兔出血癥病毒樣顆粒、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種兔出血癥病毒樣顆粒，其是根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子，對兔出血癥病毒VP60基因進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的VP60基因與昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體連接，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)兔出血癥病毒樣顆粒。將所述兔出血癥病毒樣顆粒與防腐劑和佐劑混合，即制備得到兔出血癥疫苗。本發(fā)明可大幅度提高兔出血癥病毒樣顆粒的表達(dá)量，具有安全性高、免疫原性好、易發(fā)酵、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】兔出血癥病毒樣顆粒、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域、基因工程領(lǐng)域及獸醫(yī)生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種兔出血癥病毒樣顆粒、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]兔病毒性出血癥俗稱兔痕，是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus,RHDV)弓丨起的一種急性、烈性、高度接觸性和致死性傳染病。因曾是兔的一種毀滅性傳染病，給養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失而備受養(yǎng)兔業(yè)的關(guān)注。1984年中國首次報道了該病。1989年，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病正式列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病(王永坤等，兔瘟的診斷與防治，1992)。
[0003]在2000年國際病毒分類委員會(ICTV)的第七次報告中，將兔出血癥病毒列入了杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形,無囊膜,直徑32-36nm，20面體對稱(張麗紅等，廣東畜牧獸醫(yī)科技，31:9_11，2006)。其衣殼由32個高4-6nm的圓柱狀殼粒構(gòu)成，由主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60多重拷貝所組成，核心直徑為17_23nm。負(fù)染電鏡表面具有嵌杯樣病毒典型的杯狀形態(tài)結(jié)構(gòu)，電鏡下還可見少數(shù)沒有核心的病毒空衣殼。病毒在氯化銫中的浮密度為1.29-1.34g/cm3，沉降系數(shù)為85_162S(李海等，貴州畜牧獸醫(yī)，28:10-11，2004)。
[0004]RHDV基因組為單股正鏈RNA，全長7437bp，分子量為(2.4xl06_2.6xl06) KD，5’末端無帽狀結(jié)構(gòu)，3’末端有一個短的polyA尾。RHDV基因組含2個開放閱讀框。5’末端的長開放閱讀框架(ORFl)編碼一個2344氨基酸的多聚蛋白前體，它被病毒蛋白酶進(jìn)一步分解為衣殼蛋白和多個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中衣殼蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，稱為VP60，與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)。3’末`端的短開放閱讀框架(0RF2)，位于7025-7378bp之間，編碼病毒另一個小的結(jié)構(gòu)成分，稱為VP10，堿性蛋白且含量較低，可能在病毒粒子中與病毒RNA結(jié)合。除基因組RNA外，在感染的組織和病毒顆粒中還含有2.4kb的亞基因組RNA，也編碼衣殼蛋白，并且該片段在5’端也與VPg蛋白共價結(jié)合(嚴(yán)維巍等，中國養(yǎng)兔雜志，1:26-29，2001)。
[0005]VP60的N-端組成衣殼蛋白的內(nèi)部區(qū)，C-端組成衣殼蛋白的外部。N-端的第31-250之間的氨基酸是主要的抗感染免疫決定區(qū)。對VP60蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，體外表達(dá)該衣殼蛋白時，在沒有其他任何成分存在的條件下，可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV病毒粒子在物理形態(tài)上類似的病毒樣顆粒(Rob N, Virus-like particle asimmunogens, Trends in Microbiology, 11:438 - 444, 2003)。近年來，應(yīng)用病毒樣顆粒作為疫苗的抗原載體逐漸受到科學(xué)家們的重視。病毒樣顆粒是模擬病毒的顆粒形態(tài)特點(diǎn)，將外源基因片段產(chǎn)物呈遞到病毒顆粒表面而形成的嵌合顆粒，它的外部形態(tài)與病毒顆粒相同，甚至還有某些病毒受體的天然配體；同時，還可將其他病原的特異性抗原等呈遞在顆粒表面，因而在病原體的疫苗研究中發(fā)揮著重要的作用。VLPs常可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較滅活疫苗和可溶性多肽更為強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，因?yàn)槠浔砻媸且苑歉腥拘缘念w粒狀態(tài)模擬天然抗原呈遞過程來呈遞糖蛋白抗原的，而該方法提呈引起的免疫應(yīng)答優(yōu)于溶解狀態(tài)，故在保護(hù)作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫應(yīng)答可望更接近自然感染，這樣，病毒樣顆粒更有可能廣泛用于疫苗的研制。并且，由于VLPs不包裹核酸，不能復(fù)制，因此也沒有感染性，是一種安全的抗原載體(Nagesha H S, Virus-like particles of calicivirus as epitopecarriers, Arch Virol, 144:2429-2439, 1999)。
