一種檢測香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：（1）將每株待測組培苗置于45mL水培營養(yǎng)液中培養(yǎng)至根長達(dá)10厘米，每1-4天更換水培營養(yǎng)液；（2）接種5mL分生孢子濃度為1×105-1×107cfu/mL的待測香蕉枯萎病病原菌的菌懸液，28℃自然光照條件下培養(yǎng)3小時；（3）用50mL新的水培營養(yǎng)液替換原有液體，28℃自然光照條件下培養(yǎng)20-25天，期間每1-4天更換新的水培營養(yǎng)液；（4）切開球莖觀察褐變情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)判斷檢測待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力。本發(fā)明提供的方法可廣泛應(yīng)用于科研與生產(chǎn)。
【專利說明】一種檢測香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]香蕉是繼水稻、小麥、玉米之后的世界第四大糧食作物，也是全世界貿(mào)易量最大宗的鮮果。我國是香蕉的主產(chǎn)區(qū)之一，2009年香蕉總產(chǎn)量排名世界第二，香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展為我國國民經(jīng)濟(jì)的增長作出了重要貢獻(xiàn)。
[0003]香蕉枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌古巴?；退鸬恼婢酝羵骶S管束病害。香蕉枯萎病自1874年首次在澳大利亞被報(bào)道后迅速傳播，并陸續(xù)在許多其他香蕉的產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)。我國臺灣省于1967年首次發(fā)現(xiàn)該病后，立即大面積流行，現(xiàn)已在海南、云南、廣東、廣西和福建等省都有發(fā)現(xiàn)。蕉園中一旦有植株感染上該病，其發(fā)病率一般都高達(dá)在10% -40%,部分發(fā)病率高的蕉園只能荒廢，給我國香蕉產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失。
[0004]目前，關(guān)于香蕉枯萎病病原菌致病力的測定主要存在如下兩種方法:(I)通過沙床香蕉苗測定致病力；(2)通過盆栽香蕉苗測定致病力。以上兩種方法均存在很大的缺陷，沙床香蕉苗可能會由于沙子被污染，其中帶有雜菌或者根結(jié)線蟲等而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。盆栽香蕉苗成本高，不利于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，并且根部在土中生長，不便于觀察，發(fā)病情況對環(huán)境因素的依賴很大。由于以上種種原因，建立一個標(biāo)準(zhǔn)化的香蕉枯萎病病原菌致病力測定方法意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測香蕉枯萎病病原菌(又稱香蕉枯萎病致病菌)的致病力的方法。
[0006]本發(fā)明提供的檢測待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力的方法，依次包括如下步驟:
[0007](I)將每株待測香蕉品種的組培苗置于45mL水培營養(yǎng)液中培養(yǎng)至根長達(dá)10厘米，期間每1-4天更換新的所述水培營養(yǎng)液；所述水培營養(yǎng)液的制備方法如下:取900-1000mgCaC03、450-500mg KN03、100_150mg KH2P04、150_200mg MgSO4 和 10_20mg FeSO4,溶于純凈水并用純凈水定容至IL ；
[0008](2)完成所述步驟(1)后，接種5mL菌懸液，28°C自然光照條件下培養(yǎng)3小時；所述菌懸液為懸浮待測香蕉枯萎病病原菌的分生孢子得到的孢子濃度為I X IO5-1 X 107cfu/mL的菌懸液(具體可為lX106cfu/mL的菌懸液)；
[0009](3)完成所述步驟(2)后，用50mL新的所述水培營養(yǎng)液替換原有液體，28 °C自然光照條件下培養(yǎng)20-25天，期間每1-4天更換新的所述水培營養(yǎng)液；
[0010](4)完成所述步驟(3)后，切開球莖觀察褐變情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)判斷檢測待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力。
[0011]如果病情指數(shù)為0，說明待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種不致病。病情指數(shù)越高，待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力越高。
[0012]所述水培營養(yǎng)液的制備方法具體如下:取950mg CaC03、475mg KN03、125mgKH2P04、175mg MgSO4和15mg FeSO4，溶于純凈水并用純凈水定容至1L。
[0013]所述菌懸液的制備方法具體如下:取香蕉枯萎病病原菌的分生孢子，用含IOOmg/HiL硫酸鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基作為液相，得到孢子濃度為I X IO5-1 X 107cfu/mL的菌懸液(具體可為I X 106cfu/mL的菌懸液)。
[0014]所述香蕉枯萎病病原菌可為尖孢鐮刀菌古巴?；停唧w可為尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種或尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種。
[0015]所述香蕉品種可為巴西蕉或粉蕉。
[0016]所述組培苗具體可為吸芽的分生組織作為外植體得到的組培苗。
[0017]所述組培苗的制備方法依次包括如下步驟:
[0018]①取待測香蕉品種的分生組織，作為外植體；
[0019]②將步驟①得到的外植體接種于初代培養(yǎng)基，先28±2°C暗培養(yǎng)5-7天，然后28±2°C培養(yǎng)(每24小時的光照時間可為8-10小時，光照強(qiáng)度可為15001x) 20天；然后轉(zhuǎn)
接至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
[0020]所述初代培養(yǎng)基為含5.0mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基；所述增殖培養(yǎng)基為含3.0mg/L6-BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂的MS培
