H鏈或其片段相比，高表達抗體L鏈或其片段。作為與抗體H鏈或其片段相比，高表達抗體L鏈或其片段的細胞可例舉所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞，這種細胞如前所述。而通過培養(yǎng)高表達抗體L鏈或其片段(與抗體H鏈或其片段相比)的細胞，可由所述細胞產(chǎn)生抗體或其片段。培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等如上所述。[0100]按本發(fā)明的方法制造的抗體，不僅是源于人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴等動物的單克隆抗體，也包括嵌合抗體、人源化抗體、雙特異抗體等經(jīng)人工改造的基因重組型抗體。另外，對抗體類別無特定限制、對抗體免疫球蛋白類別也無特定限制，可為IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等)、IgA、IgD、IgE、IgM等任一類別，但作為藥物使用時，優(yōu)選IgG及IgM。另外，本發(fā)明的抗體不僅包括全抗體，也包括Fv、Fab、F(ab’)2等抗體片段。[0101]可將采用本發(fā)明的方法制備的抗體再與抗體修飾物(聚乙二醇(PEG)等各種分子)結合而用作抗體修飾物。欲得到所述抗體修飾物，可對所得抗體進行化學修飾而得到。本領域乙建立了這些方法。[0102]上述本發(fā)明的抗體，可以通過本領域技術人員公知的方法制備。[0103]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，基本可以使用公知方法如下制備。即，將所欲抗原或表達所欲抗原的細胞用作致敏抗原，將其通過常規(guī)免疫方法免疫，再通過常規(guī)細胞融合法將得到的免疫細胞與公知的親本細胞融合，使用常規(guī)篩選法篩選出單克隆抗體產(chǎn)生細胞(雜交瘤細胞)而進行制備。雜交瘤細胞可以參照Milstein等人采用的方法(Kohler.G.andMilstein,C.,MethodsEnzymo1.(1981)73:3-46)進行制備。當抗原的免疫原性低時，可通過結合白蛋白等具有免疫原性的巨大分子而進行免疫。[0104]此外，從雜交瘤細胞克隆抗體基因，整合到合適的載體中，再將其導入宿主,可用使用基因重組技術產(chǎn)生的基因重組型抗體(如，參考Carl,A.K.Borrebaeck,James,ff.Larrick,THERAPEUTICMONOCLONALANTIBODIES,PublishedintheUnitedKingdombyMACMILLANPUBLISHERSLTD,1990)。具體而言，從雜交瘤的mRNA用逆轉錄酶合成抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。如果能夠得到編碼目的抗體V區(qū)的DNA，將其與編碼所欲抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，并將其整合到表達載體中。另外，也可將編碼抗體V區(qū)的DNA整合到含有抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。并以可用表達調控區(qū)(如增強子、啟動子)調控的方式將表達用載體整合到表達載體中，然后，可通過用所述表達載體轉化宿主細胞來表達抗體。[0105]本發(fā)明中，為了達到降低對人的異種抗原性等目的，可以使用經(jīng)人工改造的基因重組型抗體，如嵌合(Chimeric)抗體、人源化抗體(Humanized)等。這些經(jīng)改造抗體可以通過已知的方法制備。嵌合抗體是由人以外的哺乳動物(如小鼠)的抗體重鏈、輕鏈的可變區(qū)與人的抗體重鏈、輕鏈的恒定區(qū)構成的抗體，可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其整合到表達載體中，再導入宿主細胞來產(chǎn)生的方法得到。[0106]人源化抗體也稱重構(reshaped)抗體，是將人以外哺乳動物(如小鼠)抗體的互補決定區(qū)(⑶R；complementaritydeterminingregion)移植至人抗體互補決定區(qū)而得到的抗體，已知其常規(guī)基因重組手法。具體而言，用制成具有與末端部重疊的部分的數(shù)個寡核苷酸，通過PCR法合成了設計成連接了鼠抗體的⑶R和人抗體的構架區(qū)(frameworkregion；FR)的DNA序列。通過將所得DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后整合到表達載體中，再導入宿主來產(chǎn)生的方法得到(參考歐洲專利申請公開EP239400、國際專利申請公開W096/02576)。通過⑶R連接的人抗體FR區(qū)，可以選擇互補決定區(qū)形成良好的抗原結合位點的。根據(jù)需要，為了使重構抗體的互補決定區(qū)形成合適的抗原結合位點，還可以置換抗體可變區(qū)構架區(qū)的氛基酸(Sato,K.etal.,CancerRes.