防治棉花黃萎病的菌劑及其制備方法和它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種防治棉花黃萎病菌劑，該菌劑包括培養(yǎng)基和菌體，其中，所述菌體包括枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus?cereus）、灰綠鏈霉菌（Streptomyces?viridogriseus）和熒光假單胞桿菌（Pseudomonas?fluorescens）。本發(fā)明提供的菌劑能夠有效地防治棉花黃萎病，降低棉花黃萎病大爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提高棉農(nóng)收入，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供了所述菌劑的制備方法及該菌劑在預(yù)防棉花黃萎病中的應(yīng)用。
【專利說明】防治棉花黃萎病的菌劑及其制備方法和它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種菌劑及其制備方法和應(yīng)用；更確切地說，涉及一種防治棉花黃萎病的菌劑及其制備方法和它們在防治棉花黃萎病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的一種真菌性病害，是一種危害性很大的維管束系統(tǒng)病害，由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是幾乎所有棉花生產(chǎn)國棉花生產(chǎn)的主要限制因素。由于高抗黃萎病的棉花品種較少，且對黃萎病致病的機(jī)理以及棉花抗黃萎病的遺傳方式的了解還比較少，因此，目前對棉花黃萎病的防治還是以生物防治為主，但現(xiàn)有的生物菌劑對棉花黃萎病的防治效果均不夠理想，因此，迫切需要開發(fā)一種能夠有效防治棉花黃萎病的菌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有生物菌劑存在的防治棉花黃萎病的效果不理想的問題，提供一種能夠有效防治棉花黃萎病的菌劑及其制備方法和它們的應(yīng)用。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)第一個發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種菌劑，該菌劑包括培養(yǎng)基和菌體，其中，所述菌體包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)第二個發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種菌劑的制備方法，其中，該方法包括:該方法包括:將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0006]本發(fā)明還提供了所述的菌劑在預(yù)防棉花黃萎病中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的的菌劑能夠有效防治棉花黃萎病，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0008]本發(fā)明提供了一種菌劑，該菌劑包括培養(yǎng)基和菌體，其中，所述菌體包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)。
[0009]所述菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每克所述菌劑所含的總活菌數(shù)可以為1-5X101(I個。
[0010]優(yōu)選地，所述菌劑中，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-50%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-50%、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-50%、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-50%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-50%
[0011]更優(yōu)選地，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的25-35%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的25-35 %、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-15 %、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-15 %、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)可以為總活菌數(shù)的10-15%。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基的種類可以在很大范圍內(nèi)改變，可以為各種能夠用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、灰綠鏈霉菌、熒光假單胞桿菌的培養(yǎng)基，例如，可以為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基中的一種或幾種，優(yōu)選為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基能夠商購得到或者根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊”(Microbiology CultureMedia Manual)的記載制備得到。例如，馬鈴薯鹿糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15~20g，水1000mL)的制備方法可以為:將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15~20g，加水至1000mL, 121 °C滅菌即可。[0013]本發(fā)明還提供了所述菌劑的制備方法，其中，該方法包括:將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)的方法包括:在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)，并將分別培養(yǎng)得到的微生物按照比例混合。優(yōu)選情況下，通過在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)及培養(yǎng)后的混合，使得到的每克菌劑的總活菌數(shù)為1-5X101(I個。
[0015]在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，通過在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)及培養(yǎng)后按照比例的混合，所述混合的條件沒有特別的限制，只要能夠使得到的菌劑滿足以下條件即可:以使所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_50%、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus )的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_50%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50% ;優(yōu)選地，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25_35%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-35%、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，所述枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、灰綠鏈霉菌、熒光假單胞桿菌的菌種可以通過商購得到，例如，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心保藏的枯草芽孢桿菌(ACCC01659)、短小芽孢桿菌(ACCC01171)、蠟樣芽孢桿菌(ACCC05302)、灰綠鏈霉菌(ACCC41544)和熒光假單胞桿菌(ACCC10040)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的培養(yǎng)方法沒有特別的限制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌株，30°C培養(yǎng)，直至枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的活菌數(shù)為1-5X 1O 10個/克的培養(yǎng)基。
[0018]所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的培養(yǎng)方法沒有特別的限制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中接種2-5重量份的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的菌株,30°C培養(yǎng),直至短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為1-5 X 1O 10個/克的培養(yǎng)基。
[0019]所述蠟樣芽孢桿菌(BaciIIus cereus)的培養(yǎng)方法沒有特別的限制，例如，可以在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中接種2-5重量份的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的菌株，30°C培養(yǎng)，直至蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為1-5X 10 10個/克的培養(yǎng)基。
[0020]所述灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)的培養(yǎng)方法沒有特別的限制，例如，可以在IO O重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中接種2 - 5重量份的灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的菌株,30 V培養(yǎng)，直至灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為 1-5X101。個 / 克的培養(yǎng)基。
[0021]所述突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的培養(yǎng)方法沒有特別的限制，例如，可以在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中接種2-5重量份的熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的菌株，30 °C培養(yǎng)，直至突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)的活菌數(shù)為1_5X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0022]本發(fā)明還提供了所述的菌劑在防治棉花黃萎病中的應(yīng)用。
[0023]下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更進(jìn)一步的說明。
[0024]實(shí)施例1
[0025](1)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂20g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種5重量份的枯草芽孢桿菌(ACCC01659)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為I X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0026](2)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂20g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種3重量份的短小芽孢桿菌(ACCC01171)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至短小芽孢桿菌的活菌數(shù)為IX 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0027](3)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂20g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種4重量份的蠟樣芽孢桿菌(ACCC05302)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)為I X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0028](4)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂20g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種5重量份的灰綠鏈霉菌(ACCC41544)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至灰綠鏈霉菌的活菌數(shù)為IX101°個/克的培養(yǎng)基。