養(yǎng)基;
[0021]③完成所述繼代培養(yǎng)后(當(dāng)步驟②中的外殖體增殖芽達(dá)到一定數(shù)量時)，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，先28±2°C暗培養(yǎng)3-5天，然后28±2°C培養(yǎng)(每24小時的光照時間可為10-12小時，光照強(qiáng)度可為20001χ)，直至組培苗苗滿足如下標(biāo)準(zhǔn):假莖高2.5厘米以上，粗
0.3-0.4厘米；假莖淺綠色；具有2張以上自然平展的綠葉和2條以上白色的根，根長3厘米以上，有分叉?zhèn)雀透?br> [0022]所述生根培養(yǎng)基為含0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂和2g/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基。
[0023]所述外植體的制備方法具體如下:挖取待測香蕉品種植株的吸芽，剝除假莖上的部分葉鞘，切取2-3厘米長的莖尖，先用75% (體積分?jǐn)?shù))酒精水溶液浸泡洗滌15秒，再用
1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉或0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))升汞水溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗3次，然后在超凈工作臺上繼續(xù)逐葉剝除剩余的葉鞘，剝至高為1-1.5cm、直徑為1.2cm，再將分生組織從頂部往下均勻切成4塊，即為外植體。
[0024]本發(fā)明提供的方法克服了傳統(tǒng)方法對環(huán)境條件依賴大、致病力測定不穩(wěn)定、成本過高、容易污染等缺點(diǎn)，使得對病原菌致病力的測定簡單化、標(biāo)準(zhǔn)化，測定結(jié)果也方便觀察，可廣泛應(yīng)用于科研與生產(chǎn)。
[0025]本發(fā)明提供的方法的具體用途舉例如下:(I)在田間采樣分離得到的疑似病原菌可通過該方法進(jìn)行分離鑒定，并可對不同地點(diǎn)采集的香蕉枯萎病菌致病力強(qiáng)弱進(jìn)行測定；
(2)可通過水培不同品種的香蕉(如巴西蕉、粉蕉等)來鑒定香蕉枯萎病菌的不同生理小種；
(3)可通過接種綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的香蕉枯萎病菌來對該菌在香蕉植株中的侵染過程進(jìn)行觀察?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1為正常香蕉(左)與發(fā)病香蕉(右)的球莖縱切比較。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。巴西蕉:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種苗組培中心。粉蕉:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種苗組培中心。尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種:周端詠，劉一賢，謝德嘯等.香蕉枯萎病菌stel2基因的克隆與序列分析.熱帶作物學(xué)報(bào)[J].2011，32 (12):2298-2301。尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種:楊歆璇，羊玉花，楊臘英等.celex-100法快速提取鐮刀菌基因組DNA.公共植保與綠色防控[A].2010。
[0028]實(shí)施例1、檢測香蕉枯萎病原菌對巴西蕉的致病力
[0029]一、制備組培苗
[0030]1、制備外植體
[0031]挖取巴西蕉植株的吸芽，剝除假莖上的部分葉鞘，切取2-3厘米長的莖尖，先用75% (體積分?jǐn)?shù))酒精水溶液浸泡洗滌15秒(以殺死莖尖表面的病菌)，再用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉或0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))升汞水溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗3次，然后在超凈工作臺上繼續(xù)逐葉剝除剩余的葉鞘，剝至高為1-1.5cm、直徑為1.2cm，再將分生組織從頂部往下均勻切成4塊，即為外植體。
[0032]2、外植體的培養(yǎng)及增殖培養(yǎng)
`[0033]將步驟I得到的外植體接種于初代培養(yǎng)基，先28±2°C暗培養(yǎng)5-7天，然后28±2°C培養(yǎng)(每24小時的光照時間為8-10小時，光照強(qiáng)度為15001x) 20天；然后轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以促進(jìn)不定芽的增殖。
[0034]初代培養(yǎng)基:含5.0mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
[0035]增殖培養(yǎng)基:含3.0mg/L6-BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
[0036]3、生根培養(yǎng)
[0037]當(dāng)步驟2中的外殖體增殖芽達(dá)到一定數(shù)量時，將其轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，先28±2°C暗培養(yǎng)3-5天，然后28±2°C培養(yǎng)(每24小時的光照時間為10-12小時，光照強(qiáng)度為20001x)，直至組培苗苗滿足如下標(biāo)準(zhǔn):假莖高2.5厘米以上，粗0.3-0.4厘米；假莖淺綠色；具有2張以上自然平展的綠葉和2條以上白色的根，根長3厘米以上，有分叉?zhèn)雀透?；培養(yǎng)基面應(yīng)無菌絲等污染物。
[0038]生根培養(yǎng)基:含0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂和2g/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基。
[0039]二、檢測香蕉枯萎病病原菌對巴西蕉的致病力
[0040]實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為海南省?？谑校瑢?shí)驗(yàn)時間為7月份。
[0041]1、取步驟一得到的巴西蕉的組培苗，分別將每株組培苗置于含有45mL水培營養(yǎng)液的水培容器中培養(yǎng)至根長達(dá)到10厘米(通常需要5-10天，每2天更換一次水培營養(yǎng)液，注意假莖底部要高于水培營養(yǎng)液的液面)，然后接種5mL菌懸液，28°C自然光照條件下培養(yǎng)3小時。
