一株魯氏酵母及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株魯氏酵母及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。魯氏酵母（Zygosaccharomyces?rouxii）已于2013年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8323。該菌株具有較高的耐滲透壓能力，將該菌株應(yīng)用于蠶豆醬傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)過程，具有耐高鹽、縮短傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬周期的特點(diǎn)。
【專利說明】一株魯氏酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及ー株魯氏酵母及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]酵母(Yeast)是ー種肉眼看不見的微小單細(xì)胞微生物，能將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，是ー種天然發(fā)酵劑，分布于整個(gè)自然界，它有自己的生命現(xiàn)象，是ー種典型的兼性厭氧微生物，在有氧氣和沒有氧氣存在的條件下都能夠存活。多數(shù)酵母可以分離于富含糖類的環(huán)境中，比如一些水果(葡萄、蘋果、桃等)或者植物分泌物(如仙人掌的汁)。ー些酵母在昆蟲體內(nèi)生活。酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等。比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大得多，一般為I~5微米或5~20微米，無鞭毛，不能游動(dòng)。
[0003]魯氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)在分類學(xué)上屬于真核生物原界、真菌界、子囊菌門、酵母亞門、酵母綱、酵母目、酵母科、接合酵母屬。魯氏酵母菌落呈圓形，有光澤，平坦，邊緣整齊，在麥芽汁中培養(yǎng)細(xì)胞呈小圓形或卵圓形。適宜生長(zhǎng)溫度為28。。~30°C。最適pH值為4~5，是常見的耐高滲透壓酵母菌。魯氏酵母淀粉酶活力較強(qiáng)，耐高滲透壓，是主要傳統(tǒng)發(fā)酵食品如醬油和甜醬的生產(chǎn)菌，耐鹽性強(qiáng)，屬于增香酵母。
[0004]蠶豆醬是以蠶豆等為原料發(fā)酵釀制而成的保持蠶豆醬原形的半流動(dòng)粘稠體或半固態(tài)調(diào)味品。蠶豆醬在我國(guó)有著悠久的歷史，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，有助消化，增進(jìn)食欲，因此深受廣大消費(fèi)者的歡迎。本發(fā)明涉及的魯氏酵母從蠶豆醬傳統(tǒng)發(fā)酵醬醅中篩選，魯氏酵母是蠶豆醬發(fā)酵過程中的有益酵母，對(duì)醬體風(fēng)味有著積極而重要的貢獻(xiàn)，為蠶豆醬增添特有的香氣。篩選傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的魯氏酵母，為闡明豆瓣醬風(fēng)味形成機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一株魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。
[0006]所述魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),已于2013年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8323，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0007]本發(fā)明所述的魯氏酵母分離自安徽某知名醬品傳統(tǒng)方法釀制的醬醅，該菌株具有典型特征的M13-PCR指紋，即菌株專ー性的特征指紋，如圖1所示；測(cè)序分析，其ITS序列(基因間隔序列)基因型如SEQ ID N0.1所示，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果是，該菌與一株接合酵母屬酵母Zygosaccharomyces sp.(序列ID: emb IHE984156.11 )有最高匹配度。
[0008]所述魯氏酵母能夠耐受20%鹽濃度、縮短傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬發(fā)酵周期。
[0009]所述魯氏酵母為從風(fēng)味ロ感較佳的傳統(tǒng)方法釀制的豆瓣醬醬醅中篩選的酵母菌株，平板菌落計(jì)數(shù)達(dá)到6X 103CFU/g，其保藏條件如下:從生長(zhǎng)良好的YEH)培養(yǎng)基平板中取單菌落移入新鮮的液體YEro培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)24h，取0.75mL移入盛有0.25mL無菌甘油(40%，v/v)的甘油管中，放_(tái)70°C冰箱保存。[0010]所述YEro培養(yǎng)基為:蛋白胨2g ?じ1，酵母粉Ig ?じ1，葡萄糖2g ?じ1，pH自然(不另外調(diào)整pH)。
[0011]所述魯氏酵母培養(yǎng)條件為:將甘油管保藏的魯氏酵母接入YEro液體培養(yǎng)基，在28°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)36h至對(duì)數(shù)中后期，作為種子液。以2% (v/v)接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C 150rpm培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)期。
[0012]本發(fā)明提供了 ー種所述魯氏酵母的應(yīng)用，將培養(yǎng)良好的魯氏酵母在豆瓣醬傳統(tǒng)發(fā)酵過程的中期添加入醬醅，以縮短豆瓣醬的發(fā)酵周期。
[0013]本發(fā)明提供了一株魯氏酵母，應(yīng)用于高鹽濃度傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬，縮短豆瓣醬的發(fā)酵周期。
[0014]生物材料保藏
[0015]本發(fā)明所提供的魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),已于2013年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8323，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1R印-PCR(M13_PCR)擴(kuò)增指紋圖譜，M:lkb ladder, 1:樣品。
