專利名稱：一種與兔出血癥病毒vp60蛋白相結(jié)合的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以與兔出血癥病毒外殼蛋白VP60相互結(jié)合的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，特別涉及一種膜突蛋白MSN，及其在制備治療兔出血癥藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
兔出血癥(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)，俗稱“兔瘟” (Rabbit Plague)，是由兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)引起的急性、烈性、接觸性傳染病，以肝壞死、實質(zhì)臟器水腫、呼吸系統(tǒng)及全身多器官淤血及出血性變化為主要特征，對養(yǎng)兔業(yè)通常造成毀滅性的打擊。VP60作為病毒的唯一外殼蛋白，歷經(jīng)毒株20多年的流行， 仍然保持著高度的同源性，其在疾病的感染和宿主免疫方面具有重要的作用。病毒在肝臟內(nèi)快速大量繁殖，導(dǎo)致致死性肝炎的發(fā)生，表明肝臟組織中存在多種與兔出血癥病毒相互作用的蛋白，因此從兔肝臟中篩選兔出血癥病毒VP60蛋白的相互作用蛋白，在本病的預(yù)防、治療等方面具有重要意義。膜突蛋白(Moesin，MSN)，在細小病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及慢病毒(艾滋病病毒)的繁殖、傳播中具有重要作用，但是MSN其是否能夠參與RHDV的的繁殖和傳播尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種可用于制備兔出血癥藥物的蛋白質(zhì)或核酸，本發(fā)明的一種與兔出血癥病毒VP60蛋白相互結(jié)合的蛋白，其特征在于至少包含如 SEQ ID NO 1所示的序列；經(jīng)測序以及序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為一種膜突蛋白MSN，而目前尚沒有將膜突蛋白MSN用于治療兔出血癥的報道；優(yōu)選的，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還提供了編碼以上所述蛋白的核苷酸序列；優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；本發(fā)明還涉及了含有所述的核苷酸序列的重組載體、含有所述的重組載體的宿主菌，宿主菌可為大腸桿菌(大腸埃希氏菌，Escherichia coli)BL21 (DE3)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種治療兔出血癥的藥物組合物，包括有效劑量的所述的蛋白和藥學(xué)上接受的載體；及一種治療兔出血癥的藥物組合物，包括有效劑量的所述的核苷酸序列和藥學(xué)上接受的載體本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供以上所述的蛋白在制備治療兔出血癥藥物中的應(yīng)用；及所述的核苷酸序列在制備治療兔出血癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下方法實現(xiàn)的
1、從兔肝臟組織cDNA文庫中釣取得到與兔出血癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP60相互作用的蛋白在本項研究中，通過酵母雙雜交技術(shù)，從兔肝臟組織cDNA文庫中釣取得到與兔出血癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP60相互作用的蛋白。經(jīng)測序以及序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為膜突蛋白 MSN(XM_002720059. 1)。2、膜突蛋白MSN蛋白的主要編碼基因片段的克隆及表達克隆了 MSN蛋白的主要編碼基因片段(687nt-2156nt)，長1470bp。將此段基因序列連接到表達載體pET30a中，獲得重組質(zhì)粒pMSN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得了重組 MSN蛋白，該蛋白氨基酸序列長490aa，分子量約57. 5kD。3、膜突蛋白MSN蛋白與病毒粒子結(jié)合的體外驗證通過免疫共沉淀試驗，體外驗證了 MSN蛋白具有和病毒粒子相互結(jié)合的功能，純化的MSN蛋白在1. 15 μ g的條件下，可以抑制8個血凝單位的病毒抗原對人“0”型血紅細胞的凝集作用。4、膜突蛋白MSN蛋白病毒中和試驗以該蛋白質(zhì)與16倍半數(shù)致死劑量的RHDV室溫內(nèi)孵育60min，經(jīng)口服、滴鼻接種 RHDV抗體陰性兔，8天后兔仍然存活，外表健康，病理解剖及切片檢查各臟器也無異常。病毒感染兔，于3日內(nèi)死亡。該膜突蛋白MSN可以用于RHDV的感染中的防治。