(1993)53,851-856)。[0107]另外，已知人抗體的獲得方法。如下舉例，用所欲抗原或表達所欲抗原的細胞體外致敏人淋巴細胞，將致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞(如U266)融合，就可以得到具有抗原結合活性的所欲人抗體(參考特公平1-59878)。另外，可通過用抗原免疫具有全套人抗體基因的轉基因動物來獲得所欲人抗體(參考國際專利申請公開W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、W096/33735)。再者，也已知使用人抗體庫，通過淘選獲得人抗體的技術。如，可通過將人抗體可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法在曬菌體表面表達而篩選出結合抗原的曬菌體。如果分析被篩選出的曬菌體的基因，就可確定編碼結合抗原的人抗體可變區(qū)的DNA序列。當清楚了與抗原結合的scFv的DNA的序列時，就可以制備出包含所述序列的合適的表達載體，進而可以獲得人抗體。上述方法也以廣為人知，可以參考W092/01047，W092/20791,W093/06213,W093/11236,W093/19172,W095/01438,W095/15388。[0108]可將通過上述方法得到的抗體或其片段純化至均一?？贵w或其片段的分離、純化可以按一般多肽的分離、純化方法進行?？赏ㄟ^適宜選擇、組合如下方法(但并不局限于此)來分離、純化抗體:親和層析等層析柱、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳等(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。通過上述方法得到的抗體濃度測定可以采用吸光度測定或酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay;ELISA)等進行。[0109]用于親和層析的層析柱可例舉:蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱可例舉:HyperD、P0R0S、SepharoseF.F.(Pharmacia)等。[0110]除親和層析之外的層析法可例舉如:離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996)。這些層析法可以用HPLC、FPLC等液相層析法進行。[0111]此外，可在多肽純化前或純化后用合適的多肽修飾酶與之作用來附加任意修飾或去除部分肽。作為多肽修飾酶使用的有例如:胰蛋白酶、糜蛋白酶、賴氨酰內肽酶(LysylEndopeptidase)、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。[0112]當按本發(fā)明的方法制備出的抗體或其片段具有可作為藥物使用的生物學活性時，可通過將所述多肽與可藥用媒質或添加劑混合而制劑化來制成藥物。[0113]可藥用媒質及添加劑可例舉:水、可藥用有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性右旋糖酐、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖和可作為藥物添加物的表面活性劑等。[0114]實際添加物可根據(jù)本發(fā)明治療劑的劑型選自上述中的一種或幾種適宜組合，當然也不限于此。當用作注射用制劑時，可使用將純化的多肽溶于溶劑(如生理鹽水、緩沖液、葡萄糖溶液等)，并向其中加入防吸附劑(例如吐溫80、吐溫20、明膠、人血清白蛋白等)的注射用制劑。也可用作使用前溶解重構的冷凍干燥劑型，冷凍干燥用賦形劑，可使用例如甘露糖醇、葡萄糖等的糖醇或糖類。[0115]抗體或其片段的有效施用量可根據(jù)抗體或其片段的種類、作為治療或預防對象的疾病種類、患者年齡、患病程度等適宜選擇。例如，當抗體為抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，且將用作抗癌劑時，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的有效施用量為每次每Ikg體重0.0Olmg~lOOOmg?；蜻x擇每名患者0.01~1000OOmg/人的施用量。但對這些施用量無限制。[0116]抗體或其片段的施用方法可為經(jīng)口、非經(jīng)口施用中的任一種，但優(yōu)選非經(jīng)口施用，具體可例舉:注射(如，通過靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射等的全身或局部施用)、經(jīng)鼻施用、經(jīng)肺施用、經(jīng)皮施用等。【實施例】[0117]以下將通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。