豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑及其使用方法。該保護(hù)劑由蔗糖、PVP-K30和磷酸鹽緩沖液組成，使用方法是將該保護(hù)劑與含病毒培養(yǎng)液按100:1~10:1的體積比混合后保存病毒即可，能夠在冷藏或冷凍的保存環(huán)境下降低病毒死亡率，尤其可防止病毒因反復(fù)凍融而造成的死亡。
【專利說明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞病毒學(xué)及獸用疫苗學(xué)，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種急性、熱性、接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠母豬和I月齡以內(nèi)的仔豬最易感，以繁殖障礙、呼吸困難、耳朵藍(lán)紫、并發(fā)其他傳染病為主要特征(馬紅艷，郝永清，豬繁殖與呼吸綜合征的研究，畜牧與飼料科學(xué)，2007，28 (4):43-45)。該病從20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)以來，已給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(吳佳俊等，豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗研究進(jìn)展，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32 (8):655-658)。2006年4月，我國南方地區(qū)暴發(fā)了一種以持續(xù)高熱、食欲廢絕、身體發(fā)紺、藍(lán)耳、腹瀉為特征,高發(fā)病率和高死亡率,傳播迅速的高致病性藍(lán)耳病(Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，波及全國25個省份，經(jīng)濟(jì)損失巨大，研究證明引發(fā)該病的主要病原是高致病性PRRSV，鑒于該病的嚴(yán)重危害性，我國于2008年底在新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將其列為一類動物疫病(韋天超，2009)。
[0003]為了有效地控制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，該病發(fā)生后，國內(nèi)迅速開展對該病毒的研究，疫苗是防控該病的主要技術(shù)手段，雖然已有多種商品化的疫苗面世，但由于該PRRSV是單股RNA病毒，具有極強(qiáng)的變異性，毒株間存在顯著的抗原差異性，交叉保護(hù)性差，故要不斷檢測研究該病毒的變化，更新疫苗。而PRRSV病毒的穩(wěn)定性受pH和溫度的影響較大，在pH小于5或大于7的條件下，其感染力降低95%以上(寧宜寶，《獸用疫苗學(xué)》中國農(nóng)業(yè)出版社)。為了更好地研究該病毒及生產(chǎn)出有效疫苗，就要做大量的動物實驗，重復(fù)性實驗，為保持實驗的準(zhǔn)確性科學(xué)性，病毒的保存很重要。
[0004]凍干是保存病毒較好的方式，但在實驗室的研究和田間試驗階段，凍干批量大成本高，很沒有必要。而一般是直接置于-20°C或-70°C冰箱凍存病毒液，病毒液的主要成分是含NaHCO3的培養(yǎng)基，NaHCO3在空氣中易分解成CO2溢出而使溶液變堿，從而使病毒容易凋亡；另外培養(yǎng)基中還含有大量氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，容易分解使培養(yǎng)液性質(zhì)改變，最終導(dǎo)致保護(hù)效果較差，病毒感染力下降較快，影響實驗的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何提供一種病毒保護(hù)劑以便更好地保存PRRSV，使其在實驗研究過程中或保存時保護(hù)病毒使其病毒含量下降減緩。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，該保護(hù)劑由蔗糖、PVP-K30和磷酸鹽緩沖液(PBS)組成。[0007]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述的磷酸鹽緩沖液，pH值在7.0-7.4 之間。
[0008]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述蔗糖的濃度大于5%(w/V)。
[0009]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述PVP-K30的濃度大于2% (w/V)。
[0010]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述磷酸鹽緩沖液為每1000mL超純水中溶解氯化鈉8.0~8.5g ;氯化鉀0.2g ;十二水合磷酸氫二鈉3.58~3.63g或無水磷酸氫二鈉1.44~1.56g ；以及磷酸二氫鉀0.2~0.24g，用HCl或NaOH調(diào)pH值為7.0~7.4配制而成。
[0011]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述每1000mL超純水中溶解氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、十二水合磷酸氫二鈉3.63g以及磷酸二氫鉀0.24g。
