同步檢測三種豬病毒的共有引物核酸擴增方法與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種通過鎖核酸（LNA）修飾堿基共有引物引導(dǎo)的同步快速檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒三種重要豬病原的新型核酸擴增檢測方法及其檢測試劑盒，設(shè)計篩選了一對含有LNA修飾堿基的共有引物和三對5＇端帶有共有引物堿基序列的病毒特異引物，通過優(yōu)化的反應(yīng)體系和兩步PCR擴增反應(yīng)條件，使得反應(yīng)過程中主要由LNA修飾堿基共有引物引導(dǎo)特異PCR擴增反應(yīng)，實現(xiàn)簡便、高效地同步檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒。本發(fā)明驗證了LNA修飾堿基共有引物能夠高效引導(dǎo)多重PCR擴增，為研究發(fā)明適合其他用途多重PCR體系的修飾堿基共有引物提供研究和實驗基礎(chǔ)。
【專利說明】同步檢測三種豬病毒的共有引物核酸擴增方法與試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，提供一種同步檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒三種豬病毒的新型核酸擴增檢測方法及其檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002](一)豬病原體同步快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀
[0003]豬可感染多種病原，并且豬發(fā)生多種疫病后呈現(xiàn)相似甚至臨床難于鑒別的病癥，給疾病的準(zhǔn)確診斷帶來困難。各國科學(xué)家均努力研究開發(fā)能同步檢測鑒別多種疾病病原體的方法，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為實現(xiàn)多種豬疫病同步鑒別檢測提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
[0004]在豬疫病檢測方面，國內(nèi)外已公開發(fā)表的多重檢測方法主要為二重和三重PCR方法。目前多重常規(guī)PCR或多重實時熒光PCR遇到的主要問題是多重反應(yīng)帶來的檢測靈敏度和特異性下降，這主要是由于在多重體系中多條引物、探針相互之間競爭模板、dNTP、酶等資源以及交叉反應(yīng)問題；在多重實時熒光PCR方面，儀器分辨力以及可選熒光基團的組合是制約多重?zé)晒釶CR檢測通量的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有的設(shè)備平臺和可供選用的熒光染料不能很好解決不同檢測通道熒光信號交叉干擾以及儀器對不同熒光基團分辨敏感性差異問題。上述因素限制了多重PCR技術(shù)的發(fā)展?，F(xiàn)有常規(guī)多重PCR技術(shù)是將多對引物混合在一起，然后進行多重核酸擴增，存在檢測靈敏度下降、檢測效果不理想、臨床檢驗中應(yīng)用效果不佳等不足。
[0005]近10年來，國外研究人員積極探索共有引物擴增技術(shù)研究，目前國外已發(fā)表采用共有引物的多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependentprobeampIification, MLPA),該技術(shù)的原理是設(shè)計連接探針先進行連接反應(yīng)，其中每對探針上都攜帶有一對共有引物序列，然后采用連接探針上的共有引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，最多可以對45個目標(biāo)模板分子進行定量鑒別。國外有研究采用MLPA技術(shù)可以同時檢測7種性傳播疾病、15種呼吸道疾病病原體(MuvunyiCM，2011 ；Brui jnesteijnvanCoppenraetLE, 2010)。國內(nèi)也有I篇采用類似MLPA技術(shù)同步檢測3種豬源性病毒的報道(鄭鳴等，2011)。但該技術(shù)目前還不成熟，其反應(yīng)體系較復(fù)雜、反應(yīng)步驟較多，目前檢測效果不理想，還不適合實際應(yīng)用。TEM-PCR技術(shù)是QIAgen公司的多重PCR專利技術(shù)，其技術(shù)原理也是采用特異性引物加共有引物的模式，整個反應(yīng)體系需要加入3對引物，同時檢測25種不同類型的人乳頭瘤病毒(JianHan, 2006)。但該方法在實際應(yīng)用中仍存在很大問題，主要是靈敏度不夠。上述兩種已發(fā)表方法中采用的共有引物由常規(guī)堿基組成。