然而這些實施例僅旨在說明本發(fā)明，無意限定本發(fā)明的范圍。[0118]【實施例1:人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體表達質粒的制備】[0119]首先，如下制備了人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體H鏈的基因。用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3片段(表達通過PCR與GST的融合蛋白基因而獲得)免疫小鼠(MRL/lpr，日本CharlesRiver)。用所述小鼠脾臟細胞制備雜交瘤。以磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3作為抗原，通過ELISA篩選雜交瘤，并篩選出產(chǎn)生磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3結合抗體的克隆。從雜交瘤中提取mRNA，使用逆轉錄酶通過逆轉錄反應制備cDNA。使用具有與小鼠H鏈可變區(qū)基因互補的堿基序列的引物(CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG)(SEQIDNO:1)和cDNA，通過PCR擴增了小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的H鏈可變區(qū)基因，并通過與pGEM-TEasy(Promega)結合而得到。從Kabatdatabase檢索出與小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的H鏈可變區(qū)基因的構架區(qū)具有同源性的人抗體H鏈可變區(qū)基因，并進行鑒定。設計出結合了經(jīng)鑒定的人抗體H鏈可變區(qū)基因的各構架部分和小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體H鏈可變區(qū)基因的各CDR部分的人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的H鏈可變區(qū)基因的堿基序列，并通過PCR合成。將人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的H鏈可變區(qū)基因與人IgGl恒定區(qū)基因結合，再通過置換氨基酸進行優(yōu)化而得到人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的H鏈基因(參考W006/06693)。在CAG啟動子的下游結合人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的H鏈基因，在再下游結合小鼠β球蛋白多聚A信號而制成了H鏈表達單位?？捎肏鏈表達單位上游的BamHI和Hindlll，下游的Xhol切下H鏈表達單位。[0120]接著，如下制備了人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體L鏈的基因。用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3片段免疫小鼠。用所述小鼠脾臟細胞制備雜交瘤。以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3作為抗原，通過ELISA篩選雜交瘤，并篩選出產(chǎn)生磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3結合抗體的克隆。從雜交瘤中提取mRNA，使用逆轉錄酶通過逆轉錄反應制備cDNA。使用具有與小鼠L鏈可變區(qū)基因互補的堿基序列的引物(GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG)(SEQIDNO:2)和cDNA，通過PCR擴增了小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的L鏈可變區(qū)基因，并通過與pGEM-TEasy(Promega)結合而得到。從Kabatdatabase檢索出與小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的L鏈可變區(qū)基因的構架區(qū)具有同源性的人抗體L鏈可變區(qū)基因，并進行鑒定。設計出結合了經(jīng)鑒定的人抗體L鏈可變區(qū)將帥的各構架部分和小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體L鏈可變區(qū)基因的各CDR部分的人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的L鏈可變區(qū)基因的堿基序列，并通過PCR合成。