從血液中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從血液中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：A.將血液樣品與能夠特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物混合并孵育；B.將孵育后的血液樣品流經(jīng)微流控芯片，芯片的微通道內(nèi)至少有一個表面負(fù)載有單鏈多核苷酸，通過多核苷酸與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸的特異性結(jié)合將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來并固定在芯片表面，以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液樣品的分離。本發(fā)明中的芯片的微通道具有特殊的幾何結(jié)構(gòu)，能夠增加血液中細(xì)胞與微通道表面接觸的幾率，從而提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率，且芯片無需進(jìn)行抗體負(fù)載，整個捕獲過程操作簡便，同時芯片也易于長期保存。
【專利說明】從血液中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物與醫(yī)學(xué)檢測，涉及一種從混合細(xì)胞群體中分離稀有細(xì)胞的方法，特別涉及一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]稀有細(xì)胞是指生物樣本中存在的數(shù)量稀少卻具有重要生物學(xué)功能或臨床檢測意義的細(xì)胞，如人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、被病毒感染的細(xì)胞，以及實(shí)體腫瘤中的腫瘤干細(xì)胞等。由于稀有細(xì)胞數(shù)量極其稀少，對其檢測猶如大海撈針，而對其進(jìn)一步的分析就更加困難，因此急需發(fā)展能夠高效、快速的將稀有細(xì)胞從復(fù)雜生物樣本中分離出來的方法與工具。 [0003]人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一類具有代表性的稀有細(xì)胞，它是指自發(fā)或因診療操作由腫瘤病灶播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉(zhuǎn)移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998,95, 4589-4594 ；Pantel K，Brakenhoff RH，Nat.Rev.Cancer2004，4，448-456 ；Zhe XN，Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751 ；Butler TP，Gullino PM, CancerRes.1975,35,512-516) o由于超過90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移造成的(Mehlen P，PuisieuxA，Nat.Rev.Cancer2006，6，449-458)，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移灶的直接來源(DawoodS，Cristofanilli M，Curr.Treat Options Oncol.2007，8，89-95 ;Fidler IJ，Nat.Rev.(68^^1^2003,3,453-458),因此從血液中檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞越來越引起人們的重視。目前已有證據(jù)顯示檢測外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目可用于實(shí)體瘤患者的預(yù)后以及預(yù)測化療的有效性，包括乳腺癌(Cristofanilli M，BuddT，Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004,351，781-791 ;Smerage JB，Hayes DF，Cancer Invest.2008，26，109-114)、前列腺癌(Moreno JG, Miller MC，Gross S，et al.Urology2005，65，713-718 ;De Bono JS，ScherHI，Montgomery RB，et al.Clin.Cancer Res.2008，14，6302-6309 ；Scher HI，Jia XY，DeBono JS, et al.Lancet Oncol.2009，10，233-239)、結(jié)腸癌(Sastre J, Maestro ML, PuenteJ，et al.Ann.0ncol.2008，19，935-938)、腎細(xì)胞癌(Bluemke K，Bilkenroth U，MeyeA，etal.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2009，18，2190-2194)，黑色素瘤(Palmieri G，Satriano SM，Budroni M，et al.BMC Cancer.2006，6，266 ；Mocellin S，Hoon D，AmbrosiA，et al.Clin.Cancer Res.2006，12，4605-4613)等。進(jìn)一步運(yùn)用循環(huán)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷作為潛在預(yù)測指標(biāo)來指導(dǎo)實(shí)體瘤患者的病程分期和復(fù)發(fā)監(jiān)控已成為癌癥研究中一個活躍而重要的課題(Pachmann K，Dengler R, Lobodaseh K, et al.J.Cancer Res.Clin Oncol, 2008,134,59-65)o