`[0006]國外的研究發(fā)現(xiàn)，在寡核苷酸中加入鎖核酸(LNA)修飾堿基可顯著增強寡核苷酸與DNA模板的結(jié)合能力；含有LNA修飾堿基的寡核苷酸探針已廣泛應(yīng)用于熒光PCR反應(yīng)體系。國外研究人員已發(fā)表采用含有LNA堿基的引物進行PCR擴增的對比試驗。研究證實，在PCR擴增引物中引入LNA修飾堿基可提高常規(guī)PCR和熒光PCR擴增的效率，包括特異性和靈敏度，含有LNA修飾堿基的PCR引物其Tm值提高，PCR反應(yīng)可耐受70°C以上的退火溫度。
[0007]迄今國內(nèi)外均沒有發(fā)表采用含LNA修飾堿基的共有引物PCR方法檢測豬病原體的研究或應(yīng)用報道。
[0008](二 )、相關(guān)豬病毒病及危害
[0009]豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)。豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus, PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。PCV有PCV-1和PCV-2兩個血清型，其中PCV-1為非致病性病毒，PCV-2具有致病性。PCV-2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome, PMWS)的主要病原，PCV-2所引起的疾病是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)密切關(guān)注的重大傳染病之一。它能造成豬的生長緩慢，飼料報酬降低，同時侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體的免疫力下降，引起其他疾病的大爆發(fā)，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅和巨大的經(jīng)濟損失。PCV最早發(fā)現(xiàn)于加拿大(1991)，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發(fā)生和流行，目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛存在，現(xiàn)已被公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬免疫障礙的重要傳染病。已證實PCV-2可在豬群中垂直傳播，在自然感染和人工感染豬的精液中均已檢測到PCV-2病毒，在自然感染豬群中，能從精液中分離到PCV-2病毒的比例達50%(Gu6rin B et al，2005)，感染后5_47天可從精液中分離到PCV-2病毒，精液帶毒持續(xù)時間較長，甚至在豬體產(chǎn)生抗體后仍可從精液中分離到病毒。感染公豬可長期間歇性排放PCV-2，而豬精液是傳播PCV-2的重要途徑(Kim J et al，2001)。
[0010]豬偽狂犬病病毒(Aujeszky’sdiseasevirus，PRV)。豬偽狂犬病病毒(PRV)屬皰疹病毒科(Herpesviridae)、豬皰疹病毒屬。PRV在全世界廣泛分布。豬是PRV的貯存宿主，PRV主要通過已感染豬排毒而傳給健康豬，豬群中PRV主要通過鼻分泌物傳播，也可通過乳汁和精液傳播方式。感染PRV對15日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡率可達100%，斷奶仔豬發(fā)病率可達40%，死亡率20%左右；對成年肥豬可引起種豬不育癥、生長停滯、增重緩慢等。PRV屬皰疹病毒，在自然環(huán)境中很穩(wěn)定，在動物體內(nèi)可形成潛伏感染，病毒在豬體內(nèi)終生潛伏，在應(yīng)激條件下可階段性復(fù)蘇并排毒，導(dǎo)致偽狂犬病難于根除。從人工感染和自然感染的豬體精液中可不定期分離到PRV，豬精液中PRV病毒滴度可高達103 7-109TCID5Q/mL (Maes Det al，2008)。PRV病毒可在公豬生殖器官中復(fù)制從而導(dǎo)致精液帶毒，PRV感染豬在病毒血癥期間可排放感染白細(xì)胞到精液中。接受人工授精的母豬被PRV帶毒精液感染后發(fā)生血清陽轉(zhuǎn)和子宮病癥。
[0011]豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus，PPV)。豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PPV)引起的一種繁殖機能障礙性疾病，引起母豬繁殖障礙，全球均有發(fā)生。PPV對熱穩(wěn)定性強。各年齡段的家豬和野豬均易感。傳染源主要來自感染母豬和帶毒公豬，病毒能通過胎盤垂直傳播，感染母豬所產(chǎn)的死胎、仔豬及子宮內(nèi)的排泄物中均含有很高滴度的病毒，帶毒豬所產(chǎn)的活豬可能帶毒排毒時間很長甚至終生。感染種公豬也是該病最危險的傳染源，可在公豬的精液、精索、附睪、性腺中分離到病毒(Gradil C et al,1990 ；Thacker B J et al，1987)。種公豬通過配種傳染給易感母豬，并使該病傳播擴散。懷孕母豬出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊、產(chǎn)后 久配不孕等。
