專利名稱：一種重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
克魯維酵母是單細胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、培養(yǎng)成本 低廉、繁殖快、便于大規(guī)模培養(yǎng)和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有真核生物的糖 鏈加工系統(tǒng)，還能將外源蛋白分泌到培養(yǎng)液中，利于純化。克魯維酵母廣泛用于
生產(chǎn)商業(yè)、食品或者醫(yī)療上的重要異源蛋白質(zhì)的歷史已經(jīng)超過了50年。目前為 止，該酵母用于生產(chǎn)來自不同物種的蛋白質(zhì)也超過了50種。此外，克魯維酵母生 產(chǎn)異源蛋白時的培養(yǎng)基簡單，不需要像甲醇型酵母(如尸/"h pa^oris)添加 甲醇，工業(yè)生產(chǎn)更安全，而且易于規(guī)模工業(yè)化。其中，乳酸克魯維酵母被認為是 一種安全，易于操作，基因組序列清楚，并且能高效表達異源蛋白的一類極具吸 引力的酵母菌宿主。乳酸克魯維酵母工業(yè)生產(chǎn)重組牛凝乳酶的時間超過了50年， 規(guī)模已經(jīng)達至U層m3 (Bart W. Swinkels ef a丄The yeast A7，ara/Z77ces 7s"is as an efficient host for heterologous gene expression. Antonie van Leeuwenhoek， 64(2): 187-201， 1993)。
克魯維酵母屬于低等真核生物，可進行很多典型的高等真核生物的蛋白 翻譯后修飾，包括對表達蛋白進行N-糖基化修飾?？唆斁S酵母細胞生產(chǎn)重組 蛋白藥物已日益受到人們的青睞，它具有像原核細胞系統(tǒng)生長快，便于基因 操作和可大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點，同時又具有真核細胞翻譯后加工、能產(chǎn)生糖蛋 白和具有生物活性的重組蛋白的特點。目前，已有越來越多的藥用重組蛋白 通過克魯維酵母表達系統(tǒng)被制備，如巨噬細胞集落刺激因子(Macr叩hage colony stimulating factor)、 生長激素(Growth hormone, GH)等(Albert van Ooyen s丄 Heterologous protein production in the yeast A7〃7 ces hc"s. FEMS Yeast Res, 6: 381-292， 2006)。但是克魯 維酵母的N—糖基化修飾與哺乳動物具有明顯區(qū)別，往往產(chǎn)生由大量甘露糖組 成的過度糖基化修飾，其每個糖鏈的甘露糖數(shù)一般高達數(shù)百個(Ari Helenius Roles of N—linked glycans in the endoplasmicreticulum. A醒.Rev. Biochem. 73: 1019 - 1049， 2004)
糖基化對蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。在人體內(nèi)， 糖基化是影響蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)特性(如組織分布和在血液中的清除)的 原因之一 (郭振楚，《糖類化學(xué)》，化學(xué)工業(yè)出版社，2005)。
這種龐大的糖基化外鏈通常具有強免疫原性，因而這種過度糖基化的糖蛋白 不適合用于治療目的。而且，龐大的糖化外鏈可以掩蓋治療性蛋白質(zhì)的活性位點 及預(yù)防用疫苗的抗原表位。例如，被含30-40個甘露糖的N-多糖糖基過度糖基化的 流感神經(jīng)氨酸酶(NA)，由于位于其分子頂部的可變且免疫優(yōu)勢的表位被N-多糖 掩蓋，使其在小鼠中的免疫原性降低(Wim Martinet, Protection of Mice Against a Lethal Influenza Challenge by Immunization with Yeast-Derived Recombinant Influenza Neuraminidase. European Journal of Biochemistry, 247: 332-338， 1997)。過度糖基化通常還導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物在碳水化合物組 成和分子量上的不均勻性，這使蛋白質(zhì)純化變得復(fù)雜，碳水化合物部分的增加還 導(dǎo)致過度糖基化的蛋白的比活性(單位/重量)降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的重組克魯維酵母菌，是能作為表達如下低糖基化糖蛋白的宿 主的重組菌，所述低糖基化糖蛋白的50M以上的N-糖鏈上的單糖數(shù)不大于20個，較 優(yōu)的是不大于16個，最優(yōu)的是不大于ll個的糖蛋白。
所述重組克魯維酵母菌具體可為將克魯維酵母菌中的a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基 因或/和a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的重組菌。
上述a-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(0CA7)基因和/或a-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(iWiW) 基因的滅活可以通過突變基因一個或者多個核苷酸序列或者通過缺失部分或完整基 因序列來實現(xiàn)、也可以利用插入核苷酸破壞原有閱讀框、提前終止蛋白質(zhì)合成等方 式來實現(xiàn)滅活該基因或該基因編碼的蛋白質(zhì)。上述突變、缺失和插入等可以用常規(guī) 的誘變、敲除等方法獲得。這些方法已有許多文獻報道，如J.薩姆布魯克等，《分 子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。也可用本領(lǐng)域已知的其它方法來構(gòu) 建基因滅活的酵母菌。其中較優(yōu)的是通過敲除甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的部分序列獲得。 該序列至少大于三個堿基，較優(yōu)的是大于100個堿基，更優(yōu)的是包括50%以上的編碼 序列，最優(yōu)的是缺失沉附80%和;1^7 100%編碼序列。這種通過敲除甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的部分序列獲得的菌株不易產(chǎn)生回復(fù)突變，菌株的穩(wěn)定性比利用點突變等方法 構(gòu)建的穩(wěn)定性更高，更有利于應(yīng)用于醫(yī)療和工業(yè)。
用于構(gòu)建本發(fā)明的重組克魯維酵母菌的出發(fā)菌株可以是克魯維屬的任何酵母 菌，如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、鷹嘴豆克魯維酵母、保加利亞克魯維 酵母、耐溫克魯維酵母、馬克思克魯維酵母菌株。乳酸克魯維酵母被認為是一種 安全，易于遺傳操作，基因組序列清楚，能高效表達異源蛋白并且具備工業(yè)規(guī)模 的發(fā)酵特性，已成為用于食品工業(yè)和藥用蛋白生產(chǎn)的最佳宿主酵母之一。
因此，本發(fā)明中的出發(fā)菌株優(yōu)選乳酸克魯維酵母菌ATCC8585。 本發(fā)明的重組克魯維酵母菌具體可為KLGE02或KLGE03。所述KLGE02已于2008 年3月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC No. 2400;所述KLGE03已于2008 年3月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC No. 2401。 本發(fā)明中構(gòu)建的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明構(gòu)建的重組載體，是能夠敲除克魯維酵母菌的甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重 組酵母表達載體，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶或a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn) 移酶。
其中，所述重組酵母表達載體是在酵母表達載體的多克隆位點插入有所述甘 露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游側(cè)翼同源區(qū)和下游側(cè)翼同源區(qū)的重組酵母表達載體；
當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上 游側(cè)翼同源區(qū)為如下a)或b)的咖A片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因下游側(cè)翼同源區(qū) 為如下c)或d)的DNA片段，
a) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 起始密碼子上游的染色體DNA序列；