[0006]大量實(shí)驗(yàn)表明，RHDV不能在雞胚上增殖，也難于在各種原代或傳代細(xì)胞中穩(wěn)定增殖。目前廣泛使用的疫苗為組織滅活苗。近來，新型疫苗的研究主要集中在基因工程苗的研制上，已在大腸桿菌、釀酒酵母、痘苗病毒以及植物等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了 VP60蛋白(劉懷然等，動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，24:7-9, 2003)。Boga等在大腸桿菌中表達(dá)了 RHDV西班牙AST/89株的主要衣殼蛋白VP60，發(fā)現(xiàn)當(dāng)VP60以β-半乳糖苷酶融合蛋白表達(dá)時，僅與天然VP60具有部分相同抗原并不誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫；而在以T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)中則可表達(dá)與天然VP60抗原性極為相似的蛋白質(zhì)并可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫，能抵抗住提純RHDV的致死性攻擊；Boga等在釀酒酵母中表達(dá)VP60并能形成病毒樣顆粒；FamoS等將Spanish isolate AST/89的VP60在酵母中進(jìn)行高效表達(dá)，蛋白表達(dá)量高達(dá)1.5g/L，且約70%表達(dá)蛋白進(jìn)行了糖基化修飾；嚴(yán)維巍等將RHDV VP60基因插入pPICZ B經(jīng)畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白具有血凝特性且可被抗RHDV的高免血清所抑制(嚴(yán)維巍等，中國獸醫(yī)學(xué)報，23:447-449, 2003)。Fernandez-Femandez等采用洋李痘馬鈴薯Y病毒構(gòu)建的載體成功表達(dá)了 VP60，該表達(dá)產(chǎn)物接種兔能抵御致死劑量RHDV的攻擊(Fernandez-Fernandez MR, Protection of rabbits against rabbit hemotthagic disease virus by immnizationwith the VP60protein expressed in plan ts with a potyvirusbased vector, Virology, 280:283-291,2001) ;Castanon等采用馬鈴薯表達(dá)含VP60的抽提物對兔進(jìn)行免疫，產(chǎn)生特異的抗體反應(yīng)并可提供對RHDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)(Castanon S，The effect of thepromoter on expression of VP60gene from rabbit hemorrhagic disease virus inpotato plants, Plant Science, 162:87-95,2002)。
[0007]目前，RHDV基因工程疫苗研究中仍然存在一些問題:大腸桿菌表達(dá)的VP60具有不可溶性及免疫效果相對較差的缺點(diǎn)，應(yīng)用前景并不樂觀；重組病毒疫苗存在向環(huán)境擴(kuò)散經(jīng)遺傳修飾的生物體安全問題；采用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)VP60的表達(dá)水平目前還不理想；因而研制RHD安全、高效的新型疫苗勢在必行。
[0008]兔瘟以呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官水腫、淤血及出血變化為特征，感染兔常在48-72小時內(nèi)死亡。根據(jù)病變特點(diǎn)可作出初步診斷，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測方法進(jìn)行確診，主要采用血凝實(shí)驗(yàn)(HA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫電鏡技術(shù)及分子生物學(xué)方法。
[0009]昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)自1983年建立以來，已有近千種外源基因在該系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。其優(yōu)點(diǎn)為=(I)BEVS表達(dá)效率高，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似；(2)桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖；
(3)應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動子表達(dá)外源基因，即使重組基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性，也不影響表達(dá)水平；(4)借多元表達(dá)載體或借幾個不同重組病毒共感染，可以同時表達(dá)2個或更多個外源蛋白，研究肽鏈超分子裝配以及蛋白寡聚體的結(jié)構(gòu)與功能；(5)桿狀病毒對脊椎動物無病原性，昆蟲細(xì)胞沒有與人畜共患的疾病，被認(rèn)為遺傳學(xué)上是安全的表達(dá)載體(景志忠等，中國獸醫(yī)科技，31:43-45，2001)。[0010]目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的有關(guān)技術(shù)已相對成熟，利用該系統(tǒng)表達(dá)外源基因，不僅經(jīng)濟(jì)、高效，而且可提供一條新的技術(shù)途徑。利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)兔出血癥病毒樣顆粒，保證其具有正常的蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)免疫活性，為兔出血癥疫苗的商業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，提供一種高效制備兔出血癥病毒樣顆粒的方法。