將人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的L鏈可變區(qū)基因與人IgGK恒定區(qū)基因結合，再通過置換氨基酸進行優(yōu)化而得到人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的L鏈基因(參考W006/06693)。在CAG啟動子的下游結合人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的L鏈基因，在再下游結合小鼠β球蛋白多聚A信號而制成了L鏈的表達單位。L鏈表達單位可用HindIII切下。[0121]將用BamHI和Xhol消化的質粒ΙΝΡΕΡ4(IDEC公司制造)與H鏈表達單位結合而制成pINP-GC33-Hl。將經(jīng)HindIII消化的pINP-GC33_Hl與用HindIII切下的L鏈表達單位結合。通過以上操作制成了I拷貝L鏈表達質粒phGC33CAG#l(每質粒具有I拷貝L鏈表達單位和I拷貝H鏈表達單位)和2拷貝L鏈表達質粒phGC33CAGl(每質粒具有2拷貝L鏈表達單位和I拷貝H鏈表達單位)(圖1)。[0122]【實施例2:人源化抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體穩(wěn)定表達細胞株的制備】[0123]通過電穿孔法將phGC33CAG#l或phGC33CAGl導入CHO細胞的DXBll株中。接著，通過將細胞在400μg/mL的G418存在下培養(yǎng)來篩選出導入了表達質粒的細胞。為旨在基因擴增表達質粒，接著在10~IOOnMMTX存在下的進行培養(yǎng)。[0124]獲得了4株導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株和5株導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株，通過將它們在125mL皿中分批培養(yǎng)來進行比較。在以下條件下進行培養(yǎng):培養(yǎng)液50mL、初始細胞密度2XIO5細胞/mL，培養(yǎng)溫度37°C，震蕩速度llOrpm。在開始培養(yǎng)后的第3、5、6、7天測定培養(yǎng)液中的抗體濃度，進行比較。4株導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株的第7天的抗體產(chǎn)量為約60~260μg/mL。另一方面,5株導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株的第7天的抗體產(chǎn)量為約420~690μg/mL。導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株的抗體產(chǎn)量比導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株的抗體產(chǎn)量提高了2倍以上(圖2)。[0125]由此確認，相對I拷貝H鏈，向宿主細胞中導入2拷貝L鏈比以往向宿主細胞中導入I拷貝L鏈抗體產(chǎn)量提高。[0126]【實施例3:人源化抗人IL-6R抗體穩(wěn)定表達細胞株的制備】[0127]分別向W092/019759中所述人源化抗人IL-6R抗體H鏈基因及人源化抗人IL-6R抗體L鏈基因上游結合CAG啟動子，在更下游結合小鼠β球蛋白多聚A而制成H鏈表達單位和L鏈表達單位。在整合了新霉素抗性基因和dhfr的pBluescript上結合H鏈表達單位和L鏈表達單位，從而制成I拷貝L鏈表達質粒(由人源化抗人IL-6R抗體基因的I拷貝H鏈和I拷貝L鏈構成)和2拷貝L鏈表達質粒(由人源化抗人IL-6R抗體基因的I拷貝H鏈和2拷貝L鏈構成)(圖3)，并通過電穿孔法導入CHO細胞DXBll株中。接著，通過在400μg/mLG418存在下進行培養(yǎng)來篩選出導入了表達質粒的細胞株。[0128]獲得了176株導入了I拷貝L鏈表達質粒的細胞株和176株導入了2拷貝L鏈表達質粒的細胞株，通過將它們在24孔板中分批培養(yǎng)來進行比較。在以下條件下培養(yǎng)條件:培養(yǎng)液0.7mL，培養(yǎng)溫度37°C，震蕩速度160rpm。在開始培養(yǎng)后第12天測定培養(yǎng)液中的抗體濃度，并按抗體產(chǎn)量排序，并進行了組間比較(圖4)。總的來說，結果是導入了2拷貝L鏈質粒的細胞的產(chǎn)量高于導入了I拷貝L鏈質粒的細胞的產(chǎn)量。[0129]由此確認，相對I拷貝H鏈，向宿主細胞中導入2拷貝L鏈比以往向宿主細胞中導入I拷貝L鏈抗體產(chǎn)量提高。[0130]本發(fā)明可應用到所有抗體產(chǎn)生細胞中。[0131]將本說明書中引用的所有刊物、專利及專利申請整體并入本說明書中。[0132]【工業(yè)實用性】[0133]本發(fā)明可用于抗體生產(chǎn)。[0134]【序列表】[0135]<SEQIDNO:1>[0136]SEQIDNO:1不具有與小鼠H鏈可變區(qū)基因互補的喊基序列的引物序列。[0137]<SEQIDNO:2>[0138]SEQIDNO:2不具有與小鼠L鏈可變區(qū)基因互補的喊基序列的引物序列。