一種人白介素28b基因多態(tài)性熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)人白介素28B（IL28B）基因多態(tài)性的試劑盒。它在單個(gè)反應(yīng)管中采用3條引物擴(kuò)增rs12979860基因CC型和TT型序列，通過(guò)2條不同波長(zhǎng)MGB熒光探針檢測(cè)該基因的CC型和TT型。試劑盒操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于臨床丙型肝炎患者IL28Brs12979860基因多態(tài)性檢測(cè)，進(jìn)而預(yù)測(cè)抗病毒藥物治療效果。
【專利說(shuō)明】—種人白介素28B基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人白介素28B基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人白介素28B基因(Interleukin 28B, IL28B)位于人第19號(hào)染色體短臂(19ql3)，編碼干擾素λ 3 (INF-λ 3)參與人體抗病毒免疫反應(yīng)，IL28B能刺激干擾素釋放，增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量，目前研究表明IL28B基因上游約3kb附近的單核苷酸多態(tài)性(SNP) rsl2979860與聚乙二醇干擾素、利巴韋林聯(lián)合治療丙型肝炎的效果顯著(TanakaY, et al，Nat Genet，2009，41:1105-1109)，其中 rsl2979860 多態(tài)性 CC 型比 CT 雜合型、TT型丙型肝炎或者的病毒清除率高2~3倍、且CC型比非CC型丙型肝炎患者獲得顯著增高的持續(xù)病毒反應(yīng)與治療終末反應(yīng)(J Hepatol, 2011, 55:692-701 ； Nature, 2009,461:798-801 ；Antivir Ther，2011，16:141-47)。因此，丙型肝炎患者在抗病毒治療前，檢測(cè)與確定IL28B rsl2979860基因多態(tài)性亞型，可以預(yù)測(cè)抗病毒藥物療效，有助于臨床選擇治療方案，如選擇抗病毒藥物的種類和決定治療持續(xù)的時(shí)間，同時(shí)還可用于肝移植前的供體篩查、復(fù)發(fā)性丙型肝炎患者的管理。
[0003]基因測(cè)序是檢測(cè)IL28B rsl2979860基因多態(tài)性的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是具有操作技術(shù)要求高、檢測(cè)靈敏度低、不能區(qū)分雜合型的缺點(diǎn)，近年來(lái)也有利用等位基因特異性PCR(AS-PCR)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、熔解曲線或高分辨率熔解曲線分析(HRM)方法檢測(cè)IL28Brsl2979860 基因多態(tài)性的文獻(xiàn)報(bào)道(J Molecular Diagnostics, 2011,13(4):446-51;J Clin Microbiol，2012:50:3353-55 ;中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36 (I):59-62 和 36 (8):722-26)，其中AS-PCR需要用凝膠電泳觀察條帶大小判斷結(jié)果，檢測(cè)靈敏度低、操作不方便；文獻(xiàn)報(bào)道的熒光PCR檢測(cè)或者采用單波長(zhǎng)分管檢測(cè)不同rsl2979860基因亞型、操作復(fù)雜，或者使用單管檢測(cè)但存在不同亞型交叉影響的問(wèn)題，而HRM分析對(duì)儀器要求較高，多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果受儀器影響，這些檢測(cè)方法存在的不足限制了 IL28B rsl2979860基因多態(tài)性檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種單管檢測(cè)人白介素28B基因(IL28B)多態(tài)性的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用3條引物擴(kuò)增IL28B rsl2979860基因CC型和TT型序列，通過(guò)2條不同波長(zhǎng)MGB熒光探針檢測(cè)該基因的CC型和TT型；3條引物具有SEQ ID N0:1~3的序列，2條熒光探針具有SEQ ID NO:4和5的序列，SEQ ID NO:4序列探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)、SEQ ID N O:5序列探針5’端標(biāo)記JOE或HEX或VIC熒光基團(tuán)，探針3’端均標(biāo)記MGB-NFQ基團(tuán)；上述引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本發(fā)明通過(guò)雙波長(zhǎng)TaqMan MGB探針熒光PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)單管檢測(cè)IL28B rsl2979860基因多態(tài)性，區(qū)分CC型、TT型以及雜合型，試劑盒使用簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于臨床丙型肝炎患者IL28B rsl2979860基因多態(tài)性檢測(cè)，進(jìn)行抗病毒治療效果預(yù)測(cè)。