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種兔出血癥病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子對兔出血癥病毒VP60基因進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化的兔出血癥病毒VP60基因；(2)重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建:將優(yōu)化的VP60基因插入到昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒；(3)重組桿狀病毒的拯救:用重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，拯救獲得重組桿狀病毒；(4)兔出血癥病毒樣顆粒的制備:將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后收獲上清，即得到兔出血癥病毒樣顆粒。
[0014]本發(fā)明還提供采用上述方法制備的兔出血癥病毒樣顆粒。
[0015]本發(fā)明還提供所述兔出血癥病毒樣顆粒在制備兔出血癥疫苗中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明還提供一種兔出血癥疫苗，由上述方法制備的兔出血癥病毒樣顆粒輔以防腐劑(例如疊氮鈉)和佐劑(氫氧化鋅與硫酸乙酰肝素復(fù)合物)制備而成。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明的高效制備兔出血癥病毒樣顆粒的方法，包括克隆獲得高滴度兔出血癥病毒株的VP60基因序列，將`其按昆蟲細(xì)胞的密碼子頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將優(yōu)化后的序列克隆到具有多個啟動子與表達(dá)盒(例如雙啟動子與雙表達(dá)盒)的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體中。將轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行同源重組或轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救獲得重組桿狀病毒。用IF和WB方法鑒定重組病毒，滴定重組病毒。將重組桿狀病毒按照一定的MOI感染ΒΤΙ-Τη-5Β1-4昆蟲細(xì)胞，搖瓶或發(fā)酵培養(yǎng)，4-6天后凍融收獲，即得。
[0018]其中，所述的兔出血癥病毒衣殼蛋白基因VP60的原始序列及經(jīng)密碼子優(yōu)化后的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，由它們編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0019]步驟(2)中所述昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體(即轉(zhuǎn)移表達(dá)載體)選自AcRP23_lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac> Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcCl 29、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWU pAcUW2U pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW3U pAcUW4U pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51> pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacII1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL, pJVNheI, pJVP10, pJVrsMAG, pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.UpSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI_、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030> pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT B,pFastBacHT C、pFastBacDual或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體中的至少一種。優(yōu)選pFastBacDual桿狀病毒運(yùn)載載體。[0020] 本發(fā)明中所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體為帶有兔出血癥病毒VP60基因密碼子優(yōu)化后序列的載體 pFastBacDua-VP60-VP60_Y。VP60 優(yōu)化基因分別位于 polyhedrin promoter (Ph)和Pltl兩個高效啟動子下游，形成兩個高效表達(dá)盒。
[0021 ]所述桿狀病毒選自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV,SIMNPV, SeMNPV, SpltNPV中的至少一種。優(yōu)選苜蓿銀紋夜蛾核型多角體桿狀病毒親本株AcMNPVo
[0022]所述重組桿狀病毒為重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒rAcMNPV(AcMNPV-VP60-VP60-Y)。