[0004]循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外周血中含量極少，每10ml血液可能僅含幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有多達(dá)約1億個白細(xì)胞和500億個紅細(xì)胞(Zhe XN, Cher ML，Bonfil RD，Am.J.Cancer Res.2011，1,740-751)，因此從外周血中快速、高效的分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞是后續(xù)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)、以及分子、功能分析的前提。目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離方法主要可分為兩類。一類是基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中其他細(xì)胞物理性質(zhì)的差異，如密度(Rosenberg R,Gertler R, Friederichs J, et al.Cytometry2002，49，150-158)、大小(VonaG，Sabile A，Louha M，et al.Am.J.Pathol.2000，156，57-63 ；Zheng S，Lin H，Liu J-Q，et al.J.Chromatogr.A.2007，1162，154-161 ；Tan SJ，Yobas L, Lee GYH，et al.2009，11，4,883-892 ;美國專利申請20060254972 ;美國專利7，846，393)等的不同從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞的分離。然而血液中的血細(xì)胞數(shù)量巨大，其密度、大小的分布很寬，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞又具有較大的異質(zhì)性，因此通過細(xì)胞物理性質(zhì)差異分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞往往會混入大量的白細(xì)胞，獲得的樣品純度很低，難以進(jìn)行后續(xù)分析。另一類循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法主要基于其表面與血細(xì)胞不同的獨(dú)特抗原，通過針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體或核算適配體實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲并與血液中其他細(xì)胞分離。目前可選擇的抗原包括上皮細(xì)胞抗原EpCAM，器官特異性標(biāo)志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT標(biāo)志物等(Trzpis M，McLaughlin PM, De Leij LM，Harmsen MC，Am.J.Pathol.2007，171，386-395 ;美國專利申請 20130209493)，這一方法的富集效率可達(dá)(1-20) X 104 倍(Paterlin1-BrechotP, BenaliNL，Cancer Lett.2007，253，180-204)，同時也存在可用于捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的核算適配體(美國專利申請20130035630)。其中最具代表性的技術(shù)是已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的CellSearchTM系統(tǒng)(Cristofanilli M，Budd T,Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004，351，781-791 ；RiethdorfS，F(xiàn)ritsche H，Muller V，et al.Clin.Cancer Res.2007，13，920-928 ；Cohen SJ, PuntCJA，Iannotti N，et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，這一系統(tǒng)運(yùn)用標(biāo)記有針對EpCAM抗體的磁性顆粒進(jìn)行血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，但其捕獲效率較低，存在血細(xì)胞的非特異性吸附，且這一方法捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞已喪失活性，難以進(jìn)行信號通路與功能性分析，無法對其進(jìn)行體外培養(yǎng)。近年來通過將微流控芯片技術(shù)與抗體捕獲相結(jié)合發(fā)展出了一系列的循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片捕獲技術(shù)，通過特殊幾何設(shè)計(jì)的微通道大大增加了細(xì)胞與負(fù)載有抗體的捕獲表面的碰撞幾率以提聞循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率，如微柱陣列芯片(NagrathS,Sequist LV,Maheswaran S, et al.Nature2007,450,1235-1239 ；Maheswaran S,SequistLV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、具有周期性表面凹凸結(jié)構(gòu)的“魚骨型”芯片(Stott SL，Hsu C-H, Tsukrov DI，et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010,107,18392-18397)等，同時保持了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的活性。但是，基于微流控芯片與抗體的捕獲方法的捕獲效率仍有待于進(jìn)一步提高，捕獲到細(xì)胞的純度較低，存在大量白細(xì)胞的非特異性吸附，且這些方法由于需要對芯片進(jìn)行抗體修飾，其操作較為繁瑣，并且負(fù)載了抗體的芯片不易長期保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的，就是為了提供一種從混合細(xì)胞群體中分離稀有細(xì)胞的方法，特別是從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0007]A、將經(jīng)抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物混合并孵育；[0008]B、將孵育后的血液樣品流經(jīng)微流控芯片，芯片的微通道內(nèi)至少有一個表面負(fù)載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸特異性結(jié)合，并通過這種特異性結(jié)合將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液樣品的分離。