b) 在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA片段雜交的片段；
c) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 終止密碼子下游的染色體DNA序列；
d) 在嚴(yán)格條件下與c)限定的DNA片段雜交的片段。
當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上 游側(cè)翼同源區(qū)為如下l)或2)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的下游側(cè)翼同源區(qū)為如下3)或4)的DNA片段，
1) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 起始密碼子上游的染色體DNA序列；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA片段雜交的片段；
3) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 終止密碼子下游的染色體DNA序列；
4) 在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA片段雜交的片段。
本發(fā)明中當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶 基因的上游側(cè)翼同源區(qū)優(yōu)選為如下A)或B)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 下游側(cè)翼同源區(qū)優(yōu)選為如下C)或D)的DNA片段，
A) 序列表中序列1的自5'末端第121-2119位脫氧核糖核苷酸組成的DNA分
子；
B) 在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA片段雜交的片段；
C) 序列表中序列1的自5'末端第3276-5469位脫氧核糖核苷酸組成的DNA分
子；
D) 在嚴(yán)格條件下與C)限定的DNA片段雜交的片段。
當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上 游側(cè)翼同源區(qū)優(yōu)選為如下I )或II)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的下游側(cè)
翼同源區(qū)優(yōu)選為如下m)或IV)的DNA片段，
I) 序列表中序列2的自5'末端第102-1480位脫氧核糖核苷酸組成的DNA分
子；
II) 在嚴(yán)格條件下與I )限定的DNA片段雜交的片段；
III) 序列表中序列2的自5'末端第3897-5436位脫氧核糖核苷酸組成的DNA分
子；
IV) 在嚴(yán)格條件下與ni)限定的DNA片段雜交的片段；
上述嚴(yán)格條件可為在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)， 0.1% SDS的溶液中，在65。C 下雜交并洗膜。
本發(fā)明所用的酵母表達載體優(yōu)選為pYES2酵母表達載體。
所述重組載體上還帶有URA3 (orotidine-5' -phosphate decarboxylase)基 因作為篩選標(biāo)記。本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建所述重組克魯維酵母菌的方法。 本發(fā)明提供的構(gòu)建所述重組克魯維酵母菌的方法，是將構(gòu)建的所述重組載體 導(dǎo)入克魯維酵母菌中獲得重組菌。
滅活甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的方法可以用本領(lǐng)域已知的各種方法，但常規(guī)方法的 效率很低，較難獲得滅活甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的菌株。本發(fā)明所述構(gòu)建克魯維酵母 菌的方法能高效滅活甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因。
本發(fā)明所述的重組克魯維酵母可在生產(chǎn)外源糖蛋白中的應(yīng)用。 其中，所述的外源糖蛋白包括細胞因子、凝血因子、免疫球蛋白、內(nèi)皮生 長因子、生長激素釋放因子、生長因子、人血管抑制素、組織纖溶酶原激活物、 纖溶酶原激活物抑制劑、尿激酶、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、血細胞凝集素、唾液酸 轉(zhuǎn)移酶、HIV胞膜蛋白、腸激酶、皰疹病毒I型糖蛋白D，以及這些蛋白的融合蛋白。
本發(fā)明構(gòu)建的重組克魯維酵母菌有兩個特別明顯的優(yōu)點 一是所敲除的酵母 菌甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)80%以上缺失，不易產(chǎn)生回復(fù)突變，相比于通過插 入終止子等破壞原有讀碼框失活等方法構(gòu)建的菌種而言(如Wouter Vervecken et al. In Vivo Synthesis of Mammalian-Like, Hybrid-Type N-Glycans in Pichia pastoris. Applied and Environmental Microbiology, 5: 2639-2646, 2004)，突變株穩(wěn)定性明顯高。二是本發(fā)明構(gòu)建的重組克魯維酵母菌表達的糖蛋 白不存在過度糖基化現(xiàn)象，本發(fā)明表達的兩種低糖基化的HSA-GM/CSF中， 一種的 每個N-糖鏈上50%以上的單糖為15-16個，另一種的每個N-糖鏈上50。/。以上的單糖為 11-13個。
本發(fā)明的構(gòu)建重組克魯維酵母菌的方法，能成功高效的得到a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn) 移酶或a -1, 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因單缺陷、a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶和a -1， 3-甘露糖 轉(zhuǎn)移酶基因雙缺陷酵母菌，從8個克隆中即可得到4個陽性克隆。
本發(fā)明的重組克魯維酵母菌表達的低糖基化糖蛋白，與野生型克魯維酵母菌 表達的過度糖基化蛋白相比，N-糖鏈上的單糖數(shù)明顯減少。該低糖基化糖蛋白避 免了過度糖基化引起的高免疫原性、對活性位點的遮蔽等問題，且消除了不均一 性，因而在臨床醫(yī)療和工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用前景。


圖l為用于滅活a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體pYES2-mnnl。圖2為以O(shè)S7為例闡明滅活甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的原理。 圖3為PCR鑒定ct -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的的滅活
泳道l:以重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2400基因組DNA為模板擴增的產(chǎn)物； 泳道2:以乳酸克魯維酵母ATCC8585的基因組DNA為模板擴增的產(chǎn)物；M:分子量標(biāo) 準(zhǔn)，自上而下分別為15000、 10000、 7500、 5000、 2500、 1000、 250bp。
圖4為PCR法鑒定a -1, 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的的滅活
泳道1&2:以重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2401基因組DNA為模板擴增的產(chǎn) 物，3.2kb;泳道3:以乳酸克魯維酵母ATCC8585的基因組DNA為模板擴增的產(chǎn)物 5.6kb， M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，15000、 10000、 7500、 5000、 3000、 1500、 1000、 500bp。
圖5為pKLAC1-HSA-GM/CSF結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6為重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400， CGMCC No. 2401和乳酸克魯維酵母 ATCC8585表達的HSA-GM/CSF的分析。
圖7為熒光輔助糖電泳方法顯示重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400、 CGMCC No. 2401和乳酸克魯維酵母ATCC8585表達的HSA-GM/CSF的糖鏈變化。
具體實施例方式
