專利名稱：運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說(shuō)是運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157 :H7的的試劑及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸埃希菌0157 :H7屬于腸桿菌科埃希菌屬，是腸出血性大腸埃希菌的主要血清型，能引起的出血性結(jié)腸炎。1982年在美國(guó)俄勒崗州和密執(zhí)安州，因食用漢堡包引起的食物中毒的病人糞便中被分離并命名的。據(jù)美國(guó)疾病控制中心(CDC)報(bào)告，每年全國(guó)約發(fā)現(xiàn)2萬(wàn)多例病人。死亡人數(shù)200-500人，以后陸續(xù)在全球五大州20多個(gè)國(guó)家被發(fā)現(xiàn)或引起暴發(fā)和流行。自82年發(fā)現(xiàn)至今，發(fā)生規(guī)模最大的一次爆發(fā)是97年5月下旬，日本岡山、廣島等縣幾十所中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生6起集體食物中毒事件，人數(shù)多達(dá)1600人，導(dǎo)致3名兒童死亡，住院兒童達(dá)80人。同時(shí)日本仙臺(tái)和鹿兒島形成中毒人數(shù)過(guò)萬(wàn)人，死亡11 人，波及44個(gè)都府縣的爆發(fā)性食物中毒，引起全世界的關(guān)注。此外美國(guó)、加拿大、瑞典、澳大利亞、蘇格蘭、威爾士等國(guó)家和地區(qū)也相繼報(bào)道了散發(fā)性感染和暴發(fā)流行。我國(guó)1988年首次分離到腸出血性大腸埃希菌0157:H7。從已有的流行病學(xué)調(diào)查資料看，我國(guó)也存在散發(fā)病例，還沒(méi)有爆發(fā)流行的報(bào)道。近幾年也通過(guò)監(jiān)測(cè)，先后從牛、豬、羊、糞便，肉類等食品中查到腸出血性大腸埃希菌0157:H7?？焖?、準(zhǔn)確的檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157:H7是有效預(yù)防和控制腸桿菌感染的前提條件。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，實(shí)際工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單生化實(shí)驗(yàn)水平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)發(fā)展。近期開(kāi)發(fā)出來(lái)的交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種更為高效的分子檢測(cè)方法，已經(jīng)被很多國(guó)家認(rèn)同，并大力發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)腸出血性大腸埃希菌0157:H7，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種快速、便捷、低成本的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157 :H7的的試劑及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑，包括以下五個(gè)引物
SEQ ID NO. 1 :5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG SEQ ID NO. 2:5’ TCAGCAGTCATTACATAAG SEQ ID NO. 3:5’ GCTCTTGCCACAGACTGCGTC SEQ ID NO. 4 5' AGGTTCCGCTATGCGACAT
SEQ ID NO. 5 5' GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT 其中引物序列3的5’端有異硫氰酸熒光素基團(tuán)標(biāo)記，引物序列4的5’端有生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)標(biāo)記。
核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
Bst Sl5U/u L1 u L
Bst酶緩沖液-5 ii L
SEQ ID NO. 1 10umol/L1 u L
SEQ ID NO. 2 lOumol/L1 u L
SEQ ID NO. 3 lOumol/L0. 5 u L
SEQ ID NO. 4 lOumol/L0. 5 u L
SEQ ID NO. 5 lOumol/L0. 2 u L
DNA 樣品2iiL
雙蒸水13. 8iiL
總體積25 ii L
其中 Bst 酶緩沖液的成分為 20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl,2 mM MgSO4、質(zhì)量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 為 8. 8。所述的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑的擴(kuò)增 方法，核酸擴(kuò)增程序?yàn)?br> (1)63°C 90 分鐘；
(2)80°C2 分鐘。所述的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑的檢測(cè) 方法，將反應(yīng)液滴至能夠檢測(cè)異硫氰酸熒光素基團(tuán)和生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)同時(shí)標(biāo)記的核酸樣品 的膠體金檢測(cè)試紙上，在15-30分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，如果僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)一條紅線，表示樣 品中無(wú)腸出血性大腸埃希菌0157:H7 ；如果出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線，表示 樣品中存在腸出血性大腸埃希菌0157:H7 ；如果無(wú)紅線出現(xiàn)。表明檢測(cè)失敗，樣品需要重新 檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法，交叉引物核 酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)適用于直接從患者含菌體液、糞便，食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增 靶基因，只需要一次恒溫?cái)U(kuò)增就能夠檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157:H7是否存在，大大提 高了效率節(jié)約了時(shí)間。相比較其它方法，本方法制僅需要簡(jiǎn)單的設(shè)備即可，大大提高了性價(jià) 比節(jié)約了成本。該技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157:H7具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度 高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；該方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌 生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。


