一種抗凍保護(hù)劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗凍保護(hù)劑的制備方法，而提供一種材料易得，生產(chǎn)成本低的抗凍保護(hù)劑的制備方法。在谷朊粉水溶液中加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液經(jīng)分離、透析除鹽、冷凍干燥得到抗凍保護(hù)劑；所得抗凍保護(hù)劑中含有的多肽分子量分布在8.04-50.12KDa。本發(fā)明的抗凍保護(hù)劑的制備方法采用堿性蛋白酶酶解谷朊粉中含有的大量的蛋白，通過(guò)對(duì)堿性蛋白酶切割條件的確定，制備出具有抗凍活性的物質(zhì)，可作為在低溫環(huán)境下減少細(xì)胞損傷的保護(hù)劑，制備方法簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，原料成本低，有利于降低抗凍保護(hù)劑的成本。而且，抗凍活性更加突出，熱滯活性能夠達(dá)到0.2℃左右。
【專利說(shuō)明】一種抗凍保護(hù)劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種抗凍保護(hù)劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在低溫冷鏈的眾多食品加工和運(yùn)輸過(guò)程中、在醫(yī)學(xué)器官移植等各個(gè)領(lǐng)域中，由于環(huán)境溫度的波動(dòng)變化而反復(fù)地遭受冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。溫度的反復(fù)升降使冰晶不斷生長(zhǎng)、凍融和重結(jié)晶，嚴(yán)重破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應(yīng)有的品質(zhì)。如何控制冰晶生長(zhǎng)及重結(jié)晶，實(shí)現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長(zhǎng)控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥廣品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。
[0003]抗凍蛋白(ant1-freezing proteins, AFP)是一類具有特殊功能的蛋白質(zhì),其存在于各種生命體中。它通過(guò)與冰晶結(jié)合來(lái)降低冰晶生長(zhǎng)的溫度和改變冰晶形成的大小和形態(tài)，從而起到重結(jié)晶抑制效應(yīng)；而且它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)影響甚微，于是導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)(melting point, MP)和冰點(diǎn)(freezing point, FP)之間出現(xiàn)一定的熱滯活性(thermal hysteresis activity, THA)而產(chǎn)生熱滯效應(yīng),從而幫助各種生物體抵御寒冷的環(huán)境。
[0004]最近的研究結(jié)果表明:抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異性多肽鏈結(jié)構(gòu)域，并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使經(jīng)過(guò)純化的抗凍蛋白的熱滯活性也不高。因此，獲得安全的、結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽就成為新興的的研究方向。
[0005]目前，植物性抗凍蛋白的提取主要集中在高山高寒地區(qū)的高山雪蓮、黑麥草、內(nèi)蒙古沙冬青等植物性原材料，但這些原材料不易得到，成本高，并且其提取方法以“冰手指法”為主，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種材料易得，生產(chǎn)成本低的抗凍保護(hù)劑的制備方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種抗凍保護(hù)劑的制備方法，在谷朊粉水溶液中加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液經(jīng)分離、透析除鹽、冷凍干燥得到抗凍保護(hù)劑；酶解條件為:堿性蛋白酶的濃度為2-6%，底物濃度為8%-12%、溶液pH值為7-9，酶解溫度為45°C _65°C，酶解時(shí)間為0.5h_2h。
[0009]所述分離為在4-10°C條件下6000-10000r/min離心。
[0010]所述透析除鹽采用3.5KDa的透析袋，在4_10°C的條件下透析24h。
[0011]所述冷凍干燥為在-72~_80°C的條件下干燥24_36h。
