一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明涉及疫苗的生產(chǎn)毒株是重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.8052，該毒株系采用的表達(dá)載體為分泌表達(dá)，且含有6個組氨酸標(biāo)簽，易于蛋白檢測分析用；用其作為生產(chǎn)毒株生產(chǎn)兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗，該疫苗不含病毒基因組，無動物安全危害和潛在散布性；免疫針對性強(qiáng)，能激發(fā)免疫動物產(chǎn)生足量的免疫抗體，并產(chǎn)生長久保護(hù)力。按照本發(fā)明提供的技術(shù)生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒，1000L生物反應(yīng)器中收獲的病毒液血凝價達(dá)到1:32768～1:262144，該RHDV病毒顆粒蛋白表達(dá)量約150mg/L，每升病毒液半成品可以制成標(biāo)準(zhǔn)疫苗5000～100000頭份，高于國內(nèi)技術(shù)水平8～20倍；該重組亞單位疫苗添加了佐劑，有效的提高了疫苗的免疫效果，是一種明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的滅活組織疫苗的新疫苗。
【專利說明】一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法。該疫苗是一種應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的具有抗兔病毒性出血癥作用的重組亞單位疫苗，屬于獸用生物制品及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]兔出血性疾病(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)是一種具有高度傳染性和致死性的疾病，宿主包括野生兔和家兔，已經(jīng)成為野兔生存和家兔衍生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重大威脅。
[0003]RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)是引發(fā) RHD 的病毒，該病毒是一個無囊膜病毒，屬杯狀病毒科家族(V F Ohlinger, B Haas, G Meyers, FWeiland and H J Thiel.1dentification and characterization of the viruscausing rabbit hemorrhagic disease.Journal of Virology.1990(64)3331-3336 ；F Parra and M Priet0.Purification and characterization of a calicivirus asthe causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits..Journal ofVirology.1990(64)4013-4015)。RHDV顆粒由一個7.5kb的單鏈正向RNA基因組組成，其纏繞在一個直徑約38mn的二十面體小衣殼上。RHDV衣殼蛋白(VP60)約為60kD。天然的病毒衣殼由 180個VP60組成(J Barcenaj N Verdaguerj R Rocaj M Morales, I Angulo，C Riscoj J LCarrascosaj J M Torres, J R Caston.The coat protein of Rabbit hemorrhagic diseasevirus contains a molecular switch at the N—terminal region facing the innersurface of the capsid.Virology.2004(322) 118 - 134.)D
[0004]RHDV于1984年第一次在中國發(fā)現(xiàn)。幾年之內(nèi)，蔓延到韓國和歐洲大陸(SMitroj H Krauss.Rabbit hemorrhagic disease:A review with special referenceto its epizootiology.1993 (9) 70-78)o隨后在大洋洲，北非，中東，俄羅斯，印度，古巴，美國和墨西哥以及烏拉圭爆發(fā)(A Bouslamaj G M De Miaj S Hammami，T Aouinaj HSoussij T Frescura.1dentication of the virus of rabbit haemorrhagic diseasein Tunisia.Veterinary Research 1996(138) 108-110.)。1989 年，國際獸醫(yī)局(OIE)將該病正式列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。通常情況下，RHD在感染后48h~72h發(fā)作，通過急性肝損傷和彌漫性血管內(nèi)凝血導(dǎo)致80%的成年動物死亡(FRamiro-1bancz, J M Martin-Alonsoj P Garcia Palenciaj et al.Macrophage tropism ofrabbit hemorrhagic disease virus is associated with vascular pathology.Virusresearch.1999(60)21-28)。這種疾病具有高度的傳染性，病毒能通過口腔、鼻腔或結(jié)膜方式傳播。幸存的動物甚至可在病毒感染后4周內(nèi)持續(xù)釋放病毒。RHDV病毒能夠抵抗多種極端環(huán)境，包括低pH、高溫和反復(fù)凍融，使其能夠在自然環(huán)境中保持穩(wěn)定(S R Moss, S LTurner, R C Trout,P J White, P J Hudson, A Desaij M Armestoj N L Forrester,E A.GouldMolecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus.Journal of GeneticVirology.2002(83)2461-2467)。
[0005]RHDV缺乏有效的在體外繁殖系統(tǒng)，這阻礙了利用單細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)病毒作為疫苗抗原的來源。目前，粗病毒從受感染的兔肝臟(V J L Arguell0.Viral haemorrhagicdisease of rabbits: vaccination and immune response.Revue scientifique ettechnique (International Office of Epizootics).1991 (10) 459)獲得，并制成滅活疫苗。這種疫苗制備方式所帶來的生物安全、污染物殘留和動物福利問題日益得到關(guān)注。
[0006]早期的研究表明，重組VP60可誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫應(yīng)答對RHDV侵染(SLaurent，J F Vautherotj M F Madelainej G Le Gall，D Rasschaert.Recombinantrabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirusself-assembles into viruslike particles and induces protection.JournalVirology.1994(64)6794 - 6798)。幾種表達(dá)系統(tǒng)中已被用來生產(chǎn)重組VP60的，包括細(xì)菌、酵母、植物、痘病毒載體和昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；(J L Martinez-Torrecuadradaj ECortes，C Vela, J P Langeveldj R H Meloenj K Dalsgaardj W D Hamilton, J I Casal.Antigenic structure of the capsid protein of rabbit haemorrhagic diseasevirus.Journal of Genetic Virology 1998 (79) 1901 - 1909 ;H S Nageshaj L F Wang, AD Hyatt.(1999)Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers.Archives of Virology.1999 (144) 2429 - 2439 ； J Plana-Duranj M Bastonsj M JRodriguez, I Climentj E Cortes，C Vela, I Casalj 1996.0ral immunization of rabbitswith VP60 particles confers protection against rabbit hemorrhagic disease.Archives of Virology.1996(141) 1423 - 1436 ； ；B Gromadzkaj B Szewczykj G Konopaj AFitznerj A Kesy.Recombinant VP60 in the form of virion-like particles as apotential vaccine against rabbit hemorrhagic disease virus.Acta BiochimicaPolonica.2006(53)371 - 376)。釆用基因工程的手段也被用來研究RHDV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和裝配。然而，相關(guān)的生物安全風(fēng)險和高昂的費(fèi)用阻礙了重組RHDV亞單位疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]理想的RHDV疫苗的一個重要標(biāo)準(zhǔn)就是成本低:用于兔免疫的疫苗售價每劑量僅幾分錢。正如上面所提到的，使用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組VP60的技術(shù)，為此提供了一種較好的選擇。但眾所周知，目前應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞既困難又昂貴，只有解決相關(guān)技術(shù)難題，如培養(yǎng)基成本、生物反應(yīng)器放大技術(shù)等，才能夠使該疫苗的商業(yè)化成為可能。