圖1是本發(fā)明結(jié)果判讀示意圖。圖2是本發(fā)明運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157:H7 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(檢測(cè)條1.腸炎腸出血性大腸埃希菌0157:H7 CIQ103檢測(cè)結(jié)果；檢測(cè)條2.腸 炎腸出血性大腸埃希菌0157:H7 CIQ109檢測(cè)結(jié)果；檢測(cè)條3.腸炎腸出血性大腸埃希菌 0157:H7 CIQ79檢測(cè)結(jié)果；檢測(cè)條4.志賀氏菌ATCC12022檢測(cè)結(jié)果；檢測(cè)條5.空白對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)；
(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增； (4)擴(kuò)增完畢后可通過(guò)特定的膠體金檢測(cè)試紙條目測(cè)結(jié)果。該方法包括應(yīng)用該方法檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌0157:H7所使用的引物組和與之配套的核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件。其中引物序列如下
SEQ ID NO. 1 :5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG ‘TCAGCAGTCATTACATAAG ‘GCTCTTGCCACAGACTGCGTC AGGTTCCGCTATGCGACAT
GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT 其中引物序列3的5’端有異硫氰酸熒光素基團(tuán)標(biāo)記。引物序列4的5’端有生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)標(biāo)記。該引物為和腸出血性大腸埃希菌致病性密切相關(guān)的志賀樣腸毒素A亞基基因中(shiga-like toxin 1 subunit Α)挑選設(shè)計(jì)的，參考序列為 GenBank AE005174. 2 Escherichia coli partial stxl gene for shiga toxin 1, strain EHEC FE94076,檢測(cè)基因區(qū)域?yàn)?996033 2996980。優(yōu)選的本發(fā)明中熒光PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
SEQIDNO. 2 5'
SEQIDN0. 3 5'
SEQIDN0. 4 5'
SEQIDN0. 5 5'
成分濃度加樣量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶緩沖液-5 μ LSEQIDN0.110 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.210 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.310 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.410 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.510 μ mol/0. 2μ L
2μ L 13. 8μ L 25 μ L
10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl、2 mM
DNA樣品雙蒸水總體積
其中Bst酶緩沖液的成分為20 mM Tris-HCl MgSO4、質(zhì)量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 為 8. 8。核酸擴(kuò)增程序?yàn)?br> (1)63°C 90 分鐘；
(2)80°C2 分鐘。如圖1、2所示，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)能夠檢測(cè)核酸擴(kuò)增標(biāo)志物的膠體金檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，判定方法如下將反應(yīng)液滴至能夠檢測(cè)異硫氰酸熒光素基團(tuán)和生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)同時(shí)標(biāo)記的核酸樣品的膠體金檢測(cè)試紙上，在15-30分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，如僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)一條紅線，表示樣品中無(wú)腸出血性大腸埃希菌0157:H7，如果出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線，表示樣品中存在腸出血性大腸埃希菌0157:H7。如果無(wú)紅線出現(xiàn)，表明檢測(cè)失敗， 樣品需要重新檢測(cè)。 實(shí)施例1
樣本某糞便樣本。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出腸出血性大腸埃希菌0157:H7疑似菌落，然后進(jìn)行如下交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)
(1)取0. 1克待檢樣品用1克生理鹽水懸浮。(2)取1克樣品進(jìn)行核酸抽提。(3)交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分 Bst酶
Bst酶緩沖液
濃度加樣量
5U/ μ L1 μ L
-5 μ L
1 μ L 1 μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 0. 2μ L 2μ L 13. 8μ L 25 μ L
,10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl、2 mM
10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L
SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5 DNA樣品雙蒸水總體積
其中Bst酶緩沖液的成分為20 mM Tris-HCl、 MgSO4、質(zhì)量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 為 8. 8。核酸擴(kuò)增程序?yàn)?br> 630C 90 分鐘；80°C 2 分鐘。共進(jìn)行3管實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為腸出血性大腸埃希菌 0157:H7DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品；本待測(cè)樣品DNA ；無(wú)DNA的陰性對(duì)照。(4)結(jié)果觀察
將反應(yīng)液滴至能夠檢測(cè)異硫氰酸熒光素基團(tuán)和生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)同時(shí)標(biāo)記的核酸樣品的膠體金檢測(cè)試紙上，在20分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，腸出血性大腸埃希菌0157:H7DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品和本待測(cè)樣品DNA出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線；無(wú)DNA的陰性對(duì)照僅在質(zhì)控區(qū) C出現(xiàn)一條紅線。綜合以上結(jié)果，表示待測(cè)樣品中存在腸出血性大腸埃希菌0157:H7。3天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為腸出血性大腸埃希菌0157:H7。交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)施例2 樣本某豬肉糜。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出腸出血性大腸埃希菌0157:H7疑似菌落，然后進(jìn)行如下交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) (1)取100克待檢樣品，粉碎。 (2)取1克樣品進(jìn)行核酸抽提。 (3)交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增成分 Bst酶