[0012]上述三種豬病毒是引起豬繁殖障礙疾病的重要病原，所引起的疫病在養(yǎng)豬業(yè)常見多發(fā)、防治難度大，臨床已發(fā)現(xiàn)2種甚至3種豬病毒混合感染的情況，在養(yǎng)豬業(yè)已造成嚴(yán)重危害。[0013]研究開發(fā)同步檢測上述多種豬病原體的方法，不但有助于生豬養(yǎng)殖過程中的疫病防控，對于豬精液等遺傳物質(zhì)的安全質(zhì)量把關(guān)也具有重要的實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于提供一組用于同步檢測鑒別豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)的新型核酸擴增方法中使用的引物及其核酸；本發(fā)明的另一目的在于提供了一種基于修飾堿基共有引物的新型核酸擴增同步檢測PCV-2、PRV和PPV三種豬病毒的方法。
[0015]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0016]一組用于同步檢測鑒別豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)的新型核酸擴增方法使用的引物，其組成為:
[0017]含修飾堿基的共有引物對，其共有引物對的核苷酸序列分別如序列表SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，其中引物SEQ ID N0.1距Y端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基；
[0018]檢測PCV-2病毒特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4 所示；
[0019]檢測PRV病毒特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.6 和 SEQ ID N0.7 所示；
[0020]檢測PPV病毒特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.9 和 SEQ ID N0.10 所示。
`[0021]一組用于檢測及鑒別PCV-2、PRV和PPV的新型核酸擴增方法中使用的核酸，該組核酸包括:
[0022]核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的共有引物序列；
[0023]核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示檢測PCV-2病毒的序列和作為陽性對照含有PCV-2病毒陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.5所示的序列；
[0024]核苷酸序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示檢測PRV病毒的序列和作為陽性對照含有PRV病毒陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.8所示的序列；
[0025]核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示檢測PPV病毒的序列和作為陽性對照含有PPV病毒陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.11所示的序列。
[0026]一種同步檢測PCV-2、PRV和PPV三種豬病毒的新型核酸擴增非診斷性方法，該方法包括以下步驟:
[0027](I)從樣品中提取病毒核酸；
[0028]( 2 )對提取的核酸進行PCR擴增，其中
[0029]PCR擴增反應(yīng)體系采用40 μ L體系:
[0030]共有引物序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，其中引物SEQ ID N0.1距5 '端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基，終濃度各為250nmol/L ；
[0031]檢測豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，其終濃度各為12.5nmol/L ；[0032]檢測豬偽狂犬病病毒的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，其終濃度各為2.5nmol/L ；
[0033]檢測豬細(xì)小病毒的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示，其引物終濃度各為2.5nmol/L ；