[0008]桿狀病毒是有囊膜的DNA病毒，特異性感染昆蟲，利用高效的多角體或PlO啟動子，被廣泛用作真核表達(dá)的載體。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括高水平表達(dá)，易于表達(dá)重組蛋白，能夠表達(dá)大片段的外源基因，正確的翻譯后修飾，以及良好的生物安全性等(T A Kost, J P Condreay, D L Jarvis.Baculovirus as versatilevectors for protein expression in insect and mammalian cells.Naturebiotechnology.2005(23)567-575)。然而，通常情況下外源蛋白的表達(dá)水平仍遠(yuǎn)低于野生型病毒所表達(dá)的多角體蛋白。通過對昆蟲細(xì)胞基因組進(jìn)行分子水平上的改進(jìn)等努力將有利于顯著提高外源基因的表達(dá)量。
[0009]病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是一種高度有效類型的亞單位疫苗半成品，它模仿病毒粒子的整體結(jié)構(gòu)，卻不含有傳染性遺傳物質(zhì)。事實(shí)上，病毒樣顆粒完全缺乏DNA或RNA病毒的基因組，只擁有和滅活、減毒病毒疫苗所含病毒衣殼蛋白相近的構(gòu)象。通常情況下，僅較低劑量的VLPs作為抗原免疫宿主，便足以達(dá)到正常劑量全病毒疫苗所引起宿主相類似的免疫反應(yīng)。它們除了能激發(fā)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，也已被證明是非常有效的刺激CD4增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)響應(yīng)的抗原物質(zhì)。
[0010]RHDV具有約40nm的直徑。在負(fù)染的電子顯微照片中顯示典型的杯狀病毒形態(tài)，具有規(guī)則排列的杯形結(jié)構(gòu)。該病毒包含一個單鏈正向，含有7437個核苷酸RNA基因組。包括長的編碼一個2344個氨基酸殘基的多聚蛋白的開放閱讀框架ORFl的和一個較短的開放閱讀框架0RF2。在RHDV基因組中，ORFl從10至7042的核苷酸編碼一個多聚蛋白，并可以被裂解成衣殼蛋白VP60。衣殼蛋白VP60主要來自兩條途徑:上述多聚蛋白的水解加工和亞基因組 RNA (SgRNA)的翻譯(M Soledad Marin, J M Martin Alonso, L I PerezOrdoyo Garcia et al.1mmunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virusstructural protein VP60 expressed by a recombinant baculovirus: an efficientvaccine[J].Virus research, 1995, 39(2):119-128 ；J A Boga, M S Marin, R Casais etal.1n vitro translation of a subgenomic mRNA from purified virions of theSpanish field isolate AST/89 of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV).VirusResearch.1993(26)33-40.)。重組VP60能夠自我裝配成病毒樣顆粒，擁有立體構(gòu)象，而且VP60的N端第62個氨基酸之后的氨基酸即使缺失，也不會影響其包裝功能。大量研究結(jié)果證明，RHDV的衣殼蛋白VP60與病毒的致病性和免疫性密切相關(guān):RHDV在宿主細(xì)胞中完成一個復(fù)制周期后，由VP60組裝的衣殼將子代病毒RNA包裹形成完整的病毒粒子，然后細(xì)胞裂解，病毒粒子釋放，繼續(xù)侵染其它的敏感細(xì)胞。VP60有2個主要抗原區(qū):一個在N端，位于第31~250位氨基酸殘基處；另一個在C端，位于第477~579位氨基酸殘基處。重組VP60能夠自我裝配成病毒樣顆粒，且能模擬完整的RHDV病毒子誘導(dǎo)宿主的免疫系統(tǒng)，這一發(fā)現(xiàn)為研制RHDV的新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種新的安全、高效的兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗。這種疫苗含有本發(fā)明提供的重組RHDV衣殼蛋白VP60，不含有RHDV病毒基因組成分，從而避免了病毒擴(kuò)散和基因組釋放的風(fēng)險。本發(fā)明的內(nèi)容包括:
[0012](I)本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，所述載體是分別在PVL1393載體PolyA后的SnaB I酶切位點(diǎn)插入HS4序列；在多克隆位點(diǎn)之前插入蜂毒素信號肽；在多克隆位點(diǎn)中插入一個拷貝的RHDV結(jié)構(gòu)蛋白VP60基因(圖1)。插入絕緣子后可以顯著提高VP60蛋白的表達(dá)量，而增加蜂毒素分泌信號肽可以是VP60能夠為正確引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)加工，并分泌到細(xì)胞外。這樣得到的蛋白表達(dá)量顯著提高，且表達(dá)的蛋白絕大多數(shù)被分泌到培養(yǎng)上清中，避免了破碎細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，極大的簡化了純化環(huán)節(jié)。
[0013](2)提供一種大規(guī)模低成本培養(yǎng)工藝，較傳統(tǒng)工藝顯著降低了成本，且采用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，整個生產(chǎn)過程完全在搖瓶和生物反應(yīng)器中完成，符合GMP的要求,產(chǎn)品品質(zhì)高，批次穩(wěn)定，質(zhì)量可控，是一種明顯優(yōu)于組織疫苗的新疫苗。
[0014](3)本發(fā)明所涉及的疫苗，添加了佐劑，有效的提高了疫苗的免疫效果，間接的降低了生產(chǎn)成本，而傳統(tǒng)的組織疫苗受限于含有大量組織成分，導(dǎo)致疫苗粘稠而無法添加任何佐劑，只能采用生理鹽水稀釋。
[0015]本發(fā)明的的技術(shù)路線是
[0016](I)本發(fā)明所述重組桿狀病毒的構(gòu)建是:在PVL1393轉(zhuǎn)移載體的PolyA后的SnaB I酶切位點(diǎn)插入HS4序列；在多克隆位點(diǎn)之前插入蜂毒素信號肽；在多克隆位點(diǎn)中插入RHDV結(jié)構(gòu)蛋白VP60序列；在外源基因的N端含有6個組氨酸的標(biāo)簽序列；該重組的桿狀病毒被命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，該株病毒于2013年08月02日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8052。
[0017](2)該重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC N0.8052能夠感染Sf9細(xì)胞并高效率的分泌表達(dá)重組亞單位蛋白VP60，該重組VP60蛋白質(zhì)在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白質(zhì)并能夠進(jìn)一步自組裝成RHDV衣殼蛋白。
[0018](3)所述的RHDV衣殼蛋白，即病毒樣顆粒蛋白，其特征在于在Sf9細(xì)胞中表達(dá)量比常規(guī)商業(yè)化載體PVL1393系列載體的表達(dá)量更高，且被分泌到胞外，穩(wěn)定存在于表達(dá)的上清液中，此上清液不需要經(jīng)純化即能使用。
[0019](4)該重組RHDV衣殼蛋白在抗原性和免疫源性上與天然的RHDV—樣，并且能夠誘導(dǎo)兔產(chǎn)生針對RHDV感染的免疫應(yīng)答的一種蛋白。
[0020](5)本發(fā)明所涉及的用于預(yù)防兔病毒性出血癥的病毒重組亞單位疫苗，包含了以上所述重組RHDV衣殼蛋白和表達(dá)的上清液。
[0021 ] (6)該疫苗為肌肉注射劑型，含有獸用生物制品常用的佐劑。
[0022](7)該兔病毒性出血癥病毒亞單位疫苗的大規(guī)模制備方法，包括如下步驟:
[0023]利用三角搖瓶無血清全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞制備種子細(xì)胞；
[0024]利用三角搖瓶無血清全懸浮制備表達(dá)RHDV亞單位蛋白VP60的重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC N0.8052 ；
[0025]將種子細(xì)胞直接接種入攪拌式生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，將生物反應(yīng)器的培養(yǎng)規(guī)模放大至1000L細(xì)胞罐，并通過流加培養(yǎng)工藝將細(xì)胞密度培養(yǎng)至2.0X IO6ceIls/ml~4.0X 106cells/ml,在此細(xì)胞密度情況下，以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,Μ0Ι)為0.5~5.0接種病毒CGMCC N0.8052,培養(yǎng)72~140h，收獲上述疫培養(yǎng)液上清，經(jīng)滅活、加入氫氧化鋁膠混合后制成疫苗；