[0012]更優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑中，所述蔗糖的濃度大于5%(w/V)，所述PVP-K30的濃度大于2%(w/v)。
[0013]更優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，經(jīng)過121 °C高壓滅菌20~30mino
[0014]本發(fā)明還提供 了以上所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑的使用方法，是將該保護(hù)劑與含病毒培養(yǎng)液(即病毒液)按100:f 10:1的體積比混合后保存。
[0015]優(yōu)選地，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑的使用方法，是通過添加磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)保護(hù)劑與含病毒培養(yǎng)液的混合液中蔗糖的終濃度為5%(w/v)，PVP-K30的終濃度為 2% (w/V)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明的病毒保護(hù)劑以PBS為母液，可使病毒液的pH值穩(wěn)定，不至于因酸堿劇烈變化導(dǎo)致病毒死亡，添加的蔗糖和PVP-K30防凍劑，可以防止病毒因反復(fù)凍融而死亡，顯著降低病毒經(jīng)凍存或冷藏保存后的死亡率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為多種自配的保護(hù)劑與病毒液混合液在4°C狀態(tài)下保存的病毒含量變化，其中A =DMEM液；B:PBS液；C:含2%(w/v)蔗糖的保護(hù)液；D:含5%(w/v)蔗糖的保護(hù)液；E:含5%(w/v)鹿糖和 2%(w/v)PVP-K30 的保護(hù)液。
[0018]圖2為多種自配的保護(hù)劑與病毒液混合液在_20°C狀態(tài)下保存的病毒含量變化，其中A =DMEM液；B:PBS液；C:含2%(w/v)蔗糖的保護(hù)液；D:含5%(w/v)蔗糖的保護(hù)液；E:含5% (w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液。
[0019]圖3為多種保護(hù)劑與病毒液混合液在4°C狀態(tài)下保存的病毒含量變化，其中A:DMEM液；B:PBS液；C:含5%(w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液；D:商品苗I稀釋液；E:商品苗2稀釋液；F:商品苗3稀釋液；G:商品苗4稀釋液。
[0020]圖4為多種保護(hù)劑與病毒液混合液在_20°C狀態(tài)下保存的病毒含量變化，其中A:DMEM液；B:PBS液；C:含5%(w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液；D:商品苗I稀釋液；E:商品苗2稀釋液；F:商品苗3稀釋液；G:商品苗4稀釋液。【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0022]實施例1
以PBS為母液配制一定高濃度的蔗糖溶液和PVP-K30溶液待用，然后按照實驗所需的病毒含量(TCID5tl),用這些含保護(hù)劑成分的溶液將病毒液稀釋，使蔗糖的終濃度為5%(w/v)，PVP-K30的終濃度為2% (w/v)，不足再添加PBS液，即可。
[0023]本發(fā)明保護(hù)劑的制備:
(I)磷酸緩沖液(PBS)的制備:稱取氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，十二水合磷酸氫二鈉3.63g和磷酸二氫鉀0.24g，加超純水至1000mL,充分溶解，用HCl或NaOH調(diào)pH值為7.0~7.4，121。。滅菌 30min。
[0024](2) 40%(w/v)蔗糖溶液的制備:稱取40g蔗糖溶于IOOmL步驟(1)的PBS液中，121°C高壓滅菌30min。
[0025] (3) 20% (w/v) PVP-K30 溶液的制備:稱取 20g PVP-K30 溶于 IOOmL 步驟(1)的 PBS液中，121。。高壓滅菌30min。
[0026]例如現(xiàn)有PRRSV病毒液IgTCID5tl為7.50/mL,要將它稀釋50倍后保存用于往后的動物實驗，每瓶(批)50mL。即每瓶:取
病毒液ImL ；
40% (w/v)的鹿糖溶液6.25mL ;
20%(w/v)的 PVP-K30 溶液 5mL;
PBS 液37.75mL,
以上溶液混合均勻即成為蔗糖終濃度為5%(w/v) ,PVP-K30終濃度為2% (w/v)的保護(hù)液(保護(hù)劑與病毒液的體積比為49:1)。
[0027]用上述步驟(2)的蔗糖溶液和步驟(1)的PBS液，與病毒液按49:1的體積比混合，配制成含2%(w/v)或5%(w/v)蔗糖的保護(hù)液；用步驟(2)的蔗糖溶液、步驟(3)的PVP-K30溶液和步驟(1)的PBS液，與病毒原液按49:1的體積比混合，配制成含5% (w/v)蔗糖和2% (w/v)PVP-K30的保護(hù)液；另外選取DMEM液、PBS液、商品苗I稀釋液、商品苗2稀釋液、商品苗3稀釋液和商品苗4稀釋液，分別與病毒按相同體積比(49:1)混合，在4°C和-20°C下進(jìn)行病毒保護(hù)試驗，結(jié)果見圖1~4，其中_20°C條件下凍存的樣品每測定一次即解凍一次，樣品共經(jīng)過9次凍融。
[0028]圖1顯示在4°C條件下，病毒保存81天后，C (含2%(w/v)蔗糖的保護(hù)液)、E (含5%(w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液)曲線下降平緩，說明兩者效果較好。