[0042]水培營養(yǎng)液的制備方法:取950mg CaC03、475mg KN03、125mg KH2PO4、175mgMgS0jP15mg FeSO4，溶于純凈水并用純凈水定容至1L。
[0043]菌懸液的制備方法:取香蕉枯萎病病原菌(尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種或尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種)的分生孢子，用含lOOmg/mL硫酸鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基作為液相，得到孢子濃度為lX106cfu/mL的菌懸液。
[0044]2、完成步驟I后，用50mL新的所述水培營養(yǎng)液替換水培容器中的原有液體，28°C自然光照條件下培養(yǎng)，每2天更換一次所述水培營養(yǎng)液，20-25天左右切開球莖觀察褐變情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。
[0045]病情指數(shù)=(發(fā)病級數(shù)X該級株數(shù))/ (最高級數(shù)X總株數(shù))X 100%。
[0046]發(fā)病級數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn):0級:球莖內(nèi)部不變色；
[0047]I級:球莖內(nèi)部不變色，但根與球莖交接處變色；
[0048]2級:球莖內(nèi)部0-5%變色；
[0049]3級:球莖內(nèi)部6-20%變色；
[0050]4級:球莖內(nèi)部21-50%變色；
[0051]5級:球莖內(nèi)部50%以上變色；
[0052]6級:球莖內(nèi)部全 部變色；
[0053]7級:死株。
[0054]進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中對10株巴西蕉組培苗進(jìn)行試驗(yàn)。
[0055]通過統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，可以了解致病菌致病力強(qiáng)弱。尖孢鐮刀菌古巴專化型I號生理小種不能對巴西蕉致病(即所有組培苗的發(fā)病級數(shù)均為O級，病情指數(shù)為0)，尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種能對巴西蕉致病(病情指數(shù)為40%)。
[0056]正常香蕉(左)與發(fā)病香蕉(右)的球莖縱切比較見圖1。
[0057]實(shí)施例2、檢測香蕉枯萎病原菌對粉蕉的致病力
[0058]一、制備組培苗
[0059]用粉蕉植株代替巴西蕉植株，方法同實(shí)施例1的步驟一。
[0060]二、檢測香蕉枯萎病病原菌對粉蕉的致病力
[0061]實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為海南省?？谑?，實(shí)驗(yàn)時間為7月份。
[0062]用步驟一制備的粉蕉的組培苗代替巴西蕉的組培苗，方法同實(shí)施例1的步驟二。
[0063]進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中對10株粉蕉組培苗進(jìn)行試驗(yàn)。
[0064]通過統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，可以了解致病菌致病力強(qiáng)弱。尖孢鐮刀菌古巴專化型I號生理小種能對粉蕉致病(病情指數(shù)為40%)，尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種能對粉蕉致病(病情指數(shù)為40%)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力的方法，依次包括如下步驟: (O將每株待測香蕉品種的組培苗置于45mL水培營養(yǎng)液中培養(yǎng)至根長達(dá)10厘米，期間每1-4天更換新的所述水培營養(yǎng)液；所述水培營養(yǎng)液的制備方法如下:取900-1000mgCaC03、450-500mg KN03、100_150mg KH2P04、150_200mg MgSO4 和 10_20mg FeSO4,溶于純凈水并用純凈水定容至IL ； (2)完成所述步驟(1)后，接種5mL菌懸液，28°C自然光照條件下培養(yǎng)3小時；所述菌懸液為懸浮待測香蕉枯萎病病原菌的分生孢子得到的孢子濃度為lX105-lX107cfu/mL的菌懸液； (3)完成所述步驟(2)后，用50mL新的所述水培營養(yǎng)液替換原有液體，28°C自然光照條件下培養(yǎng)20-25天，期間每1-4天更換新的所述水培營養(yǎng)液； (4)完成所述步驟(3)后，切開球莖觀察褐變情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)判斷檢測待測香蕉枯萎病病原菌對待測香蕉品種的致病力。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述水培營養(yǎng)液的制備方法如下:取950mgCaC03、475mg KN03、125mg KH2PO4U75mg MgS0dP15mg FeSO4,溶于純凈水并用純凈水定容至IL0
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述菌懸液為孢子濃度為IXlO6Cfu/HlL的菌懸液。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述菌懸液的制備方法如下:取香蕉枯萎病病原菌的分生孢子，用含lOO`mg/mL硫酸鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基作為液相，得到菌懸液。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述香蕉枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述香蕉枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種或尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述香蕉品種為巴西蕉或粉蕉。
【文檔編號】C12R1/77GK103497989SQ201310443260
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】黃俊生, 毛超, 楊臘英, 梁昌聰, 郭立佳, 劉磊, 王國芬 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所