[0026](8)該制備方法中在于:全部培養(yǎng)過程，包括細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，均為單細(xì)胞全懸浮的、無血清、無蛋白培養(yǎng)環(huán)境；
[0027]使用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，并且最大細(xì)胞培養(yǎng)罐達(dá)到1000Lo
[0028]本發(fā)明詳細(xì)描述
[0029]一、重組的桿狀病毒的構(gòu)建
[0030]絕緣子是一段DNA序列，可以將目標(biāo)基因與其周圍的調(diào)控元件隔離，以確保其表達(dá)(J A Wallace, G Felsenfeld, We gather together:1nsulators and genomeorganization.Current Opinion in Genetics and Development.2007(17)400 - 407)。已經(jīng)確定了兩類絕緣子:增強(qiáng)-阻斷絕緣子和隔斷絕緣體。增強(qiáng)-阻斷絕緣子可以阻斷末端增強(qiáng)作用，并防止不適當(dāng)?shù)募せ钤谠鰪?qiáng)子和啟動子之間的基因表達(dá)。阻斷絕緣子可以阻止異染色質(zhì)的擴(kuò)展和保護(hù)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。許多在酵母，果蠅，人類和其它真核生物基因組中的絕緣子已經(jīng)被鑒定出來。他們通常定位在基因附近的區(qū)域，而且通常包含DNA酶-1敏感位點(diǎn)。雞5-HS4-珠蛋白絕緣子(HS4)長約1.2kb，見圖2，是最常見的研究脊椎動物的絕緣體，。它具有增強(qiáng)-阻斷絕緣子和隔斷絕緣子雙重功能，同時還具有阻斷沉默子的效果(SYaoj C S Osborne，R R Bharadwajj P Pascerij T Sukonnikj D Pannellj F Recillas-Targaj AG West,J Ellis.Retrovirus silencer blocking by the cHS4 insulator is CTCFindependent.Nucleic Acid Research.2003 (31)5317 - 5323)D
[0031]我們實(shí)驗室的前期工作發(fā)現(xiàn)，HS4絕緣子置于桿狀病毒表達(dá)載體的目的基因表達(dá)盒的下游，多角體蛋白啟動子啟動的基因表達(dá)顯著增加。進(jìn)一步，我們嘗試將HS4絕緣子置于RHDV主要結(jié)構(gòu)蛋白(VP60)表達(dá)盒的下游，發(fā)現(xiàn)VP60的表達(dá)量在48h、72h、96h和120h都有大幅提高，其中72h的表達(dá)量大約是對照組的6倍，其它時間段3~5倍之間。結(jié)果暗示VP60蛋白表達(dá)受到異染色質(zhì)效應(yīng)的影響而降低其表達(dá)水平，HS4能夠降低這種影響的水平。
[0032]我們前期的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，Sf9細(xì)胞表達(dá)VP60蛋白，在組裝成類病毒顆粒后，是能夠被分泌到細(xì)胞外的，也就是說在沒有信號肽的情況下，胞內(nèi)表達(dá)形成病毒樣顆粒具有一套分泌機(jī)制。在常規(guī)表達(dá)的情況下，表達(dá)的50%蛋白都可以通過分泌途徑分泌到胞外環(huán)境。同時我們也發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)情況下，有超過90%的類病毒顆粒不能夠被分泌到胞外，原有的分泌通路處于限制性環(huán)節(jié)。只有通過對收獲的細(xì)胞病毒懸液進(jìn)行反復(fù)凍融，才能夠使胞內(nèi)的大量的類病毒顆粒釋放出來。所以我們考慮通過在VP60上增加信號肽來促進(jìn)類病毒顆粒的分泌。
[0033]多數(shù)哺乳動物基因的信號肽往往不能被昆蟲細(xì)胞識別，若將包含信號肽的全基因克隆到重組桿狀病毒，常 常不能實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá)。TessieKD C Tessier, D Y Thomas, HE Khouri et al.Enhanced secretion from insect cells of a foreign protein fusedto the honeybee melittin signal peptide.Gene.1991 (98) 177-183)等于 1991 年首先報道蜂素信號肽(Honeybee melittin signal peptide)能夠介導(dǎo)外源蛋白通過分泌表達(dá)的形式存在于培養(yǎng)上清中，并能夠使外源蛋白的表達(dá)量增加5倍。所以我們通過在多角體啟動子的上游添加蜂毒信號肽的方法來提高類病毒顆粒的分泌比例。
[0034]1.兔病毒性出血癥病毒(RHDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP60基因的擴(kuò)增
[0035]抽提齊魯動物保健公司所擁有毒株RHDV北京株的基因組RNA，根據(jù)NCBI上公布的一株RHDV基因組序列(GENBANK公布該蛋白的蛋白序列:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/25121581 (登陸號:NP_740333.1)，并且該蛋白對應(yīng)的基因序列在兔瘟病毒基因組中可以查到:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/9790292?report=genbank,蛋白編號:NP740333.1)，設(shè)計合成VP60基因上下游引物(由上海生工生物工程有限公司合成)VP60-F (序列2)/VP60-R (序列3)。然后使用RT-PCR的方法擴(kuò)增VP60基因，將擴(kuò)增出的基因克隆入PMD19-T載體中(pMD19-VP60)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中。
[0036]2.構(gòu)建含有絕緣子順式作用元件和蜂毒素信號肽的轉(zhuǎn)移載體
[0037](I)含有蜂毒素信號肽的載體構(gòu)建
[0038]人工合成含有蜂毒素信號肽序列(HBM)的DNA片段(序列4，該DNA片段包括蜂毒素信號肽，6個組氨酸標(biāo)簽(6XHis Tag)，多克隆位點(diǎn)等(由上海生工生物工程有限公司完成)，合成的DNA片段已經(jīng)克隆入pMD19-T載體(寶生物工程(上海)有限公司)中(PMD19-HBM)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中，然后PCR擴(kuò)增該片段，使用BamH I ,Pst I雙酶切PVL1393載體和PCR產(chǎn)物，然后將雙酶切的PCR產(chǎn)物與載體相連，合成的含有蜂毒素信號肽的DNA片段就替換了 PVL1393上的相應(yīng)的一段序列。
[0039](2)在含有蜂毒素信號肽的載體插入HS4絕緣子基因序列
[0040]根據(jù)GeneBank 公布序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/U78775.2 登陸號:U78775.2)人工合成全長的HS4絕緣子序列(序列5，由上海生工生物工程有限公司完成)DNA片段。合成的DNA片段已經(jīng)克隆入pMD19-T載體(寶生物工程(上海)有限公司)中(PMD19-HBM)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中，通過PCR擴(kuò)增該片段，然后將其通過單酶切連接的方法插入到上述構(gòu)建好的含有蜂毒素信號肽的PVL-HBM位于基因表達(dá)盒下游的SnaBI酶切位點(diǎn)。新的載體命名為pVL-HBM_HS4。
[0041]3.構(gòu)建含有VP60基因的昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒并制備重組昆蟲細(xì)胞桿狀病毒
[0042]昆蟲細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PVL-HBM-HS4經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI/KpnI37°C過夜消化水解后，用凝膠電泳及過濾柱抽提純化。在T4DNA連接酶的作用下，與使用EcoRI/Kpnl酶切PMD19-VP60質(zhì)?；厥盏腣P60基因片段于16°C連接過夜，然后采用熱休克方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0043]具體操作如下:將50 μ 1DH5 a感受態(tài)細(xì)胞移入到一小塑料離心管中，加入5 μ I的連接反應(yīng)液，混勻后將小管置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克90s，迅速放回冰上，211^11后加入95(^11^培養(yǎng)基，371:培養(yǎng)lh。取ImL菌液濃縮成100 μ I涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有100μ g/ml氨芐西林)上，37°C培養(yǎng)16h，使用VP60-F (序列2)/VP60_R (序列3)引物進(jìn)行菌落PCR，鑒定長出的陽性克隆，引物序列如下:
[0044]具體操作:挑取長出的單菌落接種于2mlLB培養(yǎng)液(含有100 μ g/ml氨芐西林)中，37°C，轉(zhuǎn)速250r/min，震蕩培養(yǎng)2h，然后取1μ I菌液作為模板PCR，然后瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出陽性克隆。然后送測序。保存測序正確克隆，獲得轉(zhuǎn)移載體PVL-HBM-HS4-VP60。將PVL-HBM-HS4-VP60 載體與 BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA (美國 TRANSLAB產(chǎn)品)共感染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒。
[0045]在6cm的組織培養(yǎng)皿中接種2 X 106個Sf9細(xì)胞，細(xì)胞匯合度為50%~70%。待細(xì)胞貼壁后(大約15min)，從培養(yǎng)皿中移除培養(yǎng)基，加ImL的轉(zhuǎn)染緩沖液A。將0.5 μ g的BDBaculoGold Linearized BaculovirusDNA 和 2 μ g 的 pVL-HBM-HS4_VP60 質(zhì)粒在無菌 EP 管中混勻放置5min，加入ImL轉(zhuǎn)染試劑B，混合均勻，吸取ImL的轉(zhuǎn)染試劑B/DNA混合物一滴一滴的滴加到組織培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在27°C孵育4h，移除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使用細(xì)胞培養(yǎng)基洗三次，加入3mL新鮮培養(yǎng)基在27°C培養(yǎng)4~5天。使用封口膜將培養(yǎng)皿封口，同時在培養(yǎng)箱中放入濕紙巾。4天后收獲上清，獲得重組病毒。
[0046]通過蝕斑實(shí)驗獲得單克隆桿狀病毒。具體操作如下:
[0047](I)在6謹(jǐn)?shù)慕M織培養(yǎng)皿中接種2~2.5X IO6個Sf9細(xì)胞，室溫下放置5min。梯度稀釋(10-4~10-7)收獲的共轉(zhuǎn)染病毒上清。在每一個培養(yǎng)皿中加入ImL稀釋的病毒。在室溫下放置Ih,每過15min搖晃一下,讓病毒充分感染。
[0048](2)同時使用無菌水配置2%的低濃度瓊脂糖，使用微波加熱到60°C充分融化。然后放入42°C水浴鍋中保溫，然后加入等體積的Grace培養(yǎng)基(GIBCO，2倍濃縮)混合均勻。
[0049](3)吸走培養(yǎng)皿中上清，使用槍頭小心的在細(xì)胞表面覆蓋4mL的1%瓊脂糖，同時吸走所有的氣泡。大約10~15min后瓊脂糖凝固。
[0050](4)然后將培養(yǎng)皿在濕潤的環(huán)境中27°C培養(yǎng)7天就可以看到噬斑。在培養(yǎng)皿上畫一個點(diǎn)標(biāo)記噬斑，然后使用槍頭挑取數(shù)個噬斑，放入700 μ I SF-SFM培養(yǎng)基(蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司)中與4°C搖晃過夜。獲得病毒懸液(PO代)，_80°C冷凍保存作為種子庫。
[0051]將收獲重組桿狀病毒命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60，該病毒于2013年08月02日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.8052。
[0052]重組桿狀病毒滴度的測定:
[0053]采用空斑計數(shù)法，準(zhǔn)備20ml細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 105cells/ml，于6孔板中每孔鋪2ml細(xì)胞。待低熔點(diǎn)瓊脂液化后，馬上將低熔點(diǎn)瓊脂、昆蟲培養(yǎng)基(蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)放入超凈臺。吸取13ml4%低熔點(diǎn)瓊脂加入裝有39ml培養(yǎng)基(濃度為常規(guī)培養(yǎng)基的1.3倍)試劑瓶中，溫和混勻。準(zhǔn)備好后，放于40°C水浴中。用昆蟲培養(yǎng)基將病毒稀釋7個濃度梯度(KT1~10_7)，方法:取0.5ml病毒液放入4.5ml培養(yǎng)基中(用IOml無菌離心管)，稀釋為10-1，其余依此類推。Pl代病毒測10_4、10_5、10_6三個滴度，P2代病毒測10_5、10' 10_7，P3代病毒測10' 10' 10_8三個滴度，每個滴度4個孔。細(xì)胞貼壁后將6孔板中的培養(yǎng)基移去，馬上加入Iml病毒稀釋液。在27°C培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將病毒液吸出，馬上將放在40°C水浴的平板培養(yǎng)基(低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基)放入超凈臺，將2ml的平板培養(yǎng)基放入。將孔板用封 口膜包好，并放于自封袋內(nèi)，于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后第7~10天時，配制lmg/ml的中性紅溶液(用滅菌蒸懼水配制)。每孔加入0.5ml (或lml)的lmg/ml的中性紅溶液，室溫孵育I~2h。觀察到重組病毒形成的近似透明的小點(diǎn)即為空斑。計算統(tǒng)計觀察病毒蝕斑形成單位(plaque forming units, PFU)。利用公式“滴度=蝕斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X (I/接種體積ml/孔)”，計算病毒滴度，優(yōu)化范圍是6孔板上每個孔計算3~20個斑。
[0054]4.重組桿狀病毒侵染Sf9細(xì)胞生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒的檢測和鑒定
[0055](I)重組桿狀病毒侵染Sf9細(xì)胞生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒
[0056]200mlSf9細(xì)胞懸液培養(yǎng)于IL螺口三角搖瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基SF-SFM (蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司)，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，溫度恒定于27°C。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2X 106cells/ml時，以MOI=0.5接種桿狀病毒rBac-HBM-HS4_VP60。培養(yǎng)96h后，收集上清，4°C 3000r/min離心lOmin，收集上清液，-20°C冷凍保存。由于上清中病毒樣顆粒具有蛋白特性，能夠被SDS凝膠電泳(見圖4)檢測和Westernblot檢測(見圖5)
[0057](2 )凝膠蛋白電泳檢測VP60蛋白的表達(dá)
[0058]取上述培養(yǎng)重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，4°C離心(9000r/min)5min，收集上清液，進(jìn)行SDS凝膠電泳。設(shè)置電泳條件為恒定電壓100V，時間為2h。結(jié)束后，凝膠置于1%R型考馬斯亮藍(lán)染色液中，水平搖擺染色lh，然后用脫色液脫色，并拍照，見圖6。
[0059](3) Westernblot檢測分析VP60蛋白的表達(dá)[0060]取上述培養(yǎng)重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，4°C離心(9000r/min)5min,收集上清液，取10 μ I與10 μ I的2XSDS上樣緩沖液混合，99°C處理5min后，將樣品加入12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的點(diǎn)樣空中，進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜時，恒定電流300mA，4°C下轉(zhuǎn)移1.5h，取出硝酸纖維素膜放于5%脫脂奶粉中封閉3h。孵育時，一抗采用抗6個組氨酸的兔源抗體(I: 500)，二抗采用的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(I: 1000)。
[0061](4) RHDV病毒楊顆粒的HA滴度檢測
[0062]將96孔血凝板的連續(xù)18個孔標(biāo)記，每孔加入0.25ml生理鹽水，再向第一個孔加入0.25ml的重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，將樣品進(jìn)行1: 2的倍比稀釋，設(shè)置6~8個孔的空白對照，只添加生理鹽水，向每一孔加入0.25ml 1%的人O型紅血球，混勻后37°C放置20min，查看并記錄血凝結(jié)果，見圖7。
[0063](5) RHDV類病毒顆粒的純化
[0064]采用蔗糖梯度離心，將收獲的病毒懸液(RHDV\約150ml)分裝至50ml離心管中，用高速冷凍離心機(jī)離心(500g) lOmin，棄去上清。用密度梯度離心裂解液約10ml，將4個離心管中的細(xì)胞沉淀重懸,再加入蛋白酶抑制劑(上海生工生物工程有限公司，ProteaseInhibitor Cocktail，ImL用于109cells)及PMSF蛋白酶抑制劑(苯甲基磺酰氟，100X，終濃度0.1mM)。將裂解好的懸液放至冰上，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲超聲lOmin，顯微鏡下看超聲效果。超聲完畢后將混合液分裝至2mlEP管中，用高速冷凍離心機(jī)，12000r/min，4°C離心15min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，再離心15min。將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，每個樣品6個EP管，1.5ml/個，準(zhǔn)備做蔗糖梯度離心。轉(zhuǎn)頭可以放置6個離心管。將6個離心管加滿40%的蔗糖(Sigma Sucrose, BCBH5304V)，根據(jù)樣品的量吸出適量的蔗糖，將樣品慢慢加到蔗糖上面。安裝不銹鋼套管編號。離心速度:200000g (39900r/min)，離心2h，溫度4°C。將離心好的樣品取出 ，用400 μ ITAE溶液重懸樣品沉淀(留樣檢測)。在2個離心管中依次加入30%，45%，60% (W/W)的蔗糖，加的時候用長針頭從底部往上加。在兩個超速離心管中各加入200 μ I含病毒樣品的溶解液。150000g，4°C離心2h。離心完畢后，發(fā)現(xiàn)60%蔗糖層內(nèi)有一條明亮的條帶，即為目標(biāo)蛋白，用槍頭將蛋白吸出。