本發(fā)明的重組克魯維酵母菌，具體可按照如下方法構(gòu)建1)構(gòu)建能夠敲除克 魯維酵母菌的a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶或a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組酵母表達 載體；2)將該重組酵母表達載體導(dǎo)入克魯維酵母菌中，得到能作為表達低糖基化 糖蛋白的宿主的重組菌。
其中，所用的a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶或a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的上游側(cè)翼同源 區(qū)和下游側(cè)翼同源區(qū)的多聚核苷酸序列可以從公開的美國國立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)獲得。該上游側(cè)翼同源區(qū)和下游側(cè)翼同源區(qū)可按照如下方法制備利用PCR 方法，以乳酸克魯維酵母菌ATCC8585基因組DNA為模板，獲得所述基因或基因片段 兩側(cè)所需的一定長度的側(cè)翼同源區(qū)，分別包括OfiW基因和必W/基因編碼區(qū)上游和 下游側(cè)翼同源區(qū)，并在引物部分添加合適的酶切位點。根據(jù)序列獲得多聚核苷酸 可以用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR、 RT-PCR方法、人工合成的方法、基因組DNA和 構(gòu)建篩選cDNA文庫的方法等獲得(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二 版，科學(xué)出版社，1995.)。若需要可用本領(lǐng)域公知的方法對多聚核苷酸進行突 變、缺失、插入、和與其它多聚核苷酸連接等。將分別得到的上游(上游稱之為5'臂)和下游(下游稱之為3'臂)側(cè)翼區(qū)同源臂片段進行融合，在保持各自片 段大小不變的前提下，可以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過重疊PCR的方法，所 用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指 南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法分別將含OGW 或iM7基因側(cè)翼區(qū)同源臂融合片段的核酸克隆到各種適用于酵母的載體中去，或 者利用各自側(cè)翼區(qū)同源臂上酶切位點分別插入載體特定區(qū)域。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克 隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué) 出版社，1995.)的敘述。
用于構(gòu)建本發(fā)明的重組載體的原始載體可以帶有復(fù)制位點，篩選標(biāo)記，營養(yǎng) 缺陷型標(biāo)記(如tt A , ^Z5"《JZ^X ^Z《^ ^)等，這些載體的構(gòu)建方法已在 許多文獻公開(如J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版 社，1995)，也可以從各種公司購得(如Invitrogen life technologies, Carlsbad, California 92008， USA)，優(yōu)先的載體有pPICZ a A、 pYES2酵母表達 載體。所述重組載體都是穿梭載體，先在大腸桿菌中復(fù)制擴增，然后被導(dǎo)入宿主 酵母細胞，載體應(yīng)該帶有抗性標(biāo)記基因，或者營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，以利于后期 轉(zhuǎn)化子的篩選。
本發(fā)明的重組載體線性化后，可按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化宿主細胞，如制備感受態(tài) 細胞、電穿孔、醋酸鋰法等(A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué) 出版社，2000)。成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有欲滅活基因或基因片段的同源區(qū)的細 胞，可以通過人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如細胞經(jīng)收集并裂解，提取DNA，然后 PCR方法鑒定基因型；而之前選擇正確的表型可以通過營養(yǎng)缺陷型或者抗性標(biāo)記的 篩選而得以實現(xiàn)。第一次重組正確的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過在酵母完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，涂 布在含尿嘧啶的5-氟乳清酸平板(第二次重組)上篩選，長出的克隆，再進一步 進行基因型的PCR鑒定。分別篩選到正確缺失了預(yù)期的Ofi^或(和)；J^W編碼區(qū)的 轉(zhuǎn)化子，獲得滅活化X7或(和)^W基因的乳酸克魯維酵母。
本發(fā)明的重組克魯維酵母可以用于生產(chǎn)各種醫(yī)療和工業(yè)用的糖蛋白，如細胞 因子(例如干擾素、G-CSF、 GM-CSF等)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、人 C蛋白)、免疫球蛋白(IgG、 IgA、 IgM等)、內(nèi)皮生長因子、生長激素釋放因 子、HIV包膜蛋白、流感病毒A血細胞凝集素、流感神經(jīng)氨酸苷酶、葡聚糖酶、a-淀粉酶、冬氨酸蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶(trans-sialidase)、腸激酶活化劑、皰疹病毒I型糖蛋白D、人血管抑制素、人B7-1、 B7-2和B-7受體CTLA-4、人 組織因子、生長因子(例如血小板衍生生長因子)、人a-抗胰蛋白酶、人紅細胞 生成素、組織纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活抑制劑-1、尿激酶、a-半乳糖苷 酶、纖溶酶原、凝血酶，以及這些蛋白的融合蛋白。
上述蛋白的氨基酸及核苷酸序列均已公開，可以從美國國立生物技術(shù)信息中 心NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/)或者歐洲分子生物實驗室EMBL
(http:〃www. embl.org)公開的數(shù)據(jù)庫中獲得，或者從各種相關(guān)文獻中獲得。根 據(jù)序列獲得這些基因可以用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR、 RT-PCR方法、人工合成的 方法、基因組DNA和構(gòu)建篩選cDNA文庫的方法等獲得(J.薩姆布魯克等，《分子克 隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)。這些蛋白在低糖化的乳酸克魯維酵 母菌株中的表達可以用本領(lǐng)域已知的各種方法來實現(xiàn)(A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳 學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版社，2000)。其中這些蛋白的表達優(yōu)選的是由啟動 子控制的，這些啟動子可以是乳酸克魯維酵母中各種啟動子，優(yōu)選的是LAC4
(Paul A. Colussi et s丄 A7〃ymro,ces 7scWs LAC4 promoter variants that lack function in bacteria but retain full function in yeast. Applied and Environmental Microbiology, 71(11): 7092 - 7098,2005) 、 PGK (Gerd Gellissen <a_Z. Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae， Hansenula polymorpha and A7i/,虹。季e"ac"s. Gene, 190(1): 87-97， 1997)、 PH05 (Encarnacion Ferminan s丄 The K1PH05 gene encoding a repressible acid phosphatase in the yeast A7〃，er。,ce51 7ac"5": cloning, sequencing and transcriptional analysis of the gene， and purification and properties of the enzyme. Microbiology, 143: 2615 - 2625， 1997)、 ADH4(Michele Saliola Use of the K1ADH4 promoter for ethanol-dependent