[0012]所得抗凍保護(hù)劑中含有的多肽分子量分布在8.04-50.12KDa。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0014]1、本發(fā)明的抗凍保護(hù)劑的制備方法采用堿性蛋白酶酶解谷朊粉中含有的大量的蛋白，通過(guò)對(duì)堿性蛋白酶切割條件的確定，制備出具有抗凍活性的多肽混合物，可作為在低溫環(huán)境下減少細(xì)胞損傷的保護(hù)劑，制備方法簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，原料成本低，有利于降低抗凍保護(hù)劑的成本。而且，抗凍活性更加突出，熱滯活性能夠達(dá)到0.2°C左右。
[0015]2、本發(fā)明的制備方法在制備過(guò)程中，不添加任何有毒有害物質(zhì)，同時(shí)，谷朊粉本身就是一種可食用性的植物性原材料，所得抗凍保護(hù)劑為天然產(chǎn)品，因此可以以添加劑的形式大規(guī)模的應(yīng)用于食品行業(yè)。
[0016]3、本發(fā)明的制備方法通過(guò)酶解分離、透析除鹽、冷凍干燥等方法從谷朊粉中得到多肽的混合物，即抗凍保護(hù)劑，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。而且，顯著的提高了谷朊粉的利用價(jià)值，為小麥谷朊粉的深加工提供了新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中抗凍保護(hù)劑Tricine SDS-PAGE的電泳圖譜；
[0018]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中抗凍保護(hù)劑的熔點(diǎn)掃描圖譜；
[0019]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中抗凍保護(hù)劑當(dāng)保留溫度為-0.70°C時(shí)的冰點(diǎn)掃描圖譜；
[0020]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生長(zhǎng)圖，B表示抗凍保護(hù)劑的冰晶生長(zhǎng)圖；
[0021]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中抗凍保護(hù)劑的熔點(diǎn)掃描圖譜；
[0022]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中抗凍保護(hù)劑當(dāng)保留溫度為-0.50°C時(shí)的冰點(diǎn)掃描圖譜；
[0023]圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生長(zhǎng)圖，B表示抗凍保護(hù)劑的冰晶生長(zhǎng)圖；
[0024]圖8為本發(fā)明實(shí)施 例3中抗凍保護(hù)劑的熔點(diǎn)掃描圖譜；
[0025]圖9為本發(fā)明實(shí)施例3中抗凍保護(hù)劑當(dāng)保留溫度為-0.20°C時(shí)的冰點(diǎn)掃描圖譜；
[0026]圖10為本發(fā)明實(shí)施例3中抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生長(zhǎng)圖，B表示抗凍保護(hù)劑的冰晶生長(zhǎng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0028]實(shí)施例1
[0029](I)抗凍保護(hù)劑的制備
[0030]稱取IOg谷朊粉，按照底物濃度8%的比例加入水溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0。按照堿性蛋白酶的濃度為5%加入堿性蛋白酶，酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為lh。酶解后所得溶液在8°C、10000r/min的條件下離心15min,取上清液,在4°C下,3.5KDa的透析袋內(nèi)透析除鹽24h，在-72°C的條件下冷凍干燥24h，得到抗凍保護(hù)劑。
[0031](2) Tricine SDS-PAGE測(cè)抗凍保護(hù)中多肽的分子量分布范圍
[0032]將所得抗凍保護(hù)劑用超純水配制成lmg/ml的溶液,經(jīng)Tricine SDS-PAGE電泳測(cè)定，Tricine SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示，圖中有條帶出現(xiàn)，說(shuō)明所得抗凍保護(hù)劑中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范圍之間。
[0033](3)所得抗凍保護(hù)劑進(jìn)行熱滯活性的測(cè)定
[0034]將抗凍保護(hù)劑用超純水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于鋁制液體坩堝中，按照下述的溫控程序進(jìn)行熱滯活性的測(cè)定:[0035]a、以5°C /min的速率由室溫降至_30°C，保持5min ；
[0036]b、以1°C /min的速率由_30°C升至20°C，記錄樣品熔點(diǎn)Tm ；
[0037]C、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至 _30°C，保持 5min ；