[0065]電鏡拍片檢測:將少量的純化濃縮后的RHDV病毒樣顆粒樣品固定處理后，置于新制備的無負(fù)荷塑膠/碳包被網(wǎng)格上，用數(shù)滴蒸餾水輕輕沖洗幾次后，加上2%磷鎢酸鈉溶液進(jìn)行負(fù)染色。電子顯微鏡下觀察并拍片，見圖8。
[0066]二、生產(chǎn)種毒批的制備和保存
[0067]重組桿狀病毒制備工藝主要包含重組PVL1393質(zhì)粒(保存在宿主菌中)和同源重組成功并通過噬斑實(shí)驗純化的重組桿狀病毒(第一代毒)。前者加入甘油保存在_80°C中，生產(chǎn)用種毒是在第一代毒中加入3%胎牛血清分裝保存在_80°C中，種毒的長期實(shí)驗室保存是通過抽提重組病毒基因組保存在_80°C中。制備生產(chǎn)用病毒批通常是將分裝保存的種毒Pl(第一代)病毒感染Sf9細(xì)胞制備P2 (第二代)病毒、依次類推制備P3 (第三代)病毒。
[0068]生產(chǎn)用種毒批的制備和保存方法如下:
[0069]1.將收獲的同源重組成功的病毒通過噬斑實(shí)驗，篩選幾個噬斑制備出純的重組病毒。此為PO病毒；
[0070]2.將PO病毒感染Sf9細(xì)胞，收獲Pl病毒；
[0071]3.將Pl病毒添加20%血清后按照每細(xì)胞凍存管Iml進(jìn)行分裝，然后放于-80°C冰箱保存，作為生產(chǎn)用的種毒庫。依次擴(kuò)增Pl種毒獲得P2, P3病毒,P3病毒作為生產(chǎn)用病毒。
[0072]按照這種方法制備一個批次的種毒可以供一個生產(chǎn)周期的使用，且種毒性質(zhì)均一。種毒批用完之前，不需要重新制備種毒。
[0073]三、疫苗生產(chǎn)
[0074](I)復(fù)蘇凍存Sf9細(xì)胞的種子細(xì)胞Iml于100ml無血清培養(yǎng)基中，置于500ml螺口玻璃三角搖瓶中培養(yǎng)，搖床溫度27°C，轉(zhuǎn)速110r/min。培養(yǎng)48h后補(bǔ)加200ml無血清培養(yǎng)基，稀釋傳代于3000ml螺口玻璃三角搖瓶中。培養(yǎng)48h后補(bǔ)加400ml無血清培養(yǎng)基。按照每48h，l: 2稀釋比例傳代至3000ml種子細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到3.0X106cells/ml ;
[0075](2)上述3000ml種子細(xì)胞接種入30L攪拌式生物反應(yīng)器(工作體積20L)。培養(yǎng)72~96h后，通過流加培養(yǎng)添加營養(yǎng)濃縮液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，細(xì)胞密度達(dá)到4.0~8.0X 106cells/m ；
[0076](3)將上述30L攪拌式生物反應(yīng)器中的20L種子細(xì)胞直接接種入1000L生物反應(yīng)器，逐步補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基至總培養(yǎng)體積750L，并通過流加培養(yǎng)工藝將細(xì)胞密度培養(yǎng)至
2.0X 106cells/ml ~4.0X 106cells/ml ；
[0077](4)利用三角搖瓶無血清全懸浮培養(yǎng)制備表達(dá)RHDV亞單位蛋白VP60的重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCCN0.8052，將其以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.5~5.0，接種入以上1000L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中；
[0078](5)收獲上述培養(yǎng)液上清，經(jīng)滅活、加入氫氧化鋁膠混合后制成疫苗。
[0079]3.兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗成品檢驗
[0080]( I)性狀檢驗靜置后，上層為澄清液體，下層為白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。
[0081](2)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。
[0082](3)裝量檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，100ml/瓶應(yīng)不少于100ml。
[0083](4)安全檢測將兔瘟VLP滅活疫苗頸背部免疫1.5~3.0kg健康易感家兔(抗RHDV-HI值為陰性)5只，4ml/只，連續(xù)觀察10日，所有家兔應(yīng)全部健活。
[0084](5)效力檢測將兔瘟VLP滅活疫苗頸背部免疫1.5~3.0kg健康易感家兔(抗RHDV-HI值為陰性)5只，0.5ml/只，免疫后14日連同對照組家兔5只，皮下注射1:10稀釋的兔病毒性出血癥病毒AV-34株強(qiáng)毒Iml (不低于1.0X 103_°個最小致死量)，攻毒后觀察10日，對照組家兔應(yīng)至少死亡4只，免疫組家兔應(yīng)全部健活。
[0085](6)汞類防腐劑殘留量測定分別按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，汞類防腐劑殘留量為0.01%。
[0086]本發(fā)明涉及的微生物資源信息
[0087]本發(fā)明涉及到的重組桿狀病毒是利用商業(yè)化試劑盒(購自BD公司)中所含載體PVL1393，通過載體改造的方法，將蜂毒素信號肽(HBM)和絕緣子(HS4)插入到載體中的適當(dāng)位置，再將兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白(VP60)基因(該基因以本公司所擁有兔病毒性出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)北京株作為模板制成,該毒株是具有農(nóng)業(yè)部生產(chǎn)批準(zhǔn)文號的市售產(chǎn)品兔病毒性出血癥疫苗生產(chǎn)毒株，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的獸藥產(chǎn)品生產(chǎn)批準(zhǔn)文號:獸藥生字(2011) 150256004)插入到上述改造載體的多克隆位點(diǎn)，然后與BaculoGold Linearized baculovirus DNA(桿狀病毒基因組)共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，PVL1393質(zhì)粒與BaculoGold Linearized DNA發(fā)生同源重組，目的基因插入到桿狀病毒基因組中形成環(huán)狀的病毒基因組，然后組裝成完整的病毒顆粒分泌到細(xì)胞外。未發(fā)生同源重組的病毒基因組因為其中含有一個致死性缺失突變，不能組裝成完整病毒構(gòu)建含有上述基因的重組桿狀病毒基因組Bacmi，從而使得同源重組率在99%以上。然后通過噬斑實(shí)驗進(jìn)一步純化挑選重組桿狀病毒。該重組桿狀病毒被命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60，該病毒于2013年08月02日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.8052。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0088]圖1RT-PCR擴(kuò)增VP60基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，圖中1:空白對照；2:VP60基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3:DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0089]圖2人工合成的HS4絕緣子序列DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳，圖中1:空白對照；2:HS4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3:DL5000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0090]圖3重組桿狀病毒(rBac-HBM-HS4-VP60 )表達(dá)質(zhì)粒示意圖。
[0091]圖4重組桿狀病毒侵染昆蟲細(xì)胞(Sf9)表達(dá)RHDV VP60蛋白的SDS凝膠電泳圖，圖中:1:接毒后培養(yǎng)72h上清；2:未接毒培養(yǎng)72h上清(陰性對照1);3:接種野生病毒培養(yǎng)72h上清(陰性對照2);4 =Marker ；5:蔗糖梯度離心純化RHDV病毒樣顆粒樣品(陽性對照)。
[0092]圖5桿狀病毒侵染昆蟲細(xì)胞(Sf9)表達(dá)RHDVVP60蛋白表達(dá)的Western blot分析，A圖中:1:接毒后培養(yǎng)72h上清；2:接毒后培養(yǎng)72h細(xì)胞沉淀；3:未接毒培養(yǎng)72h細(xì)胞懸液；4 =Marker ；5:接毒后培養(yǎng)120h上清；6:接毒后培養(yǎng)120h細(xì)胞沉淀；B圖中:C:未感染重組桿狀病毒的Sf細(xì)胞培養(yǎng)72h細(xì)胞懸液；1:含有HS4絕緣子的Bac-HBM-VP60感染Sf9細(xì)胞后培養(yǎng)72h上清；M =Marker ；2:不含有HS4絕緣子的Bac-HBM_VP60感染Sf9細(xì)胞后培養(yǎng)72h上清