圖1為重組膜突蛋白MSN蛋白對RHDV的血凝抑制效果；圖2為病理切片觀察結(jié)果；圖3為血凝試驗結(jié)果；圖4為兔肝酵母cDNA文庫插入片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；1-20 =PCR 產(chǎn)物；M :DL2000Marker圖5為重組質(zhì)粒pGBKT7-VP60的PCR鑒定圖；1 =DLlO, OOOMarker ；2 :pGBKT7_VP60 的 PCR 鑒定；3 水對照圖6為重組質(zhì)粒pGBKT7-VP60的酶切鑒定圖；1 酶切 pGBKT7-VP60 質(zhì)粒產(chǎn)物；2 :DL10, OOOMarker圖7為Y187 (pGBKT7_VP60)與AH109 (pGADT7)的融合產(chǎn)物在QDO平板上生長情況；A 陽性對照；B 陽性對照(QD0-X- α -gal) ；C 陰性對照；D 融合產(chǎn)物圖8為1酵母雙雜交陽性克隆的篩選；圖9為PCR擴增兔膜突蛋白MSN主要編碼基因電泳圖；圖10為pMSN經(jīng)EcoRI+XhoI酶切鑒定結(jié)果；圖11為大腸桿菌中表達重組MSN蛋白(A 對照陰性菌，B 表達的MSN蛋白，C表達的不溶性的MSN蛋白)圖12為RHDV病毒粒子純化結(jié)果(A 電鏡觀察B SDS-PAGE凝膠電泳)；圖13為免疫沉淀試驗結(jié)果(1、陽性對照；2、陰性對照；3、CO-IP結(jié)果；4、蛋白質(zhì) marker)；
具體實施例方式下面通過藥理性及臨床觀察實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1膜突蛋白MSN蛋白與病毒粒子的體外結(jié)合RHDV病毒粒子作為具有凝集人血“0”型紅細胞的特性，以1. 15 μ g重組MSN蛋白與8個血凝單位的病毒粒子，室溫孵育45min，可抑制病毒粒子的血凝活性，而對照組BSA無血凝抑制活性，結(jié)果如表1，圖1所示。表1重組膜突蛋白MSN蛋白對RHDV的血凝抑制效價(單位μ g)
權(quán)利要求
1.一種與兔出血癥病毒VP60蛋白相結(jié)合的蛋白，其特征在于所述的蛋白至少包含如 SEQ ID NO 1所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的與兔出血癥病毒VP60蛋白相結(jié)合的蛋白，其特征在于所述蛋白為膜突蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的與兔出血癥病毒VP60蛋白相結(jié)合的蛋白，其特征在于所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一項所述的蛋白的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDN0:2所7J\ ο
6.一種含有權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列的重組載體及含有該重組載體的宿主菌。
7.一種治療兔出血癥的藥物組合物，其特征在于包括有效劑量的權(quán)利要求1-3任一項所述的蛋白和藥學(xué)上接受的載體。
8.一種治療兔出血癥的藥物組合物，其特征在于包括有效劑量的權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列和藥學(xué)上接受的載體。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述的蛋白在制備治療兔出血癥藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列在制備治療兔出血癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與兔出血癥病毒VP60蛋白相結(jié)合的蛋白及其應(yīng)用，其特征在于至少包含如SEQ ID NO1所示的序列。在發(fā)明中，通過酵母雙雜交技術(shù)，從兔肝臟組織cDNA文庫中釣取得到與兔出血癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP60相互作用的膜突蛋白MSN。通過免疫共沉淀試驗，體外驗證了該蛋白具有和病毒粒子相互結(jié)合的功能，純化的MSN蛋白可以抑制8個血凝單位的病毒抗原對人“O”型血紅細胞的凝集作用。以該蛋白質(zhì)與兔出血癥病毒室溫內(nèi)孵育，經(jīng)口服、滴鼻接種RHDV抗體陰性兔，8天后兔仍然存活，外表健康，病理解剖及切片檢查各臟器也無異常。病毒感染兔，于3日內(nèi)死亡。可見該蛋白可以用于制備治療兔出血癥的藥物中。
文檔編號A61P31/14GK102250234SQ20111015692
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者劉家森, 姜騫, 曲連東, 林歡, 郭東春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所