[0005]技術(shù)方案
通過(guò)對(duì)GenBank中人IL28B rsl2979860基因序列查詢，用Vector NT1、Oligo等軟件對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)，按照TaqMan MGB熒光PCR設(shè)計(jì)的原則，優(yōu)選了 2條上游引物和I條下游引物擴(kuò)增rsl2979860基因CC型和TT型核苷酸序列中的66 bp片段、2條MGB探針?lè)謩e檢測(cè)該基因的CC型、TT型。上述引物探針設(shè)計(jì)具有如下特點(diǎn):
具有SEQ ID NO:1和2序列的2條上游引物3’端末尾I~3個(gè)核苷酸位置設(shè)計(jì)了rsl2979860基因單核苷酸突變位點(diǎn)，分別配合共有下游引物擴(kuò)增CC型和TT型序列；具有SEQ ID NO:4和5序列的2條MGB探針3’端I~5個(gè)核苷酸分別與上游引物SEQ ID NO:I和2的3’端序列互補(bǔ)重疊，對(duì)應(yīng)檢測(cè)CC型和TT型。
[0006]3條引物和2條MGB熒光探針核苷酸序列(5’ -> 3’)如下:
CC 型上游引物(CCpf):gAgCTCCCCgAAggCgCg，序列記為 SEQ ID NO:1。
[0007]TT 型上游引物(TTpf):gAgCTCCCCgAAggCgTg，序列記為 SEQ ID NO:2。
[0008]下游共有引物(pr):ggCgAggggCTTTgCTgg ,序列記為 SEQ ID NO:3。
[0009]CC型熒光探針(CCprobe)=CAATTCAACCCTggTTCgC，序列記為 SEQ ID N0:4，其中探針 5’端標(biāo)記 FAM (6-carboxy-f Iuorescein)突光基團(tuán)、3’端標(biāo)記 MGB-NFQ (Minor groovebinder-nonfluorescent quencher)淬滅基團(tuán)。
[0010]TT 型熒光探針(TTprobe):CAATTCAACCCTggTTCACg，序列記為 SEQ IDNO:5，其中探針 5’ 端標(biāo)記 JOE (5-dichloro-dimethoxy-fIuorescein)或 HEX(5-hexachloro-fIuorescein)或 VIC 突光基團(tuán)、3’ 端標(biāo)記 MGB-NFQ 萍滅基團(tuán)。
[0011]上述引物探針序列也可以是和SEQ ID NO:1~5序列同源性大于85%以上的序列。
[0012]所述熒光PCR反應(yīng)體系各成分組成如下:Tris-HCl (pH8.3) 10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.2 mM、MgCl2 3 mM、3 條引物各 0.8 μ Μ、2 條 MGB 熒光探針各
0.2 μ M、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U，提取的模板10 μ 1，總反應(yīng)體積30 μ I。
[0013]所述熒光PCR 擴(kuò)增程序如下:50°C 2min、95°C IOmin 后按照 95°C 10sec、62°C35sec循環(huán)擴(kuò)增40次，循環(huán)步驟中62°C時(shí)采集FAM和JOE波長(zhǎng)熒光信號(hào)。
[0014]所述人IL28B基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)試劑盒質(zhì)控品包括陰性對(duì)照、CC型陽(yáng)性對(duì)照、TT型陽(yáng)性對(duì)照各I個(gè)，其中陰性對(duì)照為去離子水，CC型、TT型陽(yáng)性對(duì)照分別為人工構(gòu)建含有IL28B rsl2979860基因CC型、TT型擴(kuò)增片段的TA克隆質(zhì)粒，濃度為IO5 copy/ml。
[0015]通過(guò)上述設(shè)計(jì)優(yōu)選獲得的3條擴(kuò)增引物和2條熒光探針，本發(fā)明提供了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，優(yōu)化了 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。當(dāng)然本研究領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)熒光PCR的一般要求可以調(diào)整PCR反應(yīng)體系和程序，也同樣能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的目的。
[0016]有益效果
本發(fā)明根據(jù)上述設(shè)計(jì)的引物探針和技術(shù)方案，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件研制成人IL28B基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其主要特點(diǎn)如下:
(1)通過(guò)型特異性的引物探針特殊重疊設(shè)計(jì)，提高了試劑盒檢測(cè)的特異性。