[0034]Mg2+ 終濃度 1.5mmol/L ；
[0035]dNTP 終濃度 200 μ mol/L ；
[0036]PCR 緩沖液； [0037]Taq 聚合酶用量 l_2unit ;
[0038]模板1-5 μ L，用滅菌雙蒸水補足總體積為40 μ L ;
[0039]PCR擴增反應(yīng)條件:
[0040]94°C預(yù)變性2分鐘；第一步循環(huán)反應(yīng):94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行10個循環(huán)；接著進行第二步循環(huán)反應(yīng):94°C變性20秒，70°C退火10秒，72°C延伸30秒，共進行30個循環(huán)；最后72°C延伸I分鐘；
[0041](3)對擴增產(chǎn)物進行電泳:陰性對照為滅菌生理鹽水；陽性對照為分別攜帶有如序列表 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.11 所示序列的 DNA ；
[0042](4)分析、判定結(jié)果:樣品的擴增條帶與陽性對照的擴增條帶位置一致，且陰性對照無相應(yīng)的擴增條帶，則樣品為陽性。
[0043]本發(fā)明方法結(jié)果的具體判定:本發(fā)明方法PCV-2擴增產(chǎn)物分子量382bp，PRV擴增產(chǎn)物分子量235bp，PPV擴增產(chǎn)物分子量529bp ;擴增反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物按常規(guī)進行電泳，若電泳出現(xiàn)上述I到3條分子量符合的電泳條帶，則判定為相應(yīng)I到3種病毒檢測陽性(詳列如下)，若未出現(xiàn)分子量符合的電泳條帶，則判定為上述三種病毒檢測陰性。
[0044]電泳出現(xiàn)382bp條帶，判為PCV-2核酸檢測陽性；
[0045]電泳出現(xiàn)235bp條帶，判為PRV核酸檢測陽性；
[0046]電泳出現(xiàn)529bp條帶，判為PPV核酸檢測陽性；
[0047]電泳同時出現(xiàn)382bp、235bp條帶，判為PCV-2和PRV核酸檢測陽性，顯示兩種病毒混合感染；
[0048]電泳同時出現(xiàn)382bp、529bp條帶，判為PCV-2和PPV核酸檢測陽性，顯示兩種病毒
混合感染；
[0049]電泳同時出現(xiàn)235bp、529bp條帶，判為PRV和PPV核酸檢測陽性，顯示兩種病毒混
合感染；
[0050]電泳同時出現(xiàn)382bp、235bp和529bp條帶，判為PCV_2、PRV和PPV核酸檢測陽性，
顯示三種病毒混合感染。
[0051]為進一步確證檢測結(jié)果，可對擴增產(chǎn)物進行核酸序列測定，將測得的核酸序列與已知病毒核酸序列進行同源性比對，序列吻合的確證為相應(yīng)病毒核酸檢測陽性。
[0052]本發(fā)明的另一方面還提供一種基于修飾堿基共有引物的同步檢測鑒別PCV_2、PRV和PPV三種豬病毒的非診斷性試劑盒，所述試劑盒包括:
[0053]PCR 緩沖液；
[0054]共有引物對，核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，引物SEQ ID N0.1距5 ^端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基；
[0055]檢測PCV-2病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；
[0056]檢測PRV病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示；
[0057]檢測PPV病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示；
[0058]dNTP ；
[0059]MgCl2 ；
[0060]Taq DNA 聚合酶；
[0061]滅菌雙蒸水；
[0062]陰性對照:滅菌生理鹽水；
[0063]陽性對照:攜帶有擴增產(chǎn)物序列的DNA，所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.11 所示。
[0064]本發(fā)明通過在反應(yīng)體系中引入鎖核酸(LNA)修飾堿基共有引物，提供了一種同步檢測PCV-2、PRV和PPV三種豬病毒的新型三重核酸擴增檢測方法及試劑盒。本發(fā)明設(shè)計了共有引物與5 ^端加有共有引物常規(guī)堿基序列的特異引物，共有引物為與NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中各種已知動植物及微生物核酸序列無同源性的引物，共有引物合成時采用LNA修飾堿基；加有共有引物 常規(guī)堿基序列的特異引物為病毒特異引物5 '端加共有引物常規(guī)堿基序列作為特異性擴增的特異引物。在反應(yīng)體系中，加入微量的病毒特異引物和常規(guī)用量的LNA修飾堿基共有引物，采用兩個階段(兩步)的循環(huán)擴增反應(yīng)策略，在擴增反應(yīng)第一階段(第一步)，采用較低的退火溫度和較少的循環(huán)數(shù)，使特異引物能夠參與擴增反應(yīng)引導(dǎo)產(chǎn)生少量5丨端含共有引物序列的特異擴增產(chǎn)物模板；在擴增反應(yīng)第二階段(第二步)，引物濃度優(yōu)勢和提高的退火溫度確保LNA修飾堿基共有引物發(fā)揮主導(dǎo)作用，由LNA修飾堿基共有引物引導(dǎo)病毒特異擴增產(chǎn)物的生成。