production of recombinant human serum albumin in A7〃，ero/z yce51 7acti51. Applied and Environmental Microbiology, 65(1): 53-60， 1999 )。編碼這些 蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。這些蛋白可以存 在于宿主細胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來，優(yōu)選的是從宿主中分泌出來。分 泌所用的信號肽，可以為酵母a交配因子信號肽、人血白蛋白信號肽等，優(yōu)選的 是用酵母a交配因子信號肽。并且可以用本領(lǐng)域常用的方法培養(yǎng)這些酵母，并純化產(chǎn)生的糖蛋白，可以根據(jù)待純化特定蛋白的性質(zhì)決定純化方案。例如，可以用 典型的分離技術(shù)純化目標(biāo)蛋白的方法，如沉淀、免疫吸附或各種層析法。 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實施例l、 a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶滅活的重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400的
構(gòu)建
1.滅活ct -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體的構(gòu)建
實驗中所使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等 購自大連寶生物工程有限公司，pfu酶、試劑盒、DH5a感受態(tài)細胞、引物合成、 測序等由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。
用玻璃珠制備法(A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版 社，2000)提取乳酸克魯維酵母ATCC8585 (American Type Culture Collection, 美國典型微生物菌種保藏中心，Manassas, VA 20108 USA)的基因組DNA，以該基 因組DNA為模板擴增a-1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OGW)基因(序列表中序列l(wèi))兩側(cè)的 同源臂，0fiW兩側(cè)的同源臂分別為2kb，中間缺失約l. 1 kb的編碼基因。擴增 ^F/上游側(cè)翼區(qū)同源臂(沉附5'同源臂)所用的引物為KLOCH01和KLOCH02，引 物序列分別為5' -ACTGCTAGCATGTGGAAGTGATCTGTGGAGA-3'(劃線部分為yV力el識 別位點)和5' -ATTAGGTACCTGAGAGCTCGTTGGAAAGACTGAAGATGAAAGCA-3';擴增 OGW下游側(cè)翼區(qū)同源臂("F7 3'同源臂)所用的引物為KLOCH03和KLOCH04，引 物序列分別為5' -CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3'和 5' -GATACGCGTGTCACATACCGATTGATCGATAC-3'(劃線部分為#7wl識別位點)。
兩個同源臂的PCR擴增條件如下94t變性5min后，按照94'C變性30sec、 55 。C復(fù)性30sec、 72。C延伸2min30sec進行30次循環(huán)，最后72。C延伸10min;目的片段 大小在2kb左右。將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收(購自鼎國生物技 術(shù)有限公司，北京)。利用重疊延伸PCR的方法融合"〗W 5'同源臂和3'同源臂 (參見J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社， 1995)，以06別5'同源臂和3'同源臂PCR產(chǎn)物為模板，以KL0CH01/04為引物， PCR擴增條件如下94-C變性5min后，按照94。C變性lmin、 55T:復(fù)性lmin、 72。C延 伸4min30sec進行30次循環(huán)，最后72。C延伸10min;目的片段大小在4 kb左右。PCR 產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。
順el/itfwl雙酶切(本試驗所用的限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程有限公司，大連)嵌合體片段，酶切后的嵌合體片段插入同樣雙酶切處理的載體pYES2 (購自 Invitrogen Corp. USA)中，T4連接酶16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ,在含 氨芐青霉素(100pg/ml)的LB平板上篩選陽性克隆。用M elAWwI雙酶切鑒定陽 性克隆，將M/el和^7wI酶切得到4200bp左右和3000bp左右片段的重組載體命名為 pYES2-ochl (圖1A)。測序結(jié)果表明，嵌合體片段中的^〗W5'同源臂的序列是 序列表中序列1中的自5'末端121-2119位脫氧核糖核苷酸，其中，自5'末端 115-120脫氧核糖核苷酸為M el酶識別位點；OGW 3'同源臂的序列是序列表中序 列1中的自5'末端3276-5469位脫氧核糖核苷酸，其中，自5'末端4024-4029位脫 氧核糖核苷酸為&7I酶識別位點。
2、重組載體pYES2-ochl對乳酸克魯維酵母ATCC8585的轉(zhuǎn)化
采用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)化入乳酸克魯維酵母ATCC8585中，電轉(zhuǎn)化的方法 為本領(lǐng)域所共知(如A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版社， 2000)。電轉(zhuǎn)化前，先用5^ I酶切重組載體pYES2-ochl進行線性化，然后電轉(zhuǎn)入 制備好的乳酸克魯維酵母ATCC8585感受態(tài)細胞中，涂布于MD培養(yǎng)基(YNB 1.34g/100mL，生物素4Xl(Tg/100niL，葡萄糖2g/100mL，瓊脂l. 5g/100mL)平板 上。25'C培養(yǎng)3-5天，待培養(yǎng)基上長出克隆后，隨機挑取幾個克隆提取基因組 DNA，通過PCR的方法鑒定重組載體是否正確整合到了染色體上的目標(biāo)位點，PCR反 應(yīng)所用的兩對引物分別是KL0CH03和染色體上a^/基因3'同源臂外圍引物 KL0CH08，弓I物KL0CH03和KL0CH08的序列分別為
5' -CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3'和
5' -AAATCAATACCTTCTTCAACGG-3'。
PCR反應(yīng)所用的酶為LA Taq (購自寶生物工程有限公司，大連)，PCR擴增條 件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、 55。C復(fù)性30sec、 72。C延伸3min 進行30次循環(huán)，最后72'C延伸10min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物條帶的大 小，所擴增的條帶在2.2kb左右，證明了隨機挑選的幾個克隆中，重組載體已經(jīng)正 確整合到了染色體上的目標(biāo)位點。
將重組載體已經(jīng)正確整合到了染色體上的一個克隆接種于YPD培養(yǎng)基 (lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25'C搖床培養(yǎng) 12小時后，將菌液涂布于含尿嘧啶的5-F0A培養(yǎng)基(YNB 1.34 g/100ml，生物素4 X10—VlOOml，葡萄糖2g/100ml，瓊脂1.5g/100ml，尿嘧啶100mg/ml， 5-F0A0.1 g/100ml)(其中，YNB，為無氨基酸酵母氮源，購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有 限公司，5-F0A為5-氟乳清酸，購自Sigma-aldrich P. 0. BOX14508， St. Louis， M0 63178 USA)，置于25。C培養(yǎng)。 3. PCR鑒定陽性克隆
在5-FOA培養(yǎng)基上長出克隆后，提取這些克隆的基因組DNA，進行PCR鑒定以 基因組DNA為模板，鑒定引物為KL0CH07和染色體上漢W7基因3'同源臂外圍引物 KL0CH08，引物KLOCH07和KLOCH08的序列分別為 5, —TGCTTTCATCTTCAGTCTTTCC—3'和5' -MATCAATACCTTCTTCAACGG-3'。