[0038]d、以1°C /min的速率由_30°C升至固液混合態(tài)的任一溫度點(diǎn)(保留溫度Th)，保留2min ；
[0039]e、以1°C /min的速率由Th降至_30°C,記錄樣品體系開(kāi)始結(jié)晶的溫度Ttl ；
[0040]計(jì)算熱滯活性THA=Th-Ttl。
[0041]熔點(diǎn)掃描圖譜如圖2所示，測(cè)得抗凍保護(hù)劑熔點(diǎn)Tm=_2.43°C，當(dāng)確定其保留溫度Th=-0.70°C時(shí)，冰點(diǎn)掃描圖譜如圖3所示，冰點(diǎn)Ttl=-0.92°C，經(jīng)計(jì)算得:抗凍保護(hù)劑熱滯活性THA=Th-T0=0.22。。。
[0042](4)抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖的觀察:
[0043]將抗凍保護(hù)劑及牛血清蛋白用超純水分別配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于載玻片上，按照下述的溫控程序進(jìn)行冰晶的觀察:
[0044]a、以30°C /min的速率由室溫降至_30°C，保持5min ；
[0045]b、以 30°C /min 的速率由 _30°C升至 20°C ；
[0046]C、以 20°C /min 的速率由 20°C 降至 4°C，保持 Imin ；
[0047]d、以 24°C /min 的速率由 4°C 降至 _20°C ；
[0048]e、以 1.5°C /min 的速率由 _20°C升至 _6°C ；
[0049]f、以 1°C /min 的速率由 _6°C升至 _5°C ；
[0050]g、以 1°C /min 的速率由-5°C 降至 _35°C,保持 15min。
[0051]在-35°C下，以普通的牛血清蛋白作為對(duì)照，對(duì)比觀察本發(fā)明抗凍保護(hù)劑的晶體生長(zhǎng)狀況。
[0052]在放大1000倍的條件下觀察，所得對(duì)照結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出:按設(shè)定的溫控程序反復(fù)融凍之后，與牛血清蛋白的冰晶體相比，在此條件下制備的抗凍保護(hù)劑冰晶體更加大小一致、致密均勻，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制重結(jié)晶的能力。
[0053]實(shí)施例2
[0054]( I)抗凍保護(hù)劑的制備
[0055]稱取15g谷朊粉，按照底物濃度10%的比例加入超純水溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH為8.5，按照酶濃度為4%加入堿性蛋白酶，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間為1.5h。酶解所得溶液在4°C、8000r/min的條件下離心20min,取上清液,在6°C下,3.5KDa的透析袋內(nèi)透析除鹽24h，在-72°C的條件下冷凍干燥36h，得到抗凍保護(hù)劑。
[0056](2) Tricine SDS-PAGE測(cè)抗凍保護(hù)劑中多肽的分子量分布范圍
[0057]將所得抗凍保護(hù)劑用超純水配制成lmg/ml的溶液,經(jīng)Tricine SDS-PAGE電泳測(cè)定，Tricine SDS-PAGE電泳圖譜中有條帶出現(xiàn)，說(shuō)明所得抗凍保護(hù)劑中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范圍之間。
[0058](3)所得抗凍保護(hù)劑進(jìn)行熱滯活性的測(cè)定
[0059]將抗凍保護(hù)劑用超純水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于鋁制液體坩堝中，按照實(shí)施例1的溫控程序進(jìn)行熱滯活性的測(cè)定，熔點(diǎn)掃描圖譜如圖5所示，測(cè)得抗凍保護(hù)劑熔點(diǎn)Tm=-2.27°C,當(dāng)確定其保留溫度Th=-0.500C時(shí)，冰點(diǎn)掃描圖譜如圖6所示，冰點(diǎn)T0=-0.71 °C，經(jīng)計(jì)算得:抗凍保護(hù)劑熱滯活性THA=Th-Ttl=0.21 °C。
[0060](4)抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖的觀察
[0061]將抗凍保護(hù)劑及牛血清蛋白用超純水分別配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于載玻片上，按照實(shí)施例1的溫控程序進(jìn)行冰晶的觀察，在放大1000倍的條件下觀察，所得對(duì)照結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出:按設(shè)定的溫控程序反復(fù)融凍之后，與牛血清蛋白的冰晶體相比，在此條件下制備的抗凍保護(hù)劑冰晶體大小一致、致密均勻，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制重結(jié)晶的能力。
[0062]實(shí)施例3
[0063]( I)抗凍保護(hù)劑的制備