[0065]本發(fā)明成功研究了能夠引導(dǎo)多重擴增的一對LNA修飾堿基共有引物。采用本發(fā)明方法及檢測試劑盒，能夠從含三種病毒的混合樣品中成功檢測到三種特異擴增產(chǎn)物。本發(fā)明由于大大減少了多條病毒特異引物的用量(比常規(guī)用量減少20-100倍)，還達到降低檢測成本的目的。采用共有引物可有效降低甚至避免多重PCR反應(yīng)體系中多條特異擴增引物相互競爭干擾造成的非特異性反應(yīng)和靈敏度下降問題。本發(fā)明的方法檢測PCV-2的最低檢出限可達225fg，檢測PRV的最低檢出限可達255fg，檢測PPV的最低檢出限可達87fg，檢測靈敏度高；對17種非PCV-2、PRV、PPV的樣本檢測均無特異性擴增，特異性強。本發(fā)明方法的又一個特點是，操作簡便，除在反應(yīng)體系中加入LNA修飾堿基共有引物這點差別外，其實驗操作與常規(guī)PCR完全相同，可采用市售的各種常規(guī)PCR基礎(chǔ)試劑組成反應(yīng)體系，擴增反應(yīng)可在常規(guī)PCR擴增儀上進行，檢測結(jié)果通過常規(guī)電泳檢測進行判斷，還可通過核酸序列分析進行確證。
[0066]本發(fā)明首次研究成功適用于常規(guī)多重核酸擴增的LNA修飾堿基共有引物，證實可通過采用一對LNA修飾堿基共有引物實現(xiàn)多重核酸擴增，為進一步改進當(dāng)前普遍采用的完全依賴多條特異引物的多重PCR技術(shù)提供了一種新方法、新思路，具有重要的實用價值，并具體體現(xiàn)在提供了一種高效的同步檢測鑒別PCV-2、PRV和PPV三種豬病毒的新型核酸擴增方法及試劑盒。
[0067]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供一種通過LNA修飾堿基共有引物引導(dǎo)的同步快速檢測三種重要豬病原的新型核酸擴增檢測方法和檢測試劑盒，適合應(yīng)用于臨床，實現(xiàn)簡便、高效和快速檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒具有較強的特異性和高靈敏度。本發(fā)明的試劑盒不僅可以實現(xiàn)同步檢測三種豬病毒，也可用于單獨檢測一種病毒或用于兩種病毒的同時檢測，檢測試劑盒可針對不同的檢測項目靈活應(yīng)用，從而有效節(jié)約試劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1為本發(fā)明LNA共有引物擴增反應(yīng)檢測結(jié)果。
[0069]圖2為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果。
[0070]圖3為本發(fā)明對三種病毒核酸混合模板的敏感性試驗檢測結(jié)果。
[0071]圖4為本發(fā)明對人工添加病毒的豬精液樣品的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0072]本發(fā)明采用修飾堿基共有引物多重核酸擴增技術(shù)，其原理與共有引物的多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)和 TEM-PCR均不同:本發(fā)明建立的鎖核酸(LNA)修飾堿基共有引物多重PCR反應(yīng)體系中包括I對含有修飾堿基的共有引物和三對病原體特異性引物，病原體特異引物5 '端人工加上共有引物序列。反應(yīng)體系中加入的特異性引物的濃度比共有引物濃度低，并且共有引物含有修飾堿基使得Tm值提高，使PCR反應(yīng)可耐受70°C以上的退火溫度；在PCR的早期，特異性引物參與引導(dǎo)擴增，隨著PCR循環(huán)的進行，特異性引物由于濃度和Tm值較低處于競爭劣勢，擴增反應(yīng)主要由共有引物引導(dǎo)進行，通過提高退火溫度可進一步保障共有引物的主導(dǎo)作用，從而有效減少甚至避免常規(guī)多重PCR擴增體系中多對特異性引物競爭引起的靈敏度和特異性下降問題，達到改善檢測效果的目的。
[0073](一)引物的設(shè)計`
