沙門氏菌熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，包括DNA提取液、PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶混合液、沙門氏菌陽性對(duì)照、陰性對(duì)照；其特征引物序列為：F?Sequence(5’-3’)：TTACCCGATTCGCCTTTG?R?Sequence(5’-3’)：GGAACTTGTTGAATACCCAG探針：TGTTTCTGCTTTCAATACTGCCTCTCModification：5’6-FAM，3’BHQ1；采用此試劑盒對(duì)被測(cè)樣品中沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，方便快捷。
【專利說明】沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，屬于生物科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)，于 1996 年由美國Applied Biosystems公司推出，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法；該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，目前已得到廣泛應(yīng)用。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]一種沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，包含標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、TaqDNA聚合酶和UNG酶混合液、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，其目的在于克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0005]根據(jù)沙門氏菌保守序列設(shè)計(jì)特異的引物和探針，當(dāng)樣品中含有沙門氏菌時(shí)，前增菌后提取的沙門氏菌DNA通過PCR成指數(shù)擴(kuò)增，在反應(yīng)過程中沙門氏菌特異的熒光探針跟革巴核酸雜交，同時(shí)被Taq酶水 解,把探針上的突光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開,從而通過突光增量來實(shí)時(shí)判斷沙門氏菌的存在。
[0006]1、根據(jù)沙門氏菌管家基因設(shè)計(jì)引物和探針。
[0007]引物:
[0008]F Sequence (5’ -3’ ):TTACCCGATTCGCCTTTG Tm55.02
[0009]R Sequence(5’ -3’ ):GGAACTTGTTGAATACCCAG Tm55.75
[0010]探針:TGTTTCTGCTTTCAATACTGCCTCTC
[0011]Modification:5’ 6_FAM，3，BHQl
[0012]2、沙門氏菌增菌液DNA的制備(水煮法)。
[0013]a將沙門氏菌于肉湯營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上劃線分離,置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0014]b挑取單菌落于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí):
[0015]c加入終濃度為0.5%的甲醛溶液置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中滅活24小時(shí)。
[0016]d將滅活的菌液置于離心機(jī)中1000Or / min離心2min，棄上清，用雙蒸水洗兩次，加入適量雙蒸水搖勻；
[0017]e置于金屬浴中煮沸備用。[0018]3、核酸擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】:
[0019]下面通過具體實(shí)例應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
[0020]以下通過實(shí)例更詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行解釋，為更好地理解本發(fā)明提供依據(jù)。
[0021]1、靈敏度:檢測(cè)的最高稀釋度可達(dá)10-8~10-7，定量檢測(cè)線性范圍可達(dá)10-1010拷貝/ ml。
[0022]2、特異性:采用最新基因序列數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)，并通過系統(tǒng)驗(yàn)證，本試劑盒能夠檢測(cè)所有已知沙門氏菌毒株。對(duì)于其它菌株，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性。
[0023]實(shí)施例1
[0024]檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)估
[0025]檢測(cè)方法靈敏度評(píng)估
[0026]通過對(duì)市面上購買來的40份食品樣品采用細(xì)胞培養(yǎng)、常規(guī)PCR、熒光定量PCR3種方法檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行比較驗(yàn)證，結(jié)果熒光定量PCR法對(duì)LM的檢出率為1215%，高于常規(guī)PCR的1010%和細(xì)菌培養(yǎng)分離的510%;如采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌分離，雖然是一種經(jīng)典方法，但全過程至少需要4~7d，通常檢出限為1000cfu / ml，而采用本方法，檢出限為IOcfu / ml ο
[0027]實(shí)施例2
[0028]臨床樣品中沙門氏菌的熒光定量PCR檢測(cè):
[0029]檢測(cè)樣本類型:
[0030]肛拭子、糞便等。
[0031]適用儀器:
[0032]ABI系列突光定量PCR儀、Roche系列突光定量PCR儀、Qiagen Rotor Gene等突光定量PCR儀。
【權(quán)利要求】
1.一種沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，包括DNA提取液、PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶混合液、沙門氏菌陽性對(duì)照、陰性對(duì)照；其特征在于，PCR反應(yīng)液中所含沙門氏菌特異性引物序列和探針，所述引物與探針如下: 上游引物序列:Sequence(5’ _:3’ ):TTACCCGATTCGCCTTTG 下游引物序列:RSequence(5’ _:3’ ):GGAACTTGTTGAATACCCAG
探針:TGTTTCTGCTTTCAATACTGCCTCTC Modification:5，6_FAM，3，BHQl0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒PCR反應(yīng)液中所含10XBuffer2.5 μ L /反應(yīng)，Mg離子濃度為800 μ M，dNTP濃度為400 μ M，上下游引物濃度為0.2 μ Μ，探針濃度為0.3 μ M，Taq酶和UNG酶混合液中Taq酶濃度為50U / μ L，UNG酶濃度為2U / μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于包含以下步驟: a取增菌液Iml加到1.5ml無菌離心管中，10, OOOrpm離心5min,棄去上清；加入50ulDNA提取液，充分混勻后沸水浴5min，13，OOOrpm離心5min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)或保存于-20°C以待檢測(cè)。 b將PCR反應(yīng)液置室溫平衡，融化后取Taq酶和UNG酶混合液，按I μ L /管加入酶混合液，即每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制為=PCR反應(yīng)液20ul+lul Taq酶。 c加入模板:將保存在_20°C的核酸提取物置室溫解凍，以13，OOOrpm離心5min ;陰、陽性對(duì)照使用前置室溫解凍；在每個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入步驟I中處理過的模板或陰、陽性對(duì)照各4uL，蓋好管蓋，置于PCR儀上，記錄相應(yīng)樣品號(hào)。` d上機(jī)擴(kuò)增、檢測(cè)區(qū):反應(yīng)條件為50°C:2min，l個(gè)循環(huán)；95°C:3min，I個(gè)循環(huán)；95°C:5sec，55°C:60sec (信號(hào)采集)，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系設(shè)為25ul。e檢測(cè)樣本Ct值< 35.0時(shí)，報(bào)告陽性； 檢測(cè)樣本Ct值> 35.0且Ct值< 40時(shí)，需重復(fù)檢測(cè)一次，如果Ct值仍< 40，但曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長特性，報(bào)告本陽性，否則報(bào)告陰性；樣本不顯示Ct值時(shí)，報(bào)告陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的檢測(cè)方法，其特征在于其反應(yīng)體系為: 組分終濃度 上游引物:0.16 μ M 下游引物:0.16 μ M 探針:0.24 μ M dNTP:320 μ M dUTP:320 μ M Mg:640μ M IOXBuffer:1 X Taq酶:5U /反應(yīng) UNG酶:0.2U /反應(yīng) 模板:4uL 水:補(bǔ)至25uL。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103484548SQ201310435909
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月15日
【發(fā)明者】董紹旺, 王紹文, 劉欽松, 張艷杰, 郭濤, 郭寶柱 申請(qǐng)人:山東博奧克生物科技有限公司