[0064]稱取5g谷朊粉，按照底物濃度9%的比例加入超純水溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH為9.0，酶濃度為3%，酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為1.5h，所得溶液在6°C、7000r/min的條件下離心30min，取上清液，在4°C下，3.5KDa的透析袋內(nèi)透析除鹽36h，在-72 °C的條件下冷凍干燥24h，得谷朊粉抗凍保護(hù)劑。
[0065](2) Tricine SDS-PAGE測(cè)抗凍保護(hù)劑中多肽的分子量分布范圍
[0066]將所得抗凍保護(hù)劑用超純水配制成lmg/ml的溶液,經(jīng)Tricine SDS-PAGE電泳測(cè)定，Tricine SDS-PAGE電泳圖譜中有條帶出現(xiàn)，說(shuō)明所得抗凍保護(hù)劑中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范圍之間。
[0067](3)所得抗凍保護(hù)劑進(jìn)行熱滯活性的測(cè)定
[0068]將抗凍保護(hù)劑用超純水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于鋁制液體坩堝中，按照實(shí)施例1的溫控程序進(jìn)行 熱滯活性的測(cè)定，熔點(diǎn)掃描圖譜如圖8所示，測(cè)得抗凍保護(hù)劑熔點(diǎn)Tm=-2.38°C,當(dāng)確定其保留溫度Th=-0.200C時(shí)，冰點(diǎn)掃描圖譜如圖9所示，冰點(diǎn)T0=-0.41 °C，經(jīng)計(jì)算得:抗凍保護(hù)劑熱滯活性THA=Th-Ttl=0.21 °C。
[0069](4)抗凍保護(hù)劑冰晶生長(zhǎng)及抑制冰晶生長(zhǎng)效果圖的觀察
[0070]將抗凍保護(hù)劑及牛血清蛋白用超純水分別配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于載玻片上，按照實(shí)施例1的溫控程序進(jìn)行冰晶的觀察，在放大1000倍的條件下觀察，所得對(duì)照結(jié)果如圖10所示。從圖10可以看出:按設(shè)定的溫控程序反復(fù)融凍之后，與牛血清蛋白的冰晶體相比，在此條件下制備的抗凍保護(hù)劑冰晶體大小一致、致密均勻，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制重結(jié)晶的能力。
[0071]本發(fā)明以小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物谷朊粉為原料，通過(guò)堿性蛋白酶酶解制備抗凍保護(hù)劑，所得抗凍保護(hù)劑中含有多肽成分，分子量分布在8.04KDa-50.12KDa之間，熱滯活性高達(dá)0.2°C左右。所得抗凍多肽混合物產(chǎn)品可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品等行業(yè)，從而實(shí)現(xiàn)谷朊粉的有效增值和利用。
[0072]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗凍保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，在谷朊粉水溶液中加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液經(jīng)分離、透析除鹽、冷凍干燥得到抗凍保護(hù)劑；酶解條件為:堿性蛋白酶的濃度為2-6%，底物濃度為8%-12%、溶液pH值為7-9，酶解溫度為45 °C -65°C，酶解時(shí)間為0.5h_2h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凍保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，所述分離為在4-10°C條件下 6000-10000r/min 離心。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凍保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，所述透析除鹽采用3.5KDa的透析袋，在4-10°C的條件下透析24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凍保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥為在-72~-80°C的條件下干燥24-36h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凍保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，所得抗凍保護(hù)劑中含有的多肽分子量分布在8 .04-50.12KDa。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103805667SQ201410074320
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】劉愛(ài)國(guó), 趙源 申請(qǐng)人:天津商業(yè)大學(xué)