[0074]本發(fā)明根據(jù)如下原理對共有引物進行設(shè)計:引物的長度在20_25bp之間；引物退火溫度的Tm值一般控制在58-65°C，上下游引物的Tm值基本一致；引物中的G+C含量控制在50%-60% ;引物中四種堿基最好是隨機分布的，不存在多聚嘌呤或多聚嘧啶，尤其在引物的3 '端不應(yīng)超過2個連續(xù)的G或C ;引物自身不存在連續(xù)4個堿基以上的互補序列；上下游引物之間盡量不存在互補序列；上下游引物與已知的各種動植物及微生物序列無同源性。根據(jù)以上設(shè)計原則，采用軟件自動生成多段DNA序列，然后利用DNAMAN V6.0軟件對引物的Tm值、引物自身及引物之間的互補性進行分析，然后根據(jù)上述引物設(shè)定原則選出最適的引物對，然后再將引物對通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，為了避免在檢測臨床樣品時產(chǎn)生非特異性，篩選出與NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中各種已知動植物及微生物核酸序列無同源性的引物對作為最適引物對。在篩選出的最適引物對的基礎(chǔ)上，對引物5 '端的其中三個堿基G或C采用LNA修飾堿基，合成的引物采用HPLC純化。篩選出的共有引物序列如SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2所示，引物SEQ ID N0.1距5 '端第4、8、11位的堿基采用LNA修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距Y端第4、7、10位的堿基采用LNA修飾堿基(序列見下表，表中帶方框堿基為LNA修飾)。
[0075]根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)基因CAP的核酸序列，選擇參考序列(GeneBankN0.JQ181589.1);根據(jù)豬偽狂犬病病毒(PRV)基因gD的核酸序列，選擇參考序列(GeneBankN0.KC981239.1);根據(jù)豬細(xì)小病毒(PPV)基因NSl的核酸序列，選擇參考序列(GeneBankN0.KF742500.1);根據(jù)引物的退火溫度在59 °C左右，采用DNAMAN V6.0軟件，分別設(shè)計出PCV-2、PRV、PPV特異的多條引物序列，然后分別進行實驗室檢測試驗，根據(jù)檢測試驗結(jié)果篩選確定以下序列:如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示的PCV-2特異的引物對，PCR產(chǎn)物SEQIDN0.5長度為382bp ;序列如SEQIDN0.6、SEQIDN0.7所示的PRV特異的引物對，PCR產(chǎn)物SEQIDN ο.8長度為235bp ;序列如SEQIDN0.9、SEQIDN0.10所示的PPV特異的引物對，PCR產(chǎn)物SEQIDN0.11長度為529bp，本發(fā)明中的擴增產(chǎn)物通過采用特異性引物對病毒基因組核酸進行擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序，然后與理論推導(dǎo)出來的序列進行比較，根據(jù)病毒特異序列加上兩端共有引物序列后可推導(dǎo)出本發(fā)明中的擴增產(chǎn)物序列，與測序的結(jié)果一致。
[0076]引物委托英濰捷基北京有限公司合成，PAGE純化。
[0077]序列如下表:
[0078]`
【權(quán)利要求】
1.一組用于同步檢測鑒別豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)的新型核酸擴增方法使用的引物，其特征在于，其組成為: 含修飾堿基的共有引物對，共有引物對的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示，其中引物SEQ ID N0.1距V端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基； 檢測豬圓環(huán)病毒2型特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4 所示； 檢測豬偽狂犬病病毒特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.6 和 SEQ ID N0.7 所示； 檢測豬細(xì)小病毒特異的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDN0.9 和 SEQ ID N0.10 所示。