同時以乳酸克魯維酵母ATCC8585基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)體系設(shè)為陰性對 照。PCR反應(yīng)所用的酶為LA Taq， PC財廣增條件如下94。C變性5min后，按照94。C 變性30sec、 55。C復(fù)性30sec、 72。C延伸4min進行30次循環(huán)，最后72。C延伸10min。 將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，乳酸克魯維酵母ATCC8585基因組DNA為模板的PCR產(chǎn) 物大小在3. 4kb左右，以待鑒定的克隆基因組為模板的PCR產(chǎn)物大小在2. 3kb左右， 證明了"F7基因滅活的菌株(0GW基因的編碼區(qū)缺失L1 kb)構(gòu)建正確。電泳圖 見圖3。結(jié)果通過兩次同源重組，在8個轉(zhuǎn)pYES2-ochl線性片段的克隆中，獲得了4 株滅活OGW基因的突變型菌株，將其中的一株命名為KLGE02。該菌株已于2008年3 月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址 為北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC No. 2400。
實施例2、 a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶滅活的重組乳酸克魯維酵母的構(gòu)建 1.滅活a-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體的構(gòu)建
用玻璃珠制備法(A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版 社，2000)提取乳酸克魯維酵母ATCC8585的基因組DNA，以該基因組DNA為模板擴 增a-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因(序列表中序列2)兩側(cè)的同源臂，a-1,3-甘露糖轉(zhuǎn) 移酶基因(扁W9兩側(cè)的同源臂分別為1.4kb和1.5kb，中間缺失2.4kb的編碼基 因，擴增艦W上游側(cè)翼區(qū)同源臂所用的引物為KLMNN01和KLMNN02，引物序列分別 為5' -TAAGCTAGCTGACCAATGACGCATCCGAACT-3'(劃線部分為M eI識別位點)和5 '-ATTAAGCTTATGGCACGCTGGGTTACCTCC-3'(劃線部分為^/y2dlI識別位點)；擴增 艦W下游側(cè)翼區(qū)同源臂所用的引物為KLMNN03和KLMNN04,引物序列分別為5'-ATAGCTAGCTTAAGCTTACACTGCATAAAGTCTGCTCGTA -3'(劃線部分分別為順el和 歷'/7oni識別位點)和5' - CTGACGCGTAGCCGTTGAAGCCAAGAAGGT -3'(劃線部分為必WI識別位點)。
兩個同源臂的PCR擴增條件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、 55 。C復(fù)性30sec、 72。C延伸2min進行30次循環(huán)，最后72X:延伸10min;目的片段大小 在1.5 kb左右。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收(購自鼎國生物技術(shù) 有限公司，北京)。順el/itf"I雙酶切細W下游側(cè)翼區(qū)同源區(qū)，酶切后的片段插 入同樣雙酶切處理的載體pYES2 (購自Invitrogen Corp. USA)中，T4連接酶16。C 連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素(100 pg/ml)的LB平板篩選陽 性克隆。用順el/itfwl雙酶切鑒定陽性克隆，將順el和必tfl酶切得到1. 5kb左右和 3.0kb左右片段的重組載體命名為pYES2-mnnl(3' arm)載體。Aftel/〃&cttn雙酶切 7上游側(cè)翼區(qū)同源區(qū)后，酶切后的片段插入同樣雙酶切處理的重組載體 pYES2-mnnl(3' arm)中，T4連接酶16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，用含氨芐 青霉素(100lig/ml)的LB平板篩選陽性克隆。用7^el/歷7 oin雙酶切鑒定陽性克 隆，將M el和歷77flTII酶切得到1.4kb左右和4.5 kb左右片段的重組載體命名為 pYES2-mrml，如圖l所示。測序結(jié)果表明，嵌合體片段中的艦W上游側(cè)翼區(qū)同源臂 的序列是序列表中序列2中的自5'末端102-1480位脫氧核糖核苷酸，其中，自5' 末端96-101位脫氧核糖核苷酸為M/el酶識別位點；《7下游側(cè)翼區(qū)同源臂的序列 是序列表中序列2中的自5'末端3897-5436位脫氧核糖核苷酸，其中，自5'末端 4395-4400位脫氧核糖核苷酸為Sa/dH酶識別位點。
2.重組載體pYES2-mnnl對乳酸克魯維酵母ATCC8585的轉(zhuǎn)化 采用電轉(zhuǎn)化法將重組載體pYES2-mnnl轉(zhuǎn)化入乳酸克魯維酵母ATCC8585中，電 轉(zhuǎn)化的方法為本領(lǐng)域所共知(如A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科 學(xué)出版社，2000)。電轉(zhuǎn)化前，先用feMII酶切重組載體pYES2-mnnl進行線性化， 然后電轉(zhuǎn)入制備好的乳酸克魯維酵母ATCC8585感受態(tài)細胞中，涂布于MD培養(yǎng)基 (YNB 1. 34g/100ml，生物素4X10—5 g/100ml，葡萄糖2g/100ml，瓊脂 1.5g/100ml)平板上。25X:培養(yǎng)3-5天，待培養(yǎng)基上長出克隆后，隨機挑取幾個克 隆提取基因組DNA，通過PCR的方法鑒定重組載體是否正確整合到了染色體上的目 標(biāo)位點，PCR反應(yīng)所用的兩對引物分別是KLMNN07和i^V/基因3'同源臂外圍引物 KLMNN08 ，弓I物KLMNN07和KLMNN08的序列分別為
5' -ACAGGTATGTTCCTATCGCAGTT-3'和5' -TTGATCTTGAATGGTGGGTTT-3'。 PCR反應(yīng)所用的酶為LA Taq (購自寶生物工程有限公司)，PCR擴增條件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、 55。C復(fù)性30sec、 72。C延伸3min進行 30次循環(huán)，最后72'C延伸10min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物條帶的大小， 所擴增的條帶在2.2 kb左右，證明了隨機挑選的幾個克隆中，重組載體已經(jīng)正確 整合到了染色體上的目標(biāo)位點。
將重組載體已經(jīng)正確整合到了染色體上的一個克隆接種于YPD培養(yǎng)基 (lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25。C搖床培養(yǎng) 12小時后，將菌液涂布于含尿嘧啶的5-F0A培養(yǎng)基(YNB 1.34 g/100ml，生物素4 X10—5g飾ml，葡萄糖2 g/100ml，瓊脂1.5 g/100ml，尿嘧啶100 mg/ml， 5-F0A 0. lg/100ml)(其中，YNB，為無氨基酸酵母氮源，購自北京欣經(jīng)科生物技 術(shù)有限公司，5-F0A為5-氟乳清酸，購自Sigma-aldrich P. 0. B0X14508， St. Louis， MO 63178 USA)，置于25。C培養(yǎng)。
3. PCR鑒定陽性克隆
在5-F0A培養(yǎng)基上長出克隆后，提取這些克隆的基因組DNA，進行PCR鑒定以 基因組DNA為模板，鑒定引物為染色體上必W7基因同源臂外的序列KLMNN09和 KLMNN08，引物KLMNN09和KLMNN08的序列分別為
5' -ACTCCATGTCCCAGAAAACGTC-3'和5' -TTGATCTTGAATGGTGGGTTT-3'。
同時將以乳酸克魯維酵母ATCC8585基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)體系設(shè)為對 照。PCR反應(yīng)所用的酶為LA Taq， PCR擴增條件如下94'C變性5min后，按照94。C 變性30sec、 55。C復(fù)性30sec、 72。C延伸6min進行30次循環(huán)，最后72。C延伸10min。 將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，乳酸克魯維酵母ATCC8585基因組DNA為模板的PCR產(chǎn) 物大小在5.6kb左右，以待鑒定的克隆基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物大小在3. 2kb左 右，證明了鵬5W基因滅活的菌株(巡WJ基因的編碼區(qū)缺失2.4kb)構(gòu)建正確。電泳 圖見圖4 。結(jié)果通過兩次同源重組，在8個轉(zhuǎn)pYES2-mnnl線性片段的克隆中，獲得 了4株滅活必W/基因的突變型菌株。
實施例3: a -1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因和a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因均被滅活的 重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2401的構(gòu)建