[0017]圖2魯氏酵母鹽度耐受性柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1魯氏酵母篩選
[0019]從傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬88天醬醅中取Ig樣品加入到9mL無菌水中，輕微振蕩制成懸濁液，將懸濁液梯度稀釋，涂布于YAP平板，28°C培養(yǎng)6天。挑取乳白色單菌落反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。
[0020]所述YAP培養(yǎng)基為:蛋白胨Igじ1，酵母粉0.5gじ1，葡萄糖Igじ1，丙酸鈉1%，瓊脂2%，pH自然。滅菌條件:115°C，15min。待冷卻至45°C左右加入過濾除菌的青霉素鈉，添加量為2%0。
[0021]鑒定主要通過:1)菌落特征觀察:用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在2.0mm左右，圓形，表面光滑，乳白色等符合酵母菌菌落特征的菌株。2)個(gè)體形態(tài)觀察:用光學(xué)顯微鏡觀察，挑選卵圓形，大小(1-5) UmX (5-30) iim，視野中有明顯出芽細(xì)胞的菌株。將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。
[0022]以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于YEH)培養(yǎng)基中，28°C、150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24h。取適量培養(yǎng)液離心2min (4000rpm，4°C )，棄盡上清液，得到適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用酵母ITS通用引物對(duì)正向引物EF4 (5’-GGAAGGG(G/A)TGTAITTATTAG-3’)、反向引物 EF3(5’ -TCCT (A/C) TAAATGACCAAGTTTG-3’ )擴(kuò)增基因組 DNA，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進(jìn)入以下循環(huán):94°C變性480s，55°C退火40s，72°C延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果良好。將擴(kuò)增產(chǎn)物寄送上海華大基因測(cè)序，結(jié)果如SEQ ID N0.1所示，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，確定為魯氏酵母。
[0023]實(shí)施例2NaCl耐受性實(shí)驗(yàn)[0024]魯氏酵母NaCl耐受性實(shí)驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基為不同NaCl終濃度的YETO培養(yǎng)基。YEro培養(yǎng)基為:蛋白胨2g/L，酵母粉lg/L，葡萄糖2g/L，pH自然(即，不對(duì)pH另行調(diào)整)。115°C滅菌15分鐘。
[0025]以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于YEH)培養(yǎng)基中，28°C，150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)36h。以2%接種量轉(zhuǎn)接至不同NaCl終濃度的YEH)培養(yǎng)基中，28°C，150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)20天，如圖2所示，魯氏酵母在NaCl終濃度10%、12%、14%、16%、18%、20% (%:g/100mL)條件下均能生長(zhǎng)，其中NaCl終濃度10%、12%條件下生長(zhǎng)速度較快，NaCl終濃度14%、16%、18%條件下生長(zhǎng)速度次之，NaCl終濃度20%條件也能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢。
[0026]實(shí)施例3應(yīng)用于高鹽濃度傳統(tǒng)發(fā)酵蠶豆醬
[0027]CGMCC N0.8323Zygosaccharomyces rouxii LBST-Y1 菌株在 YEF1D 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，作為種子液。將種子液接種至鹽度為14%的醬醅，對(duì)照為未接種種子液的鹽度為14%的醬醅，發(fā)酵周期有較明顯的變化，未接種魯氏酵母的醬體在約110天后成熟，而接種魯氏酵母的醬體在約95天后成熟，且接種魯氏酵母的醬體較未接種魯氏酵母的醬體風(fēng)味更加飽滿,香氣更為醇厚。[0028]可以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一株魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),于2013年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8323，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
2.如權(quán)利要求1所述的魯氏酵母，其特征在于耐受20%NaCl。
3.如權(quán)利要求1所述的魯氏酵母，其特征在于縮短傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬發(fā)酵周期。
4.培養(yǎng)權(quán)利要求1-3任一所述魯氏酵母的方法，是將甘油管保藏的魯氏酵母接入YEH)液體培養(yǎng)基，在28°C、150rpm搖瓶培養(yǎng)36h至對(duì)數(shù)中后期，作為種子液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述YEH)液體培養(yǎng)基為:蛋白胨2g/L，酵母粉lg/L，葡萄糖2g/L，pH自然。
6.權(quán)利要求1-3任一所述魯氏酵母應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬，是將魯氏酵母種子液在豆瓣醬傳統(tǒng)發(fā)酵過程的中期添加入·到醬醅中。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103589653SQ201310612630
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】李崎, 蒯輝, 朱林江, 王金晶, 田金鳳, 李永仙 申請(qǐng)人:江南大學(xué)