[0009]上述方法中，所述抗體-多核苷酸復(fù)合中的單鏈多核苷酸與負(fù)載于芯片微通道表面的單鏈多核苷酸能夠特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的，兩條單鏈多核苷酸中至少有連續(xù)的10個核苷酸互補(bǔ)，更優(yōu)選的，至少有連續(xù)的20個核苷酸互補(bǔ)。
[0010]上述方法中，所述抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸通過共價(jià)鍵與抗體直接相連，或者抗體與標(biāo)記單鏈多核苷酸通過共價(jià)鍵或其他作用力共同連接在納米粒子上。
[0011]上述方法中，所述針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物可以是一種，也可以是針對不同抗原的多種抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物。
[0012]上述方法中，所述芯片微通道中負(fù)載多核苷酸的表面為二氧化硅、硅片或通過沉積了金屬氧化物納米線、納米帶等微結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的粗糙化的表面。
[0013]上述方法中，所述芯片微通道表面上負(fù)載多核苷酸的方式可通過靜電作用或共價(jià)作用。
[0014]上述方法中，所述微流控芯可以通過并聯(lián)的組合形式從而能夠處理更大量的血液樣品，以及通過串聯(lián)的組合形式提聞血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。
[0015]上述方法中，所述微流控芯片具有使所述微流控芯片具有使流經(jīng)該芯片的血液中的細(xì)胞增加與負(fù)載有單鏈多核苷酸表面接觸幾率的幾何結(jié)構(gòu)，該幾何結(jié)構(gòu)包括周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、具有周期性表面凹凸的“魚骨型”結(jié)構(gòu)或表面沉積有納米線、納米帶等微結(jié)構(gòu)基底。
[0016]上述方法中，所述的血液樣品流經(jīng)微流控芯片的流速為每小時100微升至10毫升。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn):
[0018]1)本發(fā)明不同于以往的將抗體固定在微通道表面進(jìn)行捕獲，而是將抗體與細(xì)胞混合，抗體與稀有細(xì)胞表面的特異性抗原結(jié)合，同時這些抗體上連有標(biāo)記單鏈多核苷酸，可以被微通道表面負(fù)載的與之能夠特異性結(jié)合的單鏈多核苷酸所捕獲。這將原來細(xì)胞表面的抗原與微通道表面抗體間的相互結(jié)合轉(zhuǎn)化成細(xì)胞表面結(jié)合的抗體上的多核苷酸與微通道表面負(fù)載的多核苷酸之間的相互結(jié)合。后者相互結(jié)合的能力高于前者，因此稀有細(xì)胞更容易被捕獲。
[0019]2)由于稀有細(xì)胞數(shù)目極少，而大量無關(guān)細(xì)胞(如血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞)在微通道表面、尤其是在負(fù)載了抗體的表面的非特異性吸附導(dǎo)致捕獲到的細(xì)胞純度很低，而且由于這些非特異性細(xì)胞占據(jù)了部分表面導(dǎo)致可用于捕獲的表面減少，捕獲率降低，同時容易粘附樣本中的其他細(xì)胞，使純度進(jìn)一步降低。本發(fā)明中的芯片負(fù)載了多核苷酸，帶負(fù)電，能夠與細(xì)胞表面的負(fù)電相排斥，因而能夠降低非特異性吸附，提高捕獲到細(xì)胞中稀有細(xì)胞的純度。
[0020]3)本發(fā)明只需對芯片進(jìn)行簡單的多核苷酸負(fù)載，而無需進(jìn)行復(fù)雜的抗體負(fù)載，因此整個操作較為簡便，且由于負(fù)載多核苷酸的芯片在真空或氮?dú)獗Ｗo(hù)下可在室溫或4度長期保存，比負(fù)載了抗體的芯片保存更容易，保存時間更長。
[0021]4)美國專利申請US20090017455與中國專利申請200780036725.4采用了抗
體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物與基底多核苷酸特異性結(jié)合在基底上構(gòu)建抗體陣列，捕獲溶液中的能與該抗體結(jié)合的細(xì)胞。其與本發(fā)明的不同之處在于:第一、本發(fā)明將抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物先與細(xì)胞混合，然后再與基底多核苷酸結(jié)合，而以上專利申請中先將抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物與基底多核苷酸結(jié)合，然后再去結(jié)合溶液中的細(xì)胞，與傳統(tǒng)的在表面構(gòu)建抗體陣列用于捕獲溶液中細(xì)胞的方法并無本質(zhì)區(qū)別，而相比之下本發(fā)明對于溶液中細(xì)胞的捕獲效率更高；第二、以上專利申請是將細(xì)胞與固定在基底上的抗體-多核苷酸復(fù)合物做靜態(tài)孵育，而本發(fā)明是將抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物與細(xì)胞混合后在一定流速下通過微流控芯片，該芯片中具有能增加細(xì)胞與微通道表面碰撞幾率的特殊幾何設(shè)計(jì)，大大提聞了細(xì)胞的捕獲效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲過程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0024]A、將經(jīng)抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物混合并孵育；