[0023]所述的昆蟲細(xì)胞來源于鱗翅目昆蟲,例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9 細(xì)胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) Se301 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLG4 細(xì)胞系、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)ΒΤΙ-Τη-5Β1-4 細(xì)胞系、BT1-Tn-5C1 細(xì)胞系、BT1-Tn_5F2 細(xì)胞系、斜紋貪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-Sl-l細(xì)胞系、IBL-SLlA細(xì)胞系和家蠶卵巢細(xì)胞系BmN。優(yōu)化組合為，用Sf9細(xì)胞進(jìn)行重組桿狀病毒的拯救和滴定，用H5昆蟲細(xì)胞進(jìn)行病毒樣顆粒的表達(dá)。
[0024]本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，對兔出血癥病毒的VP60基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將該基因的原始序列(SEQ ID NO:1)及優(yōu)化序列(SEQ ID NO:2)克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移表達(dá)載體中，在PH、PlO啟動子或其它病毒和真核生物的強(qiáng)啟動子控制之下,通過體內(nèi)或體外(invivo/in vitro)重組，使VP60的原始序列及優(yōu)化后序列整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組病毒；重組病毒感染昆蟲細(xì)胞,表達(dá)生產(chǎn)兔出血癥病毒樣顆粒。
[0025]本發(fā)明的一個最優(yōu)選的技術(shù)方案為:對兔出血癥病毒(RHDV)的衣殼蛋白基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將該衣殼蛋白的原始序列及優(yōu)化后的序列，即SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2所示的堿基序列克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體pFastBacDual上，再通過體內(nèi)重組將兔出血癥病毒VP60基因的原始序列VP60及密碼子優(yōu)化后的序列VP60-Y多啟動子控制下的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒`親本株AcMNPV的基因組上，插入非功能區(qū)，通過空斑篩選技術(shù)和PCR檢測技術(shù)，獲得攜帶單拷貝和多拷貝兔出血癥病毒VP60基因的重組苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒rAcMNPV-VP60、rAcMNPV-VP60-VP60-Y ;將其感染昆蟲細(xì)胞系，大量繁殖rAcMNPV-VP60、rAcMNPV-VP60-VP60-Y ;當(dāng)重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時，VP60基因在多啟動子(PH、P1CI)控制下高效表達(dá)，自組裝成兔出血癥病毒樣顆粒；在感染4-6天后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，便得到安全、高滴度的兔出血癥病毒樣顆粒，該抗原可用于制備預(yù)防兔病毒性出血癥的注射用疫苗。
[0026]本發(fā)明采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞生物反應(yīng)器中安全、高效地生產(chǎn)兔出血癥病毒樣顆粒，生產(chǎn)成本和安全性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的制備兔出血癥病毒抗原的方法。本發(fā)明方法可大幅度提高兔出血癥病毒樣顆粒表達(dá)量，具有安全性高、免疫原性好、易發(fā)酵、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為PCR擴(kuò)增VP60基因瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，
1、2泳道分別表示陰性組織對照和陽性兔肝臟。
[0028]圖2為重組轉(zhuǎn)移載體BamH I/EcoR I雙酶切鑒定瓊脂糖電泳結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL15000 ； 1:pFastBacI; 2:pFastBac 1-VP60; 3:雙酶切 pFastBacl_VP60 產(chǎn)物。
[0029]圖3為重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞病變結(jié)果(200X顯微鏡下觀察);其中，左圖為正常細(xì)胞；右圖為病變細(xì)胞。
[0030]圖4為PCR法鑒定重組病毒的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；1:對照細(xì)胞；2:重組桿狀病毒；3:陽性質(zhì)粒對照。
[0031]圖5為免疫熒光染色鑒定VP60蛋白表達(dá)結(jié)果；其中，左圖為AcMNPV_VP60病毒感染的Sf9細(xì)胞；右圖為空白對照Sf9細(xì)胞。
[0032]圖6為病毒樣顆粒血凝條件的優(yōu)化示意圖；其中，A=PBS, 0.02M, pH7.0;B:PBS, 0.1M, pH7.00
[0033]圖7為電鏡負(fù)染觀察病毒樣顆粒的結(jié)果。
[0034]圖8為高效表達(dá)轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建模式圖。
[0035]圖9為重組質(zhì)粒pFastBacDua-VP60-VP60_Y的酶切鑒定結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000 ；1.用Sph I/Xho I雙酶切合成質(zhì)粒pUC57_VP60 ；2.用BamHI/Not I雙酶切；
3.用Sph I/Xho I雙酶切。