Bst酶緩沖液 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5 DNA樣品雙蒸水總體積
10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L 10 μ mol/L
濃度 5υ/μ L
1 μ L 5 μ L 1 μ L 1 μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 0. 2μ L 2μ L
加樣量
13. 8μ L 25 μ L
其中 Bst 酶緩沖液的成分為 20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl,2 mM MgSO4、質(zhì)量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 為 8. 8。核酸擴(kuò)增程序?yàn)?br> 630C 90 分鐘；80°C 2 分鐘。共進(jìn)行3管實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為腸出血性大腸埃希菌 0157:H7DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品；本待測(cè)樣品DNA ；無(wú)DNA的陰性對(duì)照。(4)結(jié)果觀察
將反應(yīng)液滴至能夠檢測(cè)異硫氰酸熒光素基團(tuán)和生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)同時(shí)標(biāo)記的核酸樣品的膠體金檢測(cè)試紙上，在20分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，腸出血性大腸埃希菌0157:H7DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品和本待測(cè)樣品DNA出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線；無(wú)DNA的陰性對(duì)照僅在質(zhì)控區(qū) C出現(xiàn)一條紅線。綜合以上結(jié)果，表示待測(cè)樣品中存在腸出血性大腸埃希菌0157:H7。3天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為腸出血性大腸埃希菌0157:H7。交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致。以上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑，其特征在于，包括以下五個(gè)引物SEQ ID NO. 1 :5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG TCAGCAGTCATTACATAAG GCTCTTGCCACAGACTGCGTC AGGTTCCGCTATGCGACATGCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT 其中引物序列3的5’端有異硫氰酸熒光素基團(tuán)標(biāo)記，引物序列4的5’端有生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑，其特征在于，核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下SEQIDNO. 2 5'SEQIDNO. 3 5'SEQIDNO. 4 5'SEQIDNO. 5 5'成分濃度加樣量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶緩沖液-5 μ LSEQIDN0.110 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.210 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.310 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.410 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.510 μ mol/0. 2μ L2μ L 13. 8μ L 25 μ L10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl、2 mMDNA樣品雙蒸水總體積其中Bst酶緩沖液的成分為20 mM Tris-HCl MgSO4、質(zhì)量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 為 8. 8。
3.—種權(quán)利要求1所述的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑的擴(kuò)增方法，其特征在于，核酸擴(kuò)增程序?yàn)?1)63°C90 分鐘；(2)80°C2 分鐘。
4.一種權(quán)利要求1所述的運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑的檢測(cè)方法，其特征在于，將反應(yīng)液滴至能夠檢測(cè)異硫氰酸熒光素基團(tuán)和生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)同時(shí)標(biāo)記的核酸樣品的膠體金檢測(cè)試紙上，在15-30分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，如果僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)一條紅線，表示樣品中無(wú)腸出血性大腸埃希菌0157:H7 ；如果出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線，表示樣品中存在腸出血性大腸埃希菌0157:H7 ；如果無(wú)紅線出現(xiàn)， 表明檢測(cè)失敗，樣品需要重新檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的試劑及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了五個(gè)引物組序列，5’CAGTCGTACGGGGATGCAG；5’TCAGCAGTCATTACATAAG；5’GCTCTTGCCACAGACTGCGTC；5' AGGTTCCGCTATGCGACAT；5'GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT。針對(duì)腸出血性大腸埃希菌O157H7菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速低成本的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102363816SQ20111038276
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者劉啟軍, 劉寅, 劉振宇, 劉智勇, 吳汀瀅, 尤其敏, 崔景柏, 左鋒, 張霞, 徐高連, 楊春江, 柴宏森, 王宏瑩, 王馨, 祁軍, 詹曦菁, 高秋萍 申請(qǐng)人:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司