[0029]圖2顯示在_20°C條件下，病毒保存123天后，E (含5%(w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液)曲線最平穩(wěn)，在長時間的反復(fù)凍融過程中仍能對病毒產(chǎn)生較好的保護(hù)。
[0030]圖3顯示在4°C條件下，病毒保存81天后，C (含5% (w/v)蔗糖和2% (w/v) PVP-K30的保護(hù)液)、E (商品苗2稀釋液)、F (商品苗3稀釋液)曲線下降平緩，說明三者效果較好。
[0031]圖4顯示在_20°C條件下，病毒保存123天后，C (含5%(w/v)蔗糖和2%(w/v)PVP-K30的保護(hù)液)曲線最平穩(wěn)，在長時間的反復(fù)凍融過程中仍能對病毒產(chǎn)生較好的保護(hù)。[0032]試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的保護(hù)劑對病毒的保護(hù)效果最好，特別是在反復(fù)凍融的情況下。
[0033]實施例2
(I)磷酸緩沖液(PBS)的制備:稱取氯化鈉8.5 g，氯化鉀0.2g，十二水合磷酸氫二鈉3.58g和磷酸二氫鉀0.2g，加超純水至1000mL,充分溶解，用HCl或NaOH調(diào)pH值為7.0~7.4，121。。滅菌 30min。 [0034](2) 30%(w/v)蔗糖溶液的制備:稱取30g蔗糖溶于IOOmL步驟(1)的PBS液中，121°C高壓滅菌30min。
[0035](3) 20% (w/v) PVP-K30 溶液的制備:稱取 20g PVP-K30 溶于 IOOmL 步驟(1)的 PBS液中，121。。高壓滅菌30min。
[0036]取IgTCID5tl 為 ?.50/mLPRRSV 病毒液 lmL、30%(w/v)的蔗糖溶液 20mL、20%(w/v)的PVP-K30溶液IOmL和PBS液70mL，配制成保護(hù)劑與病毒液體積比為100:1的保護(hù)液，作為實驗組I ;取IgTCID50為7.50/mLPRRSV病毒液ImL加入病毒培養(yǎng)液IOOmL混合作為陰性對照組I。
[0037]取IgTCID5tl 為 7.50/mLPRRSV 病毒液 10mL、30%(w/v)的蔗糖溶液 20mL、20%(w/v)的PVP-K30溶液IOmL和PBS液70mL，配制成保護(hù)劑與病毒液體積比為10:1的保護(hù)液，作為實驗組2 -M IgTCID50為7.50/mLPRRSV病毒液IOmL加入病毒培養(yǎng)液IOOmL混合作為陰性對照組2。
[0038]以上四組分別于_20°C和4°C條件下進(jìn)行保存實驗，結(jié)果顯示實驗組I和2在經(jīng)過30天的保存后病毒死亡率均明顯低于陰性對照組I和2。
【權(quán)利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，該保護(hù)劑由蔗糖、PVP-K30和磷酸鹽緩沖液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液，PH值在7.0-7.4之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，所述蔗糖的濃度大于5%(w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，所述PVP-K30的濃度大于2%(w/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液為每1000mL超純水中溶解氯化鈉8.0~8.5g ;氯化鉀0.2g ;十二水合磷酸氫二鈉3.58~3.63g或無水磷酸氫二鈉1.44~1.56g ；以及磷酸二氫鉀0.2~0.24g,用HCl或NaOH調(diào)pH值為7.0~7.4配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，每1000mL超純水中溶解氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、十二水合磷酸氫二鈉3.63g以及磷酸二氫鉀0.24g。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，所述蔗糖的濃度大于5%(w/v)，所述PVP-K30 的濃度大于2%(w/v)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑，其特征在于，該保護(hù)劑經(jīng)過121 °C高壓滅菌20~30min。
9.權(quán)利要求8任一所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑的使用方法，其特征在于，將該保護(hù)劑與含病毒培養(yǎng)液按100: f 10:1的體積比混合后保存病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)劑的使用方法，其特征在于，通過添加磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)保護(hù)劑與含病毒培養(yǎng)液的混合液中蔗糖的終濃度為5%(w/v)，PVP-K30的終濃度為2%(w/v)。
【文檔編號】C12N7/00GK103484435SQ201310453461
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】李春梅, 周慶豐, 潘永飛, 王東東 申請人:廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司