[0036]圖10為重組病毒的PCR鑒定結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;1.PH啟動子下游的VP60基因；2.PlO啟動子下游的VP60基因。
[0037]圖11為免疫熒光染色鑒定VP60表達(dá)結(jié)果；其中，A為AcMNPV-VP60-VP60_Y病毒感染的Sf9細(xì)胞；B為空白對照Sf9細(xì)胞。
[0038]圖12為Western Blot鑒定VP60蛋白的表達(dá)結(jié)果；其中，A圖為SDS-PAGE檢測結(jié)果:1為空白對照，2為AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9細(xì)胞；B圖為WesternBlot檢測結(jié)果:1為空白對照，2為AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9細(xì)胞。
[0039]圖13為病毒樣顆粒的血凝效果對比檢測結(jié)果；其中，A為Sf9表達(dá)產(chǎn)物；B為H5細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
[0040]圖14為電鏡負(fù)染觀察病毒樣顆粒的結(jié)果；其中，A為病毒樣顆粒透射電鏡照片；B為病毒樣顆粒免疫電鏡照片。
[0041]圖15為RHDV病毒樣顆粒不同佐劑的免疫效果。
[0042]圖16為添加不同佐劑的RHDV病毒樣顆粒疫苗保護(hù)率。
[0043]圖17為免疫兔組織切片圖；其中，A.腎；B.肺；C.肝；D.脾；E.盲腸；F.氣管；G-H.心臟；(A-F.HE X 400; G-H.HE X 200)。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0045]以下實(shí)施例中使用的試驗(yàn)材料:
[0046]大腸桿菌株E.coli DH5 α購自Promega公司；克隆載體pEASY_T3購自全式金公司；克隆載體PMD18-T購自TaKaRa公司；原核表達(dá)載體pET_28a+、受體菌E.coliTOPIO和BL21 (DE3)購自長春西諾生物科技有限公司，運(yùn)載載體pFastBacDual購自Invitrogen公司；Sf9和H5昆蟲細(xì)胞、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒親本株AcMNPV購自長春西諾生物科技有限公司。
[0047]酶與試劑:限制性內(nèi)切酶和配套的緩沖液均購自Promega公司；T4DNALigase及緩沖液為Promega公司產(chǎn)品；LA Taq聚合酶及緩沖液購自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs購自Sigma公司；各種規(guī)格的DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為TransGen Biotech公司產(chǎn)品；DEPC、M-MLV-Rtase (逆轉(zhuǎn)錄酶)購自Promega公司。
[0048]生化試劑:bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal購自 Promega 公司；Tris、Ampicillin, Kanamycin, IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED (N, N, N’，N’ -Tetramethylethylene diamine)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)> 細(xì)胞培養(yǎng)基TC-1OO購自Sigma公司；瓊脂糖為Sunbiotech公司產(chǎn)品；酵母抽提物(YeastExtract)、胰蛋白胨均購自英國OXOID公司；溴化乙錠(EB)、考馬斯亮蘭R-250購自Fluka公司；瓊脂粉為日本進(jìn)口分裝；Proteinase K、胎牛血清購自Invitrogen公司；其它均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。引物由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
[0049]培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基。
[0050]兔出血癥病毒VP60基因表達(dá)產(chǎn)物的動物實(shí)驗(yàn)在隔離實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
[0051]實(shí)施例1單拷貝兔出 血癥病毒VP60基因在重組桿狀病毒中的表達(dá)與檢測
[0052]1.實(shí)驗(yàn)方法
[0053]1.1.有關(guān)溶液和培養(yǎng)基的配制
[0054]溶液1:50mmol/L 葡萄糖，25mmoI /T, Tris-HCl (pH8.0), 10mmol /T, EDTA。
[0055]溶液II:0.2mol/L NaOH, 1%SDS (現(xiàn)用現(xiàn)配)。
[0056]溶液II1:1OOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL，ddH208mL。
[0057]TAE (50 X):242gTris 堿，57.1mL 冰乙酸，IOOmL0.5mol/L EDTA (ρΗ8.0)，無菌水定容至 lOOOmL。
[0058]TER 溶液:胰 RNAse(RNAse A)溶解于 IOmM Tris-HCl U 5mMNaC I 中，配成 10mg/mL的儲存液_20°C凍存，用IXTE buffer稀釋成ZOyg/mL的工作液4°C保存。
[0059]PPt 緩沖液:異丙醇 22mL ；5mol/mL KAclmL ;ddH202mL。
[0060]IXTE 緩沖液:10mmol/L Tris.Cl (ρΗ8.0)，lmmol/L EDTA (ρΗ8.0)，121 °C 高溫高壓蒸汽滅菌20min后儲存于4°C。
[0061]溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配成濃度為10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器儲存
于室溫即可。