[0025]B、將孵育后的 血液樣品流經(jīng)微流控芯片，芯片的微通道內(nèi)至少有一個表面負(fù)載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸特異性結(jié)合，并通過這種特異性結(jié)合將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液樣品的分離。
[0026]圖1是血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲過程示意圖，其中，1為血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，2為血液中除循環(huán)腫瘤細(xì)胞外的其他細(xì)胞，3為捕獲抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物，4為表面負(fù)載的單鏈多核苷酸,5為能夠負(fù)載多核苷酸的表面,如表面修飾氨基的玻璃或娃片，6為具有周期性凹凸結(jié)構(gòu)的微流控芯片。經(jīng)抗凝處理的血液樣品中存在少量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞1與大量的其他細(xì)胞2，血液樣品與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物3混合并孵育，孵育后的血液樣品流經(jīng)具有特殊幾何結(jié)構(gòu)的微流控芯片6，芯片的微通道表面5負(fù)載有單鏈多核苷酸4，該多核苷酸能夠與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物3中的標(biāo)記多核苷酸特異性結(jié)合，從而將循環(huán)腫瘤細(xì)胞1與血液樣品中的其他細(xì)胞2分離并固定在芯片表面5。
[0027]本發(fā)明的工作原理是，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與負(fù)載有針對其表面抗原的抗體表面接觸時，其接觸面積較小，作用力較弱，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞先與抗體-多核苷酸復(fù)合物結(jié)合，再與負(fù)載了互補(bǔ)多核苷酸的表面接觸，由于每個抗體上可連接多條標(biāo)記多核苷酸，且在基底上負(fù)載多核苷酸的密度也大于負(fù)載抗體，因此腫瘤細(xì)胞有更大的幾率被基底上負(fù)載的多核苷酸所捕犾。
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029]實(shí)施例1微流控芯片基底負(fù)載多核苷酸
[0030]將序列如SEQ ID N0.1所示的多核苷酸溶于純水，配成濃度400 μ Μ的溶液，再與二甲基亞砜(DMSO)按體積比2:1稀釋為終濃度267 μ Μ的溶液。同時，將用于灌注多核苷酸的聚二甲基硅氧烷PDMS(RTV615，購自通用電氣公司)微流控芯片貼在多聚賴氨酸玻璃(購自賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific公司)上，放在烘箱中80°C處理2小時。處理結(jié)束后，采用恒流泵灌注濃度為267 μ Μ的多核苷酸溶液，灌滿后放于干燥箱中干燥，待通道中液體完全干后，揭下微流控芯片，將玻璃置于烘箱中80°C處理4小時，然后用純水快速清洗出去玻璃表面的鹽和溶劑殘余，氮?dú)獯蹈?。
[0031]實(shí)施例2 “魚骨型” CTC捕獲芯片的制作
[0032]將具有周期性表面凹凸結(jié)構(gòu)的“魚骨型”PDMS芯片(制作方法見Wang，S.T.；Liu,K.；Liu, J.A.et al,.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3084-3088)貼在負(fù)載有多核苷酸的多聚賴氨酸玻璃上，確?！棒~骨型”芯片的微通道與基底多核苷酸區(qū)域重合，將芯片放于烘箱中80°C處理2小時，處理完畢后待芯片恢復(fù)至室溫后用夾具固定?！棒~骨型”芯片有一個入口和一個出口，通道呈連續(xù)的S型，寬度1mm，整體長度為200mm，芯片的橫截面呈周期性的凹凸結(jié)構(gòu)，由兩層SU8光刻膠制備而成，下層光刻膠厚度為70 μ m,上層光刻膠厚度為35 μ m，上層的魚骨圖形呈周期性排列，“魚骨”寬度為35μπι，水平夾角為45度，周期性間隔為100 μ m, 一組共20條“魚骨”。
[0033]實(shí)施例3 “魚骨型”芯片捕獲血液中的稀有腫瘤細(xì)胞
[0034]首先在“魚骨型”芯片中通過恒流泵灌注3%牛血清白蛋白(BSA)，室溫靜置1小時對芯片進(jìn)行封閉。將結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT116懸浮與細(xì)胞培養(yǎng)基中，用細(xì)胞膜紅色熒光探針Dil (購自碧云天)染成紅色，然后取1000個HCT116細(xì)胞與1毫升經(jīng)抗凝處理的健康人的全血混合，同時加入1微升lmg/ml的上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物(序列如SEQ ID N0.2所示，其中序列的5端，即左端標(biāo)記氨基，將單鏈多核苷酸標(biāo)記在抗體上使用美國solulink公司的試劑盒Antibody-01 igonucleotide All-1n-0neConjugation Kit),充分混合半小時后采用注射器和恒流泵以lmL / h的流速通過“魚骨型”PDMS芯片。灌注結(jié)束后，通過恒流泵用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行清洗除去多余血液，同時避光收集流經(jīng)芯片的血液。最后，使用活細(xì)胞工作站對“魚骨型”芯片中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)以計(jì)算捕獲率，更準(zhǔn)確的，可對流經(jīng)芯片的血液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解(紅細(xì)胞裂解液購自碧云天)，然后對其中未被芯片捕獲的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而可以更準(zhǔn)確的計(jì)算捕獲率。通過長度為200_微通道的芯片的捕獲率為61 %，如果連續(xù)流經(jīng)兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達(dá)到400mm時，捕獲率可達(dá)89 %。
[0035]實(shí)施例4納米“魚骨型” CTC捕獲芯片的制作與血液中腫瘤細(xì)胞的捕獲