[0093]圖6凝膠法測重組桿狀病毒的滴度
[0094]圖7重組昆蟲桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的RHDV病毒樣顆粒的血凝效價
[0095]圖8純化后的病毒樣顆粒電鏡照片
[0096]本發(fā)明的積極意義
[0097]本發(fā)明涉及一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明涉及疫苗的生產(chǎn)毒株是重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCCN0.8052，該毒株系采用的表達(dá)載體為分泌表達(dá)，且含有6個組氨酸標(biāo)簽，易于蛋白檢測分析用；用其作為生產(chǎn)毒株生產(chǎn)兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗，該疫苗不含病毒基因組，無動物安全危害和潛在散布性；免疫針對性強(qiáng)，能激發(fā)免疫動物產(chǎn)生足量的免疫抗體，并產(chǎn)生長久保護(hù)力。按照本發(fā)明提供的技術(shù)生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒，1000L生物反應(yīng)器中收獲的病毒液血凝價達(dá)到I: 32768~1: 262144，該RHDV病毒顆粒蛋白表達(dá)量約150mg/L，每升病毒液半成品可以制成標(biāo)準(zhǔn)疫苗5000~100000頭份，高于國內(nèi)技術(shù)水平8~20倍；該重組亞單位疫苗添加了佐劑，有效的提高了疫苗的免疫效果和免疫效價該疫苗安全、有效，質(zhì)量穩(wěn)定、可控，是一種明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的滅活組織疫苗的新疫苗。
【具體實(shí)施方式】[0098]通過下述給出的例子可以進(jìn)一步清楚的理解本發(fā)明。但下述實(shí)施例不是對本發(fā)明的限定。
[0099]實(shí)施例1
[0100]——重組昆蟲細(xì)胞桿狀病毒的構(gòu)建
[0101]1.兔病毒性出血癥病毒(RHDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP60基因的擴(kuò)增
[0102]抽提齊魯動物保健公司所擁有毒株RHDV北京株的基因組RNA，根據(jù)NCBI上公布的一株RHDV基因組序列(GENBANK公布該蛋白的蛋白序列:(登陸號:NP_740333.1),并且該蛋白對應(yīng)的基因序列在兔瘟病毒基因組中可以查到，蛋白編號:NP740333.1。)，設(shè)計合成VP60基因上下游引物(由上海生工合成)VP60-F (序列2) /VP60-R (序列3)。然后使用RT-PCR的方法擴(kuò)增VP60基因，將擴(kuò)增出的基因克隆入pMD19-T載體中(pMD19_VP60)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中。
[0103]2.構(gòu)建含有絕緣子順式作用元件和蜂毒素信號肽的轉(zhuǎn)移載體
[0104](1)含有蜂毒素信號肽的載體構(gòu)建
[0105]人工合成含有蜂毒素信號肽序列(HBM)的DNA片段(序列4，該DNA片段包括蜂毒素信號肽，6個組氨酸標(biāo)簽(6XHis Tag)，多克隆位點(diǎn)等(由上海生工生物工程有限公司完成)，合成的DNA片段已經(jīng)克隆入pMD19-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)中(PMD19-HBM)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中，然后PCR擴(kuò)增該片段，使用BamH I ,Pst I雙酶切PVL1393載體和PCR產(chǎn)物，然后將雙酶切的PCR產(chǎn)物與載體相連，合成的含有蜂毒素信號肽的DNA片段就替換了 PVL1393上的相應(yīng)的一段序列。
[0106](2)在含有蜂毒素信號肽的載體插入HS4絕緣子基因序列
[0107]根據(jù)GeneBank 公布序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/U78775.2 登陸號:U78775.2)人工合成全長的HS4絕緣子序列(序列5，由上海生工生物工程有限公司完成)DNA片段。合成的DNA片段已經(jīng)克隆入pMD19-T載體(寶生物工程有限公司)中(PMD19-HBM)，以質(zhì)粒的形式保存在E.coli中，通過PCR擴(kuò)增該片段，然后將其通過單酶切連接的方法插入到上述構(gòu)建好的含有蜂毒素信號肽的PVL-HBM位于基因表達(dá)盒下游的SnaBI酶切位點(diǎn)。新的載體命名為pVL-HBM_HS4。
[0108]3.構(gòu)建含有VP60基因的昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒并制備重組昆蟲細(xì)胞桿狀病毒
[0109]昆蟲細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pVL-HBM-HS4經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I/Kpn I37°C過夜消化水解后，用凝膠電泳及過濾柱抽提純化。在T4 DNA連接酶的作用下，與使用EcoR I/Kpn I酶切PMD19-VP60質(zhì)?；厥盏腣P60基因片段于16°C連接過夜，然后采用熱休克方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0110]具體操作如下:將50 μ 1DH5 a感受態(tài)細(xì)胞移入到一小塑料離心管中，加入5 μ I的連接反應(yīng)液，混勻后將小管置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克90s，迅速放回冰上，2min后加入950 μ ILB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)lh。取ImL菌液濃縮成100 μ I涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有100 μ g/ml氨芐西林)上，37°C培養(yǎng)16h，使用VP60-F (序列2)/VP60_R (序列3)引物進(jìn)行菌落PCR，鑒定長出的陽性克隆，引物序列如下:
[0111]具體操作:挑取長出的單菌落接種于2ml LB培養(yǎng)液(含有100 μ g/ml氨芐西林)中，37°C，轉(zhuǎn)速250r/min，震蕩培養(yǎng)2h，然后取Iul菌液作為模板PCR，然后瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出陽性克隆。然后送測序。保存測序正確克隆，獲得轉(zhuǎn)移載體PVL-HBM-HS4-VP60。將pVL-HBM-HS4_VP60 載體與 BDBaculoGold Linearized Baculovirus DNA共感染 Sf9 細(xì)胞獲
得重組桿狀病毒。
[0112]在6cm的組織培養(yǎng)皿中接種2 X IO6個Sf9細(xì)胞，細(xì)胞匯合度為50%~70%。待細(xì)胞貼壁后(大約15min)，從培養(yǎng)皿中移除培養(yǎng)基，加ImL的轉(zhuǎn)染緩沖液A。將0.5ug的BDBaculoGold Linearized BaculovirusDNA和 2ug 的 pVL-HBM-HS4_VP60 質(zhì)粒在無菌 EP 管中混勻放置5min，加入ImL轉(zhuǎn)染試劑B，混合均勻，吸取ImL的轉(zhuǎn)染試劑B/DNA混合物一滴一滴的滴加到組織培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在27°C孵育4h，移除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使用細(xì)胞培養(yǎng)基洗三次，加入3mL新鮮培養(yǎng)基在27°C培養(yǎng)4~5天。使用封口膜將培養(yǎng)皿封口，同時在培養(yǎng)箱中放入濕紙巾。4天后收獲上清，獲得重組病毒。
[0113]通過蝕斑實(shí)驗獲得單克隆桿狀病毒。具體操作如下:
[0114](1)在6_的組織培養(yǎng)皿中接種2~2.5X106個Sf9細(xì)胞，室溫下放置5min。梯度稀釋(10-4-10-7)收獲的共轉(zhuǎn)染病毒上清。在每一個培養(yǎng)皿中加入ImL稀釋的病毒。在室溫下放置Ih,每過15min搖晃一下,讓病毒充分感染。
[0115](2)同時使用無菌水配置2%的低濃度瓊脂糖,使用微波加熱到60°C充分融化。然后放入42°C水浴鍋中保溫，然后加入等體積的Grace培養(yǎng)基(GIBC0，2倍濃縮)，混合均勻。
[0116](3)吸走培養(yǎng)皿中上清，使用槍頭小心的在細(xì)胞表面覆蓋4mL的1%瓊脂糖，同時吸走所有的氣泡。大約10~15min后瓊脂糖凝固。
[0117](4)然后將培養(yǎng)皿在濕潤的環(huán)境中27°C培養(yǎng)7天就可以看到噬斑。在培養(yǎng)皿上畫一個點(diǎn)標(biāo)記噬斑，然后使用槍頭挑取數(shù)個噬斑，放入700 μ I SFM中與4°C搖晃過夜。獲得病毒懸液(PO代)，-80°C冷凍保存作為種子庫。
[0118]將收獲重組桿狀病毒命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60，該病毒于2013年08月02日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.8052。