[0062]6mol/L Na1:將 0.75g Na2SO3溶于 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 并攪拌至完全溶解，4°C儲存。
[0063]玻璃奶(Glassmilk):將IOg (100mg/mL, Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS中，沉淀2h,棄上清,重復(fù)該步驟2~3次；2000g離心2min,將沉淀物溶于3mol/L的NaI中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。
[0064]New Wash 洗液:Tris-HCl (pHL 4)20mmol/L ；EDTAlmmol/L ；NaC1100mmol/L ;與等體積的無水乙醇配制而成。
[0065]蛋白表達(dá)誘導(dǎo)物IPTG為lmol/L,超純水配制后用0.2mm濾器過濾除菌。
[0066]蛋白上樣緩沖液(2X): 100mmol/L Tris-HCl (ρΗ6.8)、200mmol/L 二硫蘇糖酉享(DTT)、4%SDS、0.2% 溴酚藍(lán)、10% 甘油。[0067]30%丙烯酰胺溶液:29g丙烯酰胺，IgN，N'-亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL /K，過濾。
[0068]考馬斯亮藍(lán)染液:0.24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇:水(1:1, v/v)和IOmL冰乙酸中。
[0069]脫色液:90mL甲醇:水(1:1，v/v)和IOmL冰乙酸。
[0070]裂解緩沖液(pH8.0):50mmol/L Tris_Base、0.1M NaCl。
[0071]包涵體洗滌液I (ρΗ8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、l%TritonX_100。
[0072]包涵體洗滌液II (pH8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、2M 尿素。
[0073]包涵體蛋白溶解液(ρΗ8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、8M 尿素。
[0074]脲NTA-O 緩沖液:20mM Tris-HCl ρΗ7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea。脲NTA-500緩沖液:20mM Tris-HCl ρΗ7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea，0.5M Imidazole。
[0075]Bradford 試劑為 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。
[0076]ELISA 所需試劑:包被液(ρΗ9.6) 1.59g Na2CO3^2.93g NaHCO3^ddH2O 定容至 1L，保存于4°C ;臨用前配制封閉液，BSA溶于PBS中至終濃度為1% ;洗滌液為含0.05%Tween-20的PBS ;底物緩沖液為1.84g Na2PO4.12H20、0.51g檸檬酸、ddH20定容至IOOmL ；0PD顯色液是4mg OPD溶于IOmL底物緩沖液，加15 μ L30%H202,臨用前配制；終止液為2mol/L H2S04。
[0077]Western Blot試劑:半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)膜緩沖液是14.41g甘氨酸、12.1lg Tris-Base、50mL甲醇、ddH20定容至1L、4°C保存；1XPBS加Tween-20至終濃度為0.1%配成洗滌液；BSA溶于PBS中至終濃度為3%為封`閉液；純化的多克隆抗體用封閉液按1:1000稀釋；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用封閉液按1:1000稀釋；臨用前配制DAB顯色液，4mg DAB溶于IOmLIOOmmoI/L ρΗ7.5 的 Tris-Cl 中，加 15μ L30%H202。
[0078]LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調(diào)整pH值7.0(固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂)。液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉，121°C高溫高壓蒸汽滅菌15min，在溫度低于45°C且還未凝固時，加入相應(yīng)抗生素溶液，混勻后倒入平板，為LB固體培養(yǎng)基，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0079]1.2.兔出血熱病毒VP60基因原始序列的獲得
[0080]1.2.1.兔瘟種毒的分離鑒定
[0081]從某養(yǎng)兔場患有兔出血癥的病死兔采集的樣本，研磨后1:3添加雙抗，注射健康兔lmL，發(fā)病后獲得的肝臟。
[0082]1.2.2.TRIzol 法提取基因組 RNA
[0083](I)將兔肝放入盛有Trizol (50_100mg組織/ImL)的玻璃勻漿器中勻漿，組織體積不要超過Trizol體積的10% ；
[0084](2)將勻漿液在室溫下放置5min以使核蛋白質(zhì)復(fù)合體完全裂解；
[0085](3)加入氯仿(0.2mL/lml Trizol)，蓋緊管蓋并漩渦劇烈震蕩15sec ;室溫放置2_15min ；
[0086](4)4°C，12000g離心15min。離心后，混合液被分為三相:處于下層的淺紅色酚-氯仿有機(jī)相、中間相和上層無色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存留于間相和有機(jī)相中，水相體積約為用于勻漿的Trizol體積的60%;
[0087](5)將水相移入新管,加異丙醇(0.5mL/lmLTrizol);室溫放置5-lOmin ;[0088](6)4-25°C,12000g離心8min，RNA沉淀在管壁或管底形成膠狀的或白色的小球；
[0089](7)棄上清，用lmL75%乙醇清洗RNA沉淀；然后4_25°C，7500g離心5min ；