[0036]利用電紡絲技術(shù)可以在“魚骨型”芯片的基底表面沉淀納米結(jié)構(gòu)，使之粗糙化，從而增加CTC與基底碰撞時被捕獲的效率。電紡絲(Electrospinning)技術(shù)是將強(qiáng)電場作用于聚合物溶液，使之形成絲狀噴射流，可以在收集表面形成直徑為納米級別的纖維。在本實(shí)施例中，使用正硅酸乙酯(TE0S)與聚乙烯吡咯烷酮(PVP)聚合物溶液，通過施加15KV的高壓電場，使聚合物溶液呈絲狀噴射，在硅片表面“紡”出PVP-Si02納米線，經(jīng)過400°C退火后，在光滑的硅片表面形成具有一定粗糙度的Si02納米纖維結(jié)構(gòu)(Zhang，N.；Deng, Y.；Tai,Q.;etal.，Adv.Mater.2012，24，2756-2760)。在納米纖維表面負(fù)載多核苷酸、制作“魚骨型”捕獲芯片以及從血液中捕獲腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例1、2、3，納米“魚骨型” CTC捕獲芯片的捕獲效率可達(dá)65% (200mm長的通道)，如果連續(xù)流經(jīng)兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達(dá)到400mm時，捕獲率達(dá)到92%。
[0037] 實(shí)施例5針對血液中腫瘤細(xì)胞表面多個特異性標(biāo)志物的捕獲
[0038]實(shí)施例3中使用了針對血液中腫瘤細(xì)胞表面特異性的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的抗體進(jìn)行捕獲，由于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116表面除了表達(dá)EpCAM以外，還同時表達(dá)EGFR與CD44，因此同時針對多個表面特異性抗原進(jìn)行的捕獲可進(jìn)一步提高捕獲效率，尤其是可以捕獲不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的HCT116細(xì)胞。【具體實(shí)施方式】同實(shí)施例3，唯一不同的是將加入1微升濃度為lmg / ml的EpCAM-標(biāo)記單鏈多核苷酸(序列如SEQ ID N0.2所示)復(fù)合物改為加入濃度為lmg/ml的EpCAM-標(biāo)記單鏈多核苷酸(序列同上)復(fù)合物、濃度為lmg /ml的EGFR-標(biāo)記單鏈多核苷酸(序列同上)復(fù)合物與濃度為lmg / ml的⑶44-標(biāo)記單鏈多核苷酸(序列同上)復(fù)合物各1微升，其捕獲效率可提升至67%，如果連續(xù)流經(jīng)兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達(dá)到400mm時，捕獲率為98%。
【權(quán)利要求】
1.一種從血液中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟:A、將經(jīng)抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物混合并孵育；B、將孵育后的血液樣品流經(jīng)微流控芯片，芯片的微通道內(nèi)至少有一個表面負(fù)載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸特異性結(jié)合，并通過這種特異性結(jié)合將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液樣品的分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液樣品是指經(jīng)過抗凝處理的全血樣本，其體積為1毫升至10毫升，抗凝劑包括乙二胺四乙酸、檸檬酸或肝素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸與負(fù)載于芯片微通道表面的單鏈多核苷酸能夠特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，兩種單鏈多核苷酸中至少有連續(xù)的10個核苷酸互補(bǔ)，或者至少有連續(xù)的20個核苷酸互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物中的標(biāo)記單鏈多核苷酸通過共價(jià)鍵與抗體直接相連，或者抗體與標(biāo)記單鏈多核苷酸通過共價(jià)鍵或其他作用力共同連接在納米粒子上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述能夠特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面獨(dú)特抗原的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物可以是一種，也可以是針對不同抗原的多種不同的抗體-標(biāo)記單鏈多核苷酸復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道內(nèi)負(fù)載多核苷酸的表面為二氧化硅、硅或通過沉積 金屬氧化物納米線、納米帶而產(chǎn)生的粗糙化的表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道表面通過靜電作用或共價(jià)作用負(fù)載多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯通過并聯(lián)組合使用或通過串聯(lián)組合使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片具有使流經(jīng)該芯片的細(xì)胞增加與負(fù)載有單鏈多核苷酸表面接觸幾率的幾何結(jié)構(gòu)，該幾何結(jié)構(gòu)包括周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、具有周期性表面凹凸的“魚骨型”結(jié)構(gòu)或表面沉積有納米線、納米帶的基底。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液樣品流經(jīng)微流控芯片的流速為每小時100微升至10毫升。
【文檔編號】C12N5/09GK103642755SQ201310546026
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】施奇惠, 鄧宇亮, 張瑜, 孫帥 申請人:上海交通大學(xué)