利用重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2400作為宿主，按照實施例2的方法，滅 活重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2400基因組中的a-l，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因，在8 個轉(zhuǎn)pYES2-mrml線性片段的克隆中，獲得了4株ci -1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因和 a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因均被滅活的突變型菌株，將其中的一株命名為KLGE03。該菌株已于2008年3月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC No. 2401。 實施例4、利用本發(fā)明的重組乳酸克魯維酵母表達低糖基化的融合蛋白 HSA-GM/CSF
HSA-GM/CSF是人血清白蛋白(HSA)與粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)的融合蛋白，具有兩個N-糖基化的位點，是典型的糖蛋白。該融合蛋 白可以刺激粒細胞、巨噬細胞增殖，具有重要的臨床應(yīng)用價值，但是普通乳酸克 魯維酵母表達的該融合蛋白為過度糖基化修飾的，這嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用。本 實施例提供了一種用重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400或重組乳酸克魯維酵母 CGMCC No. 2401表達低糖化的HSA-GM/CSF的方法，具體方法如下 1. HSA-GM/CSF的獲得及表達載體的構(gòu)建
用PCR的方法從人胎肝cDNA文庫(購自Clontech Laboratories Inc. 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA94043, USA)獲得hGM-CSF cDNA (Genbank Accesion Number :醒000758的自5'末端第84-464位脫氧核糖核苷酸組成的序 歹U)，所用的引物為
GMCSF1: 5'—ATGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCCAGC—3'和
GMCSF2: 5' -ATGAATTC[TT豐TCCTGGACTGGCTCCCAGCA-3'。 PCR方法為100ul反應(yīng)體系中加入l"l人胎肝cDNA文庫，20mol/L的 GMCSF1、 GMCSF2引物各3u 1， 2mmol/L的dNTP 10 u 1 ， 10X反應(yīng)緩沖液IO u 1， pfu DNA聚合酶5U， (dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司產(chǎn)品)。PCR條件為94。C變性lmin， 52。C退火30sec， 72。C延伸 1.5min，循環(huán)35次后，再72。C延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳回收hGM-CSF cDNA (約 0.5kb)然后用"a/dH和fcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收純化。
用PCR方法從上述人胎肝cDNA文庫獲得帶有信號肽和前肽編碼序列的HSA cDNA (自Genbank Accesion Number:NM 000477的自5'末端第40-1863位脫氧核糖核苷 酸組成的序列)，所用的引物為
HSA1: 5' -GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT-3'禾口 HSA2: 5' - TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3'。 PCR條件為100ul反應(yīng)體系中，加入lia人胎肝cDNA文庫，2Omol/L的HSA1 和HSA2引物各3ul， 2mmol/L的dNTP10u 1， 10X反應(yīng)緩沖液IOy 1， Taq pluslDNA聚合酶5U。 PCR條件為94'C變性lmin， 52"C退火lmin， 72'C延伸3min，循環(huán)35 次后，再72t:延伸10min。用DNA片段回收試劑盒回收純化約l. 8kb的HSA cDNA目標(biāo) 帶，用7fe/7VAg3/dn切。(實驗中的Taq plusl DNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑 盒等購自大連寶生物工程有限公司)。
為了將HSA與GM-CSF以融合蛋白形式表達，首先選擇pHIL-D2質(zhì)粒作為載體 (Invitrogen life technologies, carlsbad , California 92008， USA)。在該 載體AOX啟動子下游iVs。V與fcoRI位點間插入HSA-GM/CSF基因，因pHIL-D2載體上有 兩個vVs。V位點，為了方便操作，首先pHIL-D2載體用"al/5"a7I酶切成3段，回收 4kb片段，自身連接后命名為pD3載體。pD3載體用7fepVA5boRI切，回收線性化載 體，與上述用5a/zHI/j5boRI切的GM-CSF cDNA的片段，及用7V邵V/fe/rfn切的HSAcDNA 的片段，用T4連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆JM109 (pD3HSAGMCSF)，測序正確，其編碼融合蛋白的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列 見序列表中序列3。將正確的重組載體命名為pD3HSAGMCSF。將pD3HSAGMCSF質(zhì)粒， 用67al/5bal切，電泳回收線性化的6. 3kb片段，pHIL-D2空載體用"3l/5bal切回 收約4. 2kb的片段。T4連接酶催化連接pD3HSAGMCSF的6. 3kb片段與pHIL-D2的4. 2kb 片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后，涂于含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB瓊脂平皿， 挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得HSA-GM/CSF表達載體pD2HSAGMCSF。
設(shè)計弓I物HSA-GM-CSF01和HSA-GM-CSF02，弓|物序列分別為 -GTCCAAGCTTGMAAAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC—3'禾卩
5 z -TATGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGGTGACCTCCACCCTCCTGGACTGGCTCCCA-3'， 并在下游引物末端添加6個組氨酸標(biāo)簽，以便后期利用鎳柱進行純化。以 pD2HSAGMCSF為模板，PCR擴增條件如下94"C變性5min后，按照94'C變性 30sec、 55。C復(fù)性30sec、 72。C延伸2min30sec，進行30次循環(huán)，最后72。C延伸 10min;目的片段大小在2.2 kb左右。將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回 收(購自鼎國生物技術(shù)有限公司，北京)后用歷'/K/TIlA^71 (本試驗所用的限制 性內(nèi)切酶均購自寶生物工程有限公司，大連)雙酶切，酶切后的片段插入同樣雙 酶切處理的質(zhì)粒pKLACl (購自NEW ENGLAND Biolabs)中，T4連接酶16。C連接過 夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB平板篩選陽性克 隆。用歷'"^II和5"a7I酶切鑒定陽性克隆，將歷'/ oTII和5^7I酶切得到2200bp左右 和約8700bp左右片段的重組載體命名為pKLAC1-HSA-GM/CSF，即乳酸克魯維酵母表達載體。該載體的結(jié)構(gòu)見附圖5。
制備重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400、重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2401以及乳酸克魯維酵母ATCC8585的感受態(tài)細胞，將上述表達載體 pKLACl-HSA-GM/CSF以&cII線性化后分別電轉(zhuǎn)入酵母菌的感受態(tài)細胞中，將電擊 后的菌液涂布于含有5 mmol/L乙酰胺YCB瓊脂培養(yǎng)基(lmo1/1磷酸鈉， 1. 17g/100ml YCB， 2g/馳l瓊脂，5mmol/L乙酰胺,其中YCB為酵母基本碳源培 養(yǎng)基，購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)平板上,3(TC翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)3-4天直至克隆 出現(xiàn)。含有整合表達片段的每一個菌株培養(yǎng)物，用無菌槍頭刮取約2 mm2的單克隆 細胞，置于2ml YPGal培養(yǎng)液(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml 半乳糖)中重懸，3(TC振蕩培養(yǎng)(250-300rpm)，誘導(dǎo)72小時后離心取上清，用于 融合蛋白的表達分析。
2. SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物
將轉(zhuǎn)入pKLAC1-HSA-GM/CSF的重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400、重組乳酸 克魯維酵母CGMCC No.2401以及乳酸克魯維酵母ATCC8585的表達上清各取1L，經(jīng) 飽和度為80%的硫酸銨沉淀后，用100mL Tris-HC1緩沖液(20mmol/L pH7.5)溶 解，按照下述文獻中的方法進行純化D.R.馬歇克等，《蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗 指南》，科學(xué)出版社，1999。其中，先用鎳親和層析柱(Ni-affinity chromatography)進行純化，所采用的洗脫液的組成為20mmol/L Tris-HC1， 500mmol/L NaCl， 500咖ol/L咪唑，pH7. 5。再用AKTA色譜儀系統(tǒng)純化(Amersham Pharmacia Biotech AB， Sweden),所采用的流動相的組成為20mmol/L Tris-HC1， 50腿ol/L NaCl， pH7. 5。純化產(chǎn)物進行10。/。SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié) 果如圖6所示，表明乳酸克魯維酵母ATCC8585的HSA-GM/CSF主帶的表觀分子量大 于97kD (泳道l)。明顯大于不被糖基化修飾的HSA-GM/CSF蛋白的理論分子量 (81kD)(泳道2)，其糖基的分子量高達16kD以上，即單個糖基的分子量約為 8000Da以上，且表達帶產(chǎn)生了明顯的拖尾現(xiàn)象，因而表達的HSA-GM/CSF為過度糖 基化蛋白。重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400和CGMCC No. 2401表達的 HSA-GM/CSF表觀分子量約為84 kD，且表達帶清晰，沒有拖尾現(xiàn)象，其單個糖基的 分子量約為2000Da，與正常糖基的分子量相近，因而表達的HSA-GM/CSF為低糖基 化的蛋白。圖6中，泳道l為乳酸克魯維酵母ATCC8585表達的HSA-GM/CSF，泳道2 為用PNGase F酶(購自New England BioLabs， NEB， Ipswich, MA)切去除乳酸克魯維酵母ATCC8585表達的HSA-GM/CSF的N-糖鏈的酶切產(chǎn)物，泳道3為重組乳酸克魯 維酵母CGMCC No. 2400表達的HSA-GM/CSF，泳道4為用PNGase F酶切去除重組乳酸 克魯維酵母CGMCC No. 2400表達的HSA-GM/CSF的N-糖鏈的酶切產(chǎn)物，泳道5為重組 乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2401表達的HSA-GM/CSF，泳道6為用PNGase F酶切去除 重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2401表達的HSA-GM/CSF的N-糖鏈的酶切產(chǎn)物，泳 道7為PNGase F酶(33 kD) 。 M:標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上而下分別為97. 4、 66.7、 43、 31、 21 KD。
產(chǎn)生這種結(jié)果可能的原因是融合蛋白HSA-GM/CSF有兩個糖基化位點，乳酸 克魯維酵母ATCC8585表達的該蛋白由于不均一的糖基化及過度糖基化造成了分子 量的不均一和表達帶拖尾現(xiàn)象。重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2401由于a-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶和a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的缺失，使得蛋白的糖基化大部分停留在低 甘露糖基化的結(jié)構(gòu)，所以表達帶清晰，沒有拖尾，消除了不均一性且表觀分子量 比野生菌株的小。 3.糖蛋白糖鏈大小的檢測
N-糖基分析是通過熒光輔助糖電泳(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE) (Ningguo Gao s丄 Alternative sources of reagents and supplies for fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE), 13(1):1G-3G, 2003)的方法來實現(xiàn)。首先將純化后的 HSA-GM/CSF經(jīng)PNGase F(New England Biolabs)酶切以便獲得糖鏈，具體方法如 下糖蛋白HSA-GM/CSF在0. 5g/100ml SDS和lml/100ml P-巰基乙醇變性緩沖液中 10(TC變性5min，然后在如下溶液中37'C反應(yīng)16 hr: 50mmol/L磷酸鈉(pH7. 5)， lml/100ml NP-40， 5-10 (500,000 units/ml) N-糖苷酶F (PNGaseF， New
England BioLabs， NEB， Ipswich, MA)。反應(yīng)結(jié)束后，酶切體系中添加4倍體積 -20。C預(yù)冷的丙酮沉淀糖鏈，13000g離心10min，棄上清，沉淀經(jīng)由700uL -20。C預(yù) 冷的60%甲醇兩次萃提。然后將所提糖鏈低壓凍干，利用ANTS (8-aminonaphtalene-1， 3， 6-trisulfonate)標(biāo)記還原末端，經(jīng)309&PAGE分離。最后 電泳譜帶在紫外光下分析并拍照(Peter Jackson, The Analysis of Fluorophore-Labeled Glycans by High-Resolution Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Analytical Biochemistry, 216: 243-252， 1994) 。 FACE電泳 結(jié)果如圖7所示，表明乳酸克魯維酵母ATCC8585表達的糖蛋白的糖鏈部分明顯大于30個糖基，而重組乳酸克魯維酵母CGMCC No.2400表達的糖蛋白的糖鏈部分為 Man13~14GlcNAc2，單糖數(shù)為15-16個，其中主帶ManuGlcNAc2占主要成分，占50%以 上，重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2401表達的糖鏈為MarvuGlcNAc2，單糖數(shù)為 11-13個，其中主帶MangGlcNAc2至少占50。/Q?？梢婋S著a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶
(OfiW)基因和a-l,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(M/V7)基因的相繼滅活，糖鏈也在逐漸降 低。這證實通過0GW基因和/或iM7基因的滅活可以實現(xiàn)外源糖蛋白的低糖化，表 現(xiàn)為過度糖基化的缺失。
圖7中1為重組乳酸克魯維酵母CGMCC No. 2400表達的HSA-GM/CSF的糖鏈；2為 乳酸克魯維酵母ATCC8585表達的HSA-GM/CSF的龐大糖鏈；3為重組乳酸克魯維酵 母CGMCC No. 2401表達的HSA-GM/CSF的糖鏈，單糖數(shù)目不大于13個
(MmvuGlcNAc2) ; M,為多聚葡萄糖寡糖分子量標(biāo)準(zhǔn)，自下而上分別為3-16個葡萄 糖基(指示ll個以上單糖的大小)；M2為來自牛核糖核酸酶B Marv9GlcNAc2的分子 量標(biāo)準(zhǔn)，自下而上分別為5-9個甘露糖基帶兩個N-乙酰葡糖胺
(Man5GlcNAc2-Man9GlcNAc2);
牛核糖核酸酶B MaiV9GlcNAc2的分子量標(biāo)準(zhǔn)參考如下文獻的方法制備Wim Martinet, Protection of Mice Against a Lethal Influenza Challenge by Immunization with Yeast-Derived Recombinant Influenza Neuraminidase. European Journal of Biochemistry, 247: 332—338， 1997。序列表
〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 〈120〉一種重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
<130〉 CGGNARW81147
<160>3
<210>1
<211〉5742
〈212〉DNA
<213>克魯維酵母屬乳酸克魯維酵母a7w/rero/z^ces 2acfj'W <400>1