[0090](8)棄上清，干燥；沉淀重溶于20 μ L DEPC處理的雙蒸水(ddH20)或去離子甲酰胺中，_70°C保存?zhèn)溆?。若沉淀難溶，可用吸管吹打數(shù)次并55-60°C溫育10-15min。
[0091]1.2.3.目的基因的獲得
[0092]根據(jù)GenBank公布的序列⑶339228，設(shè)計(jì)特異反轉(zhuǎn)錄引物RHDV-RT:5，-GGATTAAAACCTAACCTACC-3，。
[0093]VP60 基因原始序列的擴(kuò)增引物為:VP60 上游:5’ -AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3’ (BamHI) ；VP60 下游:5’ -GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3’ (EcoR I)。
[0094]1.2.4.RT-PCR 反應(yīng)
[0095]1.2.4.1.cDNA 第一鏈的合成
[0096]取2 μ LRNA (≤ μ g) + 2 μ L RHDV-RT + 13.75 μ L DEPC 處理水；70C，5min,迅速置冰上 5min ;加入 5 μ L5 XM-MLV 緩沖液 + 1.25 μ LlOmM dNTPs +1 μ LM-MLV-RT (200U)，使終體積為25 μ L ;混勻后室溫放置IOmin ;42°C反應(yīng)Ih ；70°C 2min滅活RTase，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0097]1.2.4.2.PCR擴(kuò)增目的基因
[0098]反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表1:
[0099]表1反應(yīng)體系及反應(yīng)程序
[0100]
【權(quán)利要求】
1.兔出血癥病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子對兔出血癥病毒VP60基因進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化的兔出血癥病毒VP60基因； (2)重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建:將優(yōu)化的VP60基因插入到昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒； (3)重組桿狀病毒的拯救:用重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，拯救獲得重組桿狀病毒； (4)兔出血癥病毒樣顆粒的制備:將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后收獲上清，即得到兔出血癥病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中優(yōu)化的兔出血癥病毒VP60基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體選自 AcRP23_lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A,pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAc JcC5、pBac 1、pBac2、pBlueBac II1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL, pJVNheI, pJVP10, pJVrsMAG, pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV V1-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A> pFastB acHT B> pFastBacHT C、pFastBacDual 中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體為 pFastBacDualο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將優(yōu)化的VP60基因分別構(gòu)建到pFastBacDual中Pltl兩個啟動子的下游,形成兩個高效表達(dá)盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中使用的昆蟲細(xì)胞選自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9> Mimic Sf9 細(xì)胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) Se301 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLGl 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLG4 細(xì)胞系、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)BT1-Tn-5Bl_4 細(xì)胞系、BT1-Tn_5Cl 細(xì)胞系、BT1-Tn_5F2 細(xì)胞系，斜紋貪夜蛾(Spodoptera litura) ZSU-Sl-1細(xì)胞系、IBL-SLlA細(xì)胞系和家蠶卵巢細(xì)胞系BmN中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中使用的昆蟲細(xì)胞分別為Sf9 細(xì)胞、ΒΤΙ-Τη-5Β1-4 細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法制備的兔出血癥病毒樣顆粒。
9.權(quán)利要求8所述的兔出血癥病毒樣顆粒在制備兔出血癥疫苗中的應(yīng)用。
10.一種兔出血癥疫苗，其特征在于，將權(quán)利要求8所述的兔出血癥病毒樣顆粒輔以防腐劑和佐劑制備而成。
【文檔編號】C12R1/93GK103555766SQ201310515769
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】夏振強(qiáng), 鄭文文, 金宏麗, 張渭蛟 申請人:長春西諾生物科技有限公司