[0119]重組桿狀病毒滴度的測定:采用空斑計數(shù)法，準(zhǔn)備20ml細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5X 105cells/ml,于6孔板中每孔鋪2ml細(xì)胞。待低熔點(diǎn)瓊脂液化后,馬上將低熔點(diǎn)瓊脂、昆蟲培養(yǎng)基(蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)放入超凈臺。吸取13ml4%低熔點(diǎn)瓊脂加入裝有39ml培養(yǎng)基(濃度為常規(guī)培養(yǎng)基的1.3倍)試劑瓶中，溫和混勻。準(zhǔn)備好后，放于40°C水浴中。用昆蟲培養(yǎng)基將病毒稀釋7個濃度梯度(KT1~10_7)，方法:取0.5ml病毒液放入4.5ml培養(yǎng)基中(用IOml無菌離心管)，稀釋為10_\其余依此類推。Pl代病毒測10_4、10_5、10_6三個滴度，P2代病毒測10_5、10_6、10_7，P3代病毒測10'10'10_8三個滴度，每個滴度4個孔。細(xì)胞貼壁后將6孔板中的培養(yǎng)基移去，馬上加入Iml病毒稀釋液。在27°C培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將病毒液吸出，馬上將放在40°C水浴的平板培養(yǎng)基(低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基)放入超凈臺，將2ml的平板培養(yǎng)基放入。將孔板用封口膜包好，并放于自封袋內(nèi)，于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后第7~10天時,配制lmg/ml的中性紅溶液(用滅菌蒸懼水配制)。每孔加入0.5ml (或Iml)的lmg/ml的中性紅溶液，室溫孵育I~2h。觀察到重組病毒形成的近似透明的小點(diǎn)即為空斑。計算統(tǒng)計觀察病毒蝕斑的形成單位(plaque forming units,PFU)。利用公式“滴度=蝕斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X (I/接種體積ml/孔)”，計算病毒滴度，優(yōu)化范圍是6孔板上每個孔計算3~20個斑。[0120]4.重組桿狀病毒侵染Sf9細(xì)胞生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒的檢測和鑒定
[0121](I)重組桿狀病毒侵染Sf9細(xì)胞生產(chǎn)RHDV病毒樣顆粒
[0122]200mlSf9細(xì)胞懸液培養(yǎng)于IL螺口三角搖瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基SF-SFM (蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司)，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，溫度恒定于27°C。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2X 106cells/ml時，以MOI=0.5接種桿狀病毒rBac-HBM-HS4_VP60。培養(yǎng)96h后，收集上清，4°C 3000r/min離心lOmin，收集上清液，-20°C冷凍保存。
[0123](2)凝膠蛋白電泳檢測VP60蛋白的表達(dá)
[0124]取上述培養(yǎng)重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，4°C離心(9000r/min)5min，收集上清液，進(jìn)行SDS凝膠電泳。設(shè)置電泳條件為恒定電壓100V，時間為2h。結(jié)束后，凝膠置于1%R型考馬斯亮藍(lán)染色液中，水平搖擺染色lh，然后用脫色液脫色，并拍照，見圖6。
[0125](3) Western blot檢測分析VP60蛋白的表達(dá)
[0126]取上述培養(yǎng)重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，4°C離心(9000rpm)5min,收集上清液，取10 μ I與10 μ I的2XSDS上樣緩沖液混合，99°C處理5min后，將樣品加入12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的點(diǎn)樣空中，進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜時，恒定電流300mA，4°C下轉(zhuǎn)移1.5h，取出硝酸纖維素膜放于5%脫脂奶粉中封閉3h。孵育時，一抗采用抗6個組氨酸的兔源抗體(I: 500)，二抗采用的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(I: 1000)。
[0127](4) RHDV病毒楊顆粒的HA滴度檢測
[0128]將96孔血凝板的連續(xù)18個孔標(biāo)記，每孔加入0.25ml生理鹽水，再向第一個孔加入0.25ml的重組桿狀病毒rBac-HBM-HS4-VP60的細(xì)胞上清，將樣品進(jìn)行1:2的倍比稀釋，設(shè)置6-8個孔的空白對照，只添加生理鹽水，向每一孔加入0.25ml 1%的人O型紅血球，混勻后37°C放置20min，查看并記錄血凝結(jié)果，見圖7。
[0129](5) RHDV類病毒顆粒的純化
[0130]采用蔗糖梯度離心，將收獲的病毒懸液(RHDV\約150ml)分裝至50ml離心管中，用高速冷凍離心機(jī)離心(500g) lOmin，棄去上清。用密度梯度離心裂解液約10ml，將4個離心管中的細(xì)胞沉淀重懸,再加入蛋白酶抑制劑(上海生工生物工程有限公司，ProteaseInhibitor Cocktail，ImL用于109cells)及PMSF蛋白酶抑制劑(苯甲基磺酰氟，100X，終濃度0.1mM)。將裂解好的懸液放至冰上，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲超聲lOmin，顯微鏡下看超聲效果。超聲完畢后將混合液分裝至2mlEP管中，用高速冷凍離心機(jī)，12000RPM，4°C離心15min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，再離心15min。將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，每個樣品6個EP管，1.5ml/個，準(zhǔn)備做蔗糖梯度離心。轉(zhuǎn)頭可以放置6個離心管。將6個離心管加滿40%的蔗糖(Sigma Sucrose, BCBH5304V)，根據(jù)樣品的量吸出適量的蔗糖，將樣品慢慢加到蔗糖上面。安裝不銹鋼套管編號。離心速度:200000g (39900r/min)，離心2h，溫度4°C。將離心好的樣品取出，用400 μ ITAE溶液重懸樣品沉淀(留樣檢測)。在2個離心管中依次加入30%，45%，60% (W/W)的蔗糖，加的時候用長針頭從底部往上加。在兩個超速離心管中各加入200 μ I含病毒樣品的溶解液。150000g，4°C離心2h。離心完畢后，發(fā)現(xiàn)60%蔗糖層內(nèi)有一條明亮的條帶，即為目標(biāo)蛋白，用槍頭將蛋白吸出。
[0131](6)電鏡拍片檢測:
[0132]將少量的純化濃縮后的RHDV病毒樣顆粒樣品固定處理后，置于新制備的無負(fù)荷塑膠/碳包被網(wǎng)格上，用數(shù)滴蒸餾水輕輕沖洗幾次后，加上2%磷鎢酸鈉溶液進(jìn)行負(fù)染色。電子顯微鏡下觀察并拍片，見圖8。
[0133]實(shí)施例2
[0134]——重組桿狀病毒種毒批制備
[0135]制備rBac-HBM-HS4-VP60Pl種毒庫(200支，Iml/支):將純化的PO代重組病毒，感染對數(shù)生長期Sf9細(xì)胞250mL，接毒MOI=0.1~0.01，感染后96h收獲上清，獲得Pl代種毒，具體操作同實(shí)施例3。將收集的Pl代種毒取適量樣品檢測病毒滴度，其余分裝到1.8ml細(xì)胞凍存管，每管加入ImlPl病毒和0.1lml胎牛血清(Invitrogen公司產(chǎn)品)。將上述分裝好的凍存管放于超低溫冰箱-80°C保存。
[0136]實(shí)施例3
[0137]—Sf9細(xì)胞生產(chǎn)用重組桿狀病毒種毒批制備
[0138]將液氮凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后接種于250ml搖瓶，置27°C恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110r/min。待細(xì)胞密度達(dá)到3.0X 106cellS/ml以上時，按照體積比1:2放大到IL搖瓶中，最終放大至3L搖瓶。3L搖瓶細(xì)胞達(dá)到2.0X106cells/ml時，按MOI=0.05~0.1接種重組桿狀病毒，27 °C懸浮培養(yǎng)80~96h，收獲培養(yǎng)液，取樣測定HA效價，定量分裝，冷凍保存，即為生產(chǎn)用毒種。注明收獲日期、毒種代次等。
[0139]實(shí)施例4
[0140]——疫苗病毒液 制備(以按本發(fā)明技術(shù)方案試生產(chǎn)的1308001批、1308002批、1308003批疫苗為例)
[0141](I)復(fù)蘇凍存Sf9細(xì)胞的種子細(xì)胞Iml于100ml無血清培養(yǎng)基中，置于500ml螺口玻璃三角搖瓶中培養(yǎng)，搖床溫度27°C，轉(zhuǎn)速110r/min。培養(yǎng)48h后補(bǔ)加200ml無血清培養(yǎng)基，稀釋傳代于3000ml螺口玻璃三角搖瓶中。培養(yǎng)48h后補(bǔ)加400ml無血清培養(yǎng)基。按照每48h，l: 2稀釋比例傳代至3000ml種子細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到3.0X106cells/ml ;
[0142](2)上述3000ml種子細(xì)胞接種入30L攪拌式生物反應(yīng)器(工作體積20L)培養(yǎng)條件設(shè)定為:接種密度:1.5X 106cells/ml，溫度:27°C, pH:6.2 ~6.3，轉(zhuǎn)速:50 ~80r/min,DO:35%~45%。每天取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2X 107cells/ml ；