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aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc atcccctttg actgctggga gccagtccag 2220
gagggtggag gtcaccacca tcaccatcac taa 225權(quán)利要求
1、一種重組克魯維酵母菌，是能作為表達如下低糖基化糖蛋白的宿主的重組菌，所述低糖基化糖蛋白的50％以上的N-糖鏈上的單糖數(shù)不大于20個，較優(yōu)的是不大于16個，最優(yōu)的是不大于11個的糖蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組克魯維酵母菌，其特征在于所述重組克 魯維酵母菌，是將克魯維酵母菌中的a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因或/和a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的重組菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組克魯維酵母菌，其特征在于所述克 魯維酵母菌是乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、鷹嘴豆克魯維酵母、保加 利亞克魯維酵母、耐溫克魯維酵母或馬克思克魯維酵母菌。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組克魯維酵母菌，其特征在于所述克魯維 酵母菌為乳酸克魯維酵母菌，優(yōu)選為乳酸克魯維酵母菌ATCC8585;所述重組克魯維酵母菌為KLGE02或KLGE03，所述KLGE02的保藏號為 CGMCC No. 2400， KLGE03的保藏號為CGMCC No. 2401。
5、 一種重組載體，是能夠敲除克魯維酵母菌的甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重 組酵母表達載體，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶或a -1， 3-甘露 糖轉(zhuǎn)移酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述能夠敲除克魯維 酵母菌的甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組酵母表達載體是在酵母表達載體的多克隆 位點插入有所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游側(cè)翼同源區(qū)和下游側(cè)翼同源區(qū)的重 組酵母表達載體；當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基 因的上游側(cè)翼同源區(qū)為如下a)或b)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 下游側(cè)翼同源區(qū)為如下c)或d)的DNA片段a) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 基因的起始密碼子上游的染色體DNA序列；b) 在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA片段雜交的片段；c) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 基因的終止密碼子下游的染色體DNA序列；d) 在嚴(yán)格條件下與c)限定的DNA片段雜交的片段；當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基 因的上游側(cè)翼同源區(qū)為如下l)或2)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 下游側(cè)翼同源區(qū)為如下3)或4)的DNA片段，1) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-l,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 基因的起始密碼子上游的染色體DNA序列；2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA片段雜交的片段；3) 大小為至少200bp的DNA片段，該DNA片段選自a-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 基因的終止密碼子下游的染色體DNA序列；4) 在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA片段雜交的片段。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組載體，其特征在于 當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游側(cè)翼同源區(qū)為如下A)或B)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的 下游側(cè)翼同源區(qū)為如下C)或D)的DNA片段A) 序列表中序列1的自5'末端第121-2119位脫氧核糖核苷酸組成的DNA分子；B) 在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA片段雜交的片段；C) 序列表中序列1的自5'末端第3276-5469位脫氧核糖核苷酸組成的 DNA分子；D) 在嚴(yán)格條件下與C)限定的DNA片段雜交的片段； 當(dāng)所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶為a -1， 3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶時，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游側(cè)翼同源區(qū)為如下I )或II)的DNA片段，所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因 的下游側(cè)翼同源區(qū)為如下III)或IV)的DNA片段I) 序列表中序列2的自5'末端第102-1480位脫氧核糖核苷酸組成的 DNA分子；II) 在嚴(yán)格條件下與I )限定的DNA片段雜交的片段；III) 序列表中序2的自5'末端第3897-5436位脫氧核糖核苷酸組成的DNA 分子；IV) 在嚴(yán)格條件下與III)限定的DNA片段雜交的片段。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于所述酵母表達載體為 pYES2酵母表達載體。
9、 一種構(gòu)建權(quán)利要求l、 2、 3或4所述克魯維酵母菌的方法，是將權(quán)利要求5、 6、 7或8中任一所述重組載體導(dǎo)入克魯維酵母菌中獲得重組菌。
10、權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的克魯維酵母在生產(chǎn)外源糖蛋白中的應(yīng) 用；所述的外源糖蛋白包括細胞因子、凝血因子、免疫球蛋白、內(nèi)皮生長 因子、生長激素釋放因子、生長因子、人血管抑制素、組織纖溶酶原激活 物、纖溶酶原激活物抑制劑、尿激酶、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、血細胞凝集 素、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、HIV胞膜蛋白、腸激酶、皰疹病毒I型糖蛋白D，以及這 些蛋白的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明是將乳酸克魯維酵母菌中的α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因和/或α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到乳酸克魯維酵母菌株。本發(fā)明首先構(gòu)建重組載體，然后將重組載體導(dǎo)入克魯維酵母菌中獲得突變菌。本發(fā)明構(gòu)建的重組克魯維酵母菌有兩個特別明顯的優(yōu)點一是所敲除的酵母菌甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)80％以上缺失，不易產(chǎn)生回復(fù)突變，突變株穩(wěn)定性明顯高。二是本發(fā)明構(gòu)建的重組克魯維酵母菌表達的糖蛋白不存在過度糖基化現(xiàn)象。本發(fā)明的構(gòu)建重組克魯維酵母菌的方法，能成功高效的重組克魯維酵母，從8個克隆中即可得到4個陽性克隆，陽性率約50％。
文檔編號C12N1/19GK101285045SQ20081010223
公開日2008年10月15日 申請日期2008年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月19日
發(fā)明者波 劉, 軍 吳, 唱韶紅, 新 鞏, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所