2.一組用于檢測及鑒別豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒的新型核酸擴增方法中使用的核酸，其特征在于，該組核酸包括: 核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的共有引物序列； 核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示檢測豬圓環(huán)病毒2型的序列和作為陽性對照含有豬圓環(huán)病毒2型陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.5所示的序列； 核苷酸序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示檢測豬偽狂犬病病毒的序列和作為陽性對照含有豬偽狂犬 病病毒陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.8所示的序列； 核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示檢測豬細(xì)小病毒的序列和作為陽性對照含有豬細(xì)小病毒陽性擴增產(chǎn)物如SEQ ID N0.11所示的序列。
3.一種同步檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒三種豬病毒的新型核酸擴增非診斷性方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)從樣品中提取病毒核酸； (2)對提取的核酸進行PCR擴增，其中 PCR擴增反應(yīng)體系采用40 μ L體系: 共有引物序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，其中引物SEQ ID N0.1距5 '端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基，終濃度各為250nmol/L ； 檢測豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，其終濃度各為12.5nmol/L ； 檢測豬偽狂犬病病毒的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，其終濃度各為2.5nmol/L ； 檢測豬細(xì)小病毒的特異性引物，上下游序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示，其引物終濃度各為2.5nmol/L ；
Mg2+ 終濃度 1.5mmol/L ；
dNTP 終濃度 200 μ mol/L ； PCR緩沖液； Taq聚合酶用量l_2unit ； 模板1-5 μ L，用滅菌雙蒸水補足總體積為40 μ L ;PCR擴增反應(yīng)條件: 94°C預(yù)變性2分鐘；第一步循環(huán)反應(yīng):94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行10個循環(huán)；接著進行第二步循環(huán)反應(yīng):94°C變性20秒，70°C退火10秒，72°C延伸30秒，共進行30個循環(huán)；最后72°C延伸I分鐘； (3)對擴增產(chǎn)物進行電泳:陰性對照為滅菌生理鹽水；陽性對照為分別攜帶有如序列表 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.11 所示序列的 DNA ； (4)分析、判定結(jié)果:樣品的擴增條帶與陽性對照的擴增條帶位置一致，且陰性對照無相應(yīng)的擴增條帶，則樣品為陽性。
4.一種同步檢測及鑒別豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒三種豬病毒的新型核酸擴增非診斷性試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: PCR緩沖液； 共有引物對，核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，引物SEQ IDN0.1距5 '端第4、8、11位的堿基為鎖核酸修飾堿基、引物SEQ ID N0.2距5 ^端第4、7、10位的堿基為鎖核酸修飾堿基； 檢測豬圓環(huán)病毒2型的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示； 檢測豬偽狂犬病病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示； 檢測豬細(xì)小病 毒 的引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示； dNTP ；
MgCl2 ； Taq DNA聚合酶； 滅菌雙蒸水； 陰性對照:滅菌生理鹽水； 陽性對照:攜帶有擴增產(chǎn)物序列的DNA，所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.11 所示。
【文檔編號】C12Q1/70GK103757137SQ201410029934
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】陳茹, 高小博, 宋長緒, 薛春宜, 于曉璐, 段燕喻, 李艷, 劉志玲, 陳芳 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心