[0143](3)將上述30L攪拌式生物反應(yīng)器中種子細(xì)胞按照體積比1: 20的比例將種子細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1000L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)體積400L。1000L細(xì)胞罐的轉(zhuǎn)速為35r/min。培養(yǎng)48h后，當(dāng)1000L細(xì)胞罐細(xì)胞密度達(dá)到約3.5X106cells/ml時，補(bǔ)加培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至1.6 ~1.8X 106cells/ml ；
[0144](4)利用三角搖瓶無血清全懸浮培養(yǎng)制備表達(dá)RHDV亞單位蛋白VP60的重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC N0.8052，將其以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.5接種入以上1000L生物反應(yīng)器的培養(yǎng)的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，96~110h，收獲抗原液。取樣測定HA效價，對人“O”型紅細(xì)胞凝集價為1:32768。
[0145]取搖瓶中健康培養(yǎng)的9L Sf9細(xì)胞，細(xì)胞密度為3.0X106Cells/ml。接種于30L細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)，培養(yǎng)體積18L培養(yǎng)條件設(shè)定為:接種密度:1.5X106cells/ml，溫度:27°C，pH:6.2~6.3，轉(zhuǎn)速:50~80r/min，D0:35%~45%。每天取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2X107cellS/ml時，按照體積比1: 20的比例將種子細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1000L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)體積400L。1000L細(xì)胞罐的轉(zhuǎn)速為35r/min。培養(yǎng)48h后，當(dāng)1000L細(xì)胞罐細(xì)胞密度達(dá)到約3.5X106cells/ml時，補(bǔ)加培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至1.6~1.8X IO6Cells/ml，按照MOI=0.5接種生產(chǎn)種毒繼續(xù)培養(yǎng)，96~110h，收獲抗原液。取樣測定HA效價，對人“O”型紅細(xì)胞凝集價為1:32768。收獲抗原冷凍保存。
[0146]實(shí)施例5
[0147]——滅活及配苗(以按本發(fā)明技術(shù)方案試生產(chǎn)的1308001批、1308002批、1308003批疫苗為例)
[0148]將上述實(shí)施例3培養(yǎng)的病毒液置滅活容器中，在攪拌狀態(tài)下加入濃度為lmol/L的BEI至終濃度為0.005mol/L,邊加邊攪拌，混合均勻后，保持37°C，滅活40~48h。滅活終止時，立即在滅活病毒液中加入過濾除菌的2mol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液，使其終濃度為0.005mol/L,充分?jǐn)嚢杈鶆?。滅活后的病毒液和氫氧化招膠按9: I的體積比進(jìn)行配苗，使疫苗中氫氧化鋁膠含量以氧化鋁表示不超過3.9mg/ml，再加入1%的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的終濃度為0.01%，充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行分裝。
[0149]實(shí)施例6
[0150]——疫苗檢驗(以按本發(fā)明技術(shù)方案試生產(chǎn)的1308001批、1308002批、1308003批
疫苗為例)
[0151]1.性狀檢驗:靜置后，上層為澄清液體，下層為白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。
[0152]2.無菌檢驗:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，均無菌生長。
[0153]3.安全檢測:取49日齡健康易感家兔20只，隨機(jī)分為4組，5只/組，第一組不接種，作為對照，其余3組單劑量(4ml/只)分別接種不同批次(1308001批、1308002批、1308003批)的重組亞單位疫苗疫苗。各組隔離飼養(yǎng)14日，記錄其精神、飲食、糞便、體溫情況以及接種部位是否出現(xiàn)腫脹、壞死和全身不良反應(yīng)。14日時剖殺所有家兔進(jìn)行病理學(xué)檢測，記錄免疫后14天免疫家兔精神、體溫、飲食、糞便情況；接種部位是否出現(xiàn)腫脹、壞死等反應(yīng)，結(jié)果見表1。
[0154]表1兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗安全試驗結(jié)果
[0155]
【權(quán)利要求】
1.一種桿狀重組病毒，其特征在于:該重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體包括:在PVL1393轉(zhuǎn)移載體PolyA后的SnaB I酶切位點(diǎn)插入HS4序列，在多克隆位點(diǎn)之前插入蜂毒素信號肽；在多克隆位點(diǎn)中插入一個拷貝的MEV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因；在外源基因的C端含有6個組氨酸的標(biāo)簽序列，該株病毒被命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60，已于2013年08月02日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8052。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于該重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC N0.8052能夠感染Sf9細(xì)胞并高效率的分泌表達(dá)重組亞單位蛋白VP60，該重組VP60蛋白質(zhì)在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白質(zhì)，并能夠進(jìn)一步自組裝成RHDV衣殼蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的RHDV衣殼蛋白，其特征在于在SF9細(xì)胞中表達(dá)量比常規(guī)商業(yè)化載體pVL1393系列載體的表達(dá)量更高，且被分泌到胞外，穩(wěn)定存在于表達(dá)的上清液中，此上清液不需要經(jīng)純化即能使用。
4.如權(quán)利要求2所述的重組RHDV衣殼蛋白，其特征在于該重組RHDV衣殼蛋白在抗原性和免疫源性上與天然的RHDV —樣，并且能夠誘導(dǎo)兔產(chǎn)生針對RHDV感染的免疫應(yīng)答的一種蛋白。
5.一種用于預(yù)防兔病毒性出血癥的病毒重組亞單位疫苗，其特征是:它包含了權(quán)利要求2所述的重組RHDV衣殼蛋白和權(quán)利要求3所述的表達(dá)的上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防兔病毒性出血癥的病毒重組亞單位疫苗，其特征是:疫苗為肌肉注射劑型， 含有獸用生物制品常用到的佐劑。
7.一種兔病毒性出血癥病毒亞單位疫苗的大規(guī)模制備方法，包括如下步驟: (1)利用三角搖瓶無血清全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞制備種子細(xì)胞； (2)利用三角搖瓶無血清全懸浮制備表達(dá)RHDV亞單位蛋白VP60的重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC N0.8052 ； (3)將種子細(xì)胞直接接種入攪拌式生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，將生物反應(yīng)器的培養(yǎng)規(guī)模放大至I噸細(xì)胞罐，并通過流加培養(yǎng)工藝將細(xì)胞密度培養(yǎng)至2.0X 106cellS/ml~4.0X 106cells/ml ； (4)以感染復(fù)數(shù)為0.5~5.0接種病毒CGMCC N0.8052，培養(yǎng)72~140h ； (5 )收獲上述培養(yǎng)液上清，經(jīng)滅活、加入氫氧化鋁膠混合后制成疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于全部培養(yǎng)過程，包括細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，均為單細(xì)胞全懸浮的、無血清、無蛋白培養(yǎng)環(huán)境。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于使用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，并且最大培養(yǎng)規(guī)模達(dá)到I噸細(xì)胞罐。
【文檔編號】A61K39/12GK103789274SQ201410052289
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】閔慶如, 易小萍, 范志永, 冀海明, 王秀梅, 張大鶴, 宋曉飛, 徐龍濤, 張連秀, 王蕾, 禚寶山, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司