[0139]本說明書還包括下列內容:[0140]1.制備抗體或其片段的方法，包括:使用所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來產(chǎn)生抗體或其片段。[0141]2.項目I的方法，其中所述所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞是導入以下載體的細胞，所述載體含I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA。[0142]3.項目2的方法，其中所述細胞是動物細胞。[0143]4.項目3的方法，其中所述動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞。[0144]5.項目I~4中任一項的方法，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[0145]6.項目I~5中任一項的方法，其中所述抗體選自:抗IL-6受體抗體、抗IL_6抗體、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗⑶IIa抗體、抗VEGF抗體及抗VLA4抗體。[0146]7.制備藥物的方法，該藥物包含通過項目I~6中任一項的方法制備出的抗體或其片段。[0147]8.重組載體，其含有I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA。[0148]9.細胞，其中導入有項目8的載體。[0149]10.培養(yǎng)的細胞，其中所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多。[0150]11.制備抗體或其片段的方法，包括:使用以下細胞來產(chǎn)生抗體或其片段，所述細胞的特征是:與抗體H鏈或其片段相比，高表達抗體L鏈或其片段。[0151]12.項目I~7、11中任一項的方法，其中所述細胞是穩(wěn)定表達抗體或其片段的細胞。[0152]13.項目9或10的細胞，其穩(wěn)定表達抗體或其片段?！緳嗬蟆?.制備抗體或其片段的方法，包括:使用所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞來產(chǎn)生抗體或其片段，其中所述抗體的免疫球蛋白類別是IgGl、IgG2或IgG3。2.權利要求1的方法，其中所述所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多的細胞是導入以下載體的細胞，所述載體含I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA。3.權利要求2的方法，其中所述細胞是動物細胞。4.權利要求3的方法，其中所述動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞。5.權利要求1~4中任一項的方法，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。6.權利要求1的方法，其中所述抗體選自:抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗⑶3抗體、抗⑶20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗⑶25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗⑶33抗體、抗⑶52抗體、抗IgE抗體、抗⑶IIa抗體、抗VEGF抗體及抗VLA4抗體。7.制備藥物的方法，該藥物包含通過權利要求1~6中任一項的方法制備出的抗體或其片段。8.重組載體，其含有I拷貝編碼抗體H鏈或其片段的DNA和2拷貝以上編碼抗體L鏈或其片段的DNA，其中所述抗體的免疫球蛋白類別是IgGl、IgG2或IgG3。9.細胞,其中導入有權利要求8的載體。10.培養(yǎng)的細胞，其中所含編碼抗體L鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)比編碼抗體H鏈或其片段的外源DNA的拷貝數(shù)多，其中所述抗體的免疫球蛋白類別是IgGl、IgG2或IgG3。11.制備抗體或其片段的方法，包括:使用以下細胞來產(chǎn)生抗體或其片段，所述細胞的特征是:與抗體H鏈或其片段相比，高表達抗體L鏈或其片段，其中所述抗體的免疫球蛋白類別是IgGl、IgG2或IgG3。12.權利要求1的方法，其中所述細胞是穩(wěn)定表達抗體或其片段的細胞。13.權利要求9或10的細胞，其穩(wěn)定表達抗體或其片段?！疚臋n編號】C12P21/00GK103540632SQ201310401442【公開日】2014年1月29日申請日期:2008年10月14日優(yōu)先權日:2007年10月15日【發(fā)明者】山田良樹,喜安達也,田畑和之,葛卷章浩,山城舞申請人:中外制藥株式會社