[0017](2)通過(guò)反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化，在兩種基因型擴(kuò)增效率和非特異擴(kuò)增之間獲得平衡，提高了試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免因結(jié)果不準(zhǔn)確造成誤診。[0018](3)試劑盒實(shí)現(xiàn)了單管檢測(cè)IL28B rsl2979860基因多態(tài)性，使用簡(jiǎn)便快速，可在2小時(shí)內(nèi)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。
[0019](4)試劑盒擴(kuò)增體系中的dUTP - UNG酶系統(tǒng)避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽(yáng)性。
[0020]試劑盒的上述特點(diǎn)，均為采用特殊設(shè)計(jì)的IL28B rsl2979860基因多態(tài)性引物探針并與熒光PCR技術(shù)組合應(yīng)用而直接引起，實(shí)現(xiàn)rsl2979860 CC型和TT型檢測(cè)，本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計(jì)合理，可以廣泛應(yīng)用于臨床丙型肝炎患者的IL28B rsl2979860基因多態(tài)性檢測(cè)。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)技術(shù)常識(shí)對(duì)本發(fā)明作各種技術(shù)性改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0023]實(shí)施例1:1L28B基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)試劑盒引物探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢的人IL28B rsl2979860基因序列，采用VectorNT1、Oligo等引物設(shè)計(jì)軟件，優(yōu)選獲得的檢測(cè)引物探針序列如表1所示，引物對(duì)擴(kuò)增IL28Brsl2979860基因上66 bp片段。
[0024]表1設(shè)計(jì)的試劑盒EBV和內(nèi)參照檢測(cè)弓丨物探針
【權(quán)利要求】
1.一種單管檢測(cè)人白介素28B基因(IL28B)多態(tài)性的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用3條引物和2條MGB熒光探針檢測(cè)該基因rsl2979860的CC型和TT型，并且3條引物核苷酸序列分別為SEQ ID NO:1~3，2條熒光探針核苷酸序列分別為SEQ ID NO:4和5，SEQ ID NO:4序列探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)、SEQ ID NO:5序列探針5’端標(biāo)記JOE或HEX或VIC熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo)記MGB-NFQ淬滅基團(tuán)；上述引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，使用的3條引物中有2條上游引物(SEQID N0:1和2)和I條下游引物(SEQ ID NO:3), IL28B rsl2979860基因單核苷酸突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在SEQID NO:1和2上游引物的3’端末尾I~3個(gè)核苷酸位置，輔以共有的下游引物分別擴(kuò)增CC型和TT型。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，使用SEQID NO:4和5這2條MGB熒光探針序列的3’端I~5個(gè)核苷酸分別與上游引物SEQ ID NO:1和2的3’端序列互補(bǔ)重疊，對(duì)應(yīng)檢測(cè)CC型和TT型。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述熒光PCR反應(yīng)液各成分終濃度為:Tris-HCl(pH8.3) 10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.2 mM、MgCl2 3 mM、3 條引物各 0.8y M、2條MGB熒光探針各0.2 ii M、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U，提取的模板10 yl，總反應(yīng)體積30ii I。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?50°C2min、95°C IOmin后按照95°C IOsec、62°C 35sec循環(huán)擴(kuò)增40次，循環(huán)步驟中62°C時(shí)采集FAM和JOE波長(zhǎng)熒光信號(hào)。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其質(zhì)控品包括陰性對(duì)照、CC型陽(yáng)性對(duì)照、TT型陽(yáng)性對(duì)照各I個(gè)。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667514SQ201310751791
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】吳大治, 夏懿, 吳梅 申請(qǐng)人:上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司