[0029](5)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂20g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種5重量份的熒光假單胞桿菌(ACCC10040)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至熒光假單胞桿菌的活菌數(shù)為IX 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0030](6)將步驟(1)至(5)中分別得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)按照比例進(jìn)行混合，使得到的菌劑中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20 %、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20 %、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20 %、突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20%，得到菌劑Al。
[0031]實(shí)施例2
[0032](I)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種4重量份的枯草芽孢桿菌(ACCC01659)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.8 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0033](2)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種2重量份的短小芽孢桿菌(ACCC01171)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至短小芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.8 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0034](3)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種3重量份的蠟樣芽孢桿菌(ACCC05302)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.8 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0035](4)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種4重量份的灰綠鏈霉菌(ACCC41544)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至灰綠鏈霉菌的活菌數(shù)為0.8 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0036](5)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂15g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種4重量份的熒光假單胞桿菌(ACCC10040)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至熒光假單胞桿菌的活菌數(shù)為0.8 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0037](6)將步驟(1)至(5)中分別得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)按照比例進(jìn)行混合，使得到的菌劑中，枯草芽孢桿菌(Baci I Ius subti I i s )的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15 %、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%,得到菌劑A2。
[0038]實(shí)施例3 [0039](I)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂18g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種3重量份的枯草芽孢桿菌(ACCC01659)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.5 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0040](2)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂18g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種4重量份的短小芽孢桿菌(ACCC01171)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至短小芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.5 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0041](3)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂18g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種2重量份的蠟樣芽孢桿菌(ACCC05302)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.5 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0042](4)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂18g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種2重量份的灰綠鏈霉菌(ACCC41544)，30°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至灰綠鏈霉菌的活菌數(shù)為0.5 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0043](5)在100重量份的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(將200g去皮馬鈴薯切碎，煮爛后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入瓊脂18g，加水至lOOOmL，121°C滅菌)中接種2重量份的熒光假單胞桿菌(ACCC10040)，3(TC培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至熒光假單胞桿菌的活菌數(shù)為0.5 X 101°個/克的培養(yǎng)基。
[0044](6)將步驟(1)至(5)中分別得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)按照比例進(jìn)行混合，使得到的菌劑中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25 %、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10 %、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20 %、突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的20%，得到菌劑A3。
[0045]實(shí)施例4
[0046]根據(jù)與實(shí)施例3相同的方法制備菌劑A4，不同在于，將步驟(1)至(5)中分別得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)按照比例進(jìn)行混合，使得到的菌劑中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10%、灰綠鏈霉菌(Streptomyces viridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%,,得到菌劑A4。
[0047]實(shí)施例5-8
[0048]分別使用實(shí)施例1-4中制得的菌劑A1-A4對播種前的感病棉花種子進(jìn)行處理，具體步驟如下:分別取5g的菌劑混種于I公斤的脫絨棉花種子，攪拌均勻后播種于盛有滅菌土的營養(yǎng)缽中，期間適量澆水保濕，待2周后棉花幼苗長出第一片真葉，取出營養(yǎng)缽置于含有5xl06CFU/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液中，3mL/株，處理后繼續(xù)培養(yǎng)4周，調(diào)查棉苗黃萎病發(fā)病率。結(jié)果表明，棉花種子經(jīng)菌劑處理后棉苗對黃萎病的抗性顯著提高，結(jié)果如下表1所示。
[0049]對比例I
[0050]根據(jù)與實(shí)施例5-8相同的方法進(jìn)行處理，不同在于沒有使用菌劑，結(jié)果如下表1所示。[0051]表1
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種防治棉花黃萎病的菌劑，該菌劑包括培養(yǎng)基和菌體，其特征在于，所述菌體包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌劑，其中，每克所述菌劑所含的總活菌數(shù)為1-5X101(I個。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其中，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其中，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-35%、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-35%、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15 %、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15 %、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_15%。
5.權(quán)利要求1所述的菌劑的制備方法，其特征在于，該方法包括:將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利 要求5所述的制備方法，其中，所述接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括:在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)和突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens),并將分別培養(yǎng)得到的微生物按照比例混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，通過在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)及培養(yǎng)后的混合，使得到的每克菌劑的總活菌數(shù)為1-5X101(I個，其中，以總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_50%、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-50%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，以所述菌劑中的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-35%、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-35%、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%、灰綠鏈霉菌(Streptomycesviridogriseus)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%、突光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-15%。
9.權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的菌劑在防治棉花黃萎病中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/39GK103525742SQ201310524820
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】戴小楓, 馬雪峰, 陳捷胤, 李蕾, 孔志強(qiáng), 包郁明, 肖紅利, 徐 明, 桂月晶